沃頓膠消化液的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于干細胞制備技術領域，具體涉及一種沃頓膠消化液。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)可在體內或體外特定的誘導條件下，分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，且在連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。間充質干細胞根據存在組織的不通，主要包括骨髓間充質干細胞、月旨肪間充質干細胞和臍帶間充質干細胞。其中，臍帶間充質干細胞由于采自醫療廢棄物新生兒臍帶，相比骨髓間充質干細胞其具有來源豐富、成本低、對捐獻者無損害等優勢，具有更加廣闊的前景。
[0003]臍帶間充質干細胞大量存在于臍帶沃頓膠(Wharton膠，或者又稱華爾通膠)和血管周圍組織中，具有自我更新、增殖和多向分化潛能。而其中由于沃頓膠的成分主要是膠原、透明質酸、硫酸軟骨素(膠原占干重50%以上，以1、I1、III型膠原為主，還有V型等膠原，占總膠原的95%以上；透明質酸、硫酸軟骨素等糖胺多糖占臍帶沃頓膠的近50% )，能更加利于臍帶間充質干細胞的分離，因此目前臍帶間充質干細胞多從沃頓膠中進行分離制備，而采用的方法一般為組織塊貼壁法和酶消化法。其中，組織塊貼壁法是將臍帶組織切成小塊，用間質細胞完全培養基在一定條件(5% CO2、37°C、飽和濕度)的培養箱中培養，5?7d后將貼壁生長的長梭形細胞從組織中消化分離，再過5?7d后即獲得臍帶間充質干細胞。由于這一方法時間長，獲取率和活性均不高，所以現有方式中多采用酶消化法進行。
[0004]現通常的酶消化法是將切成小塊的臍帶組織用含膠原酶和胰蛋白酶的消化液消化30min?16h。消化液中的胰蛋白酶是通過離解細胞間的粘蛋白、糖蛋白而影響細胞骨架從而使細胞分離，對細胞間質的蛋白成分及細胞膜蛋白均有很強的破壞作用，因此造成分離到的干細胞受到損傷導致活性不佳，難以擴增出理想數目和活性的間充質干細胞。

【發明內容】

[0005]本發明實施的目的在于克服上述從沃頓膠分離制備臍帶間充質干細胞的不足，提供一種能夠在制備過程中對干細胞損傷性更低、產率和細胞品質更高的沃頓膠消化液。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下:
[0007]一種沃頓膠消化液，包括透明質酸酶和硫酸軟骨素ABC酶。
[0008]采用本發明的上述沃頓膠消化液，相比現有沃頓膠酶消化中采用的膠原酶和胰蛋白酶，特異性轉變為針對沃頓膠中的硫酸軟骨素和透明質酸進行酶解，破壞細胞之間的穩定粘合而進行分離，可以提升獲取率；同時在聯合消化沃頓膠的過程中避免了胰酶和膠原酶長期消化對臍帶間充質干細胞自身膜蛋白的影響，不會額外的造成干細胞的胞膜損傷，處理之后分離得到的干細胞具有更加優良的增殖活性和分化能力。
【具體實施方式】
[0009]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0010]本發明實例提供一種用于酶消化法從沃頓膠制備臍帶間充質干細胞的沃頓膠消化液，相比現有由膠原酶和胰蛋白酶組成的消化液，本發明的消化液包括透明質酸酶和硫酸軟骨素ABC酶。
[0011]相比現有沃頓膠酶消化液中采用的膠原酶和胰蛋白酶，本發明消化液中硫酸軟骨素ABC酶是特異性降解硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B和硫酸軟骨素C的酶類，作用機理是通過β消除機理作用于二糖重復單元之間的β 1-4糖苷鍵上并將其切斷，生成寡糖(主要是不飽和二糖)。同時，沃頓膠細胞的間質中，大量存在的透明質酸是組織基質中具有限制水分及其它細胞外物質擴散作用的功能成分，也是細胞生長和形成組織結構的基質成分；因此本發明在消化液中添加透明質酸酶對透明質酸的專一性水解，水解之后首先可以破壞細胞之間的穩定粘合而利于分離，并且在水解的過程中能暫時降低細胞間質的粘性加強胞外物質的擴散和結合、以及吸收，能進一步協同增加硫酸軟骨素ABC酶的擴散和結合，提升沃頓膠細胞間成分的降解的效率。并且，其中采用的一個酶活單位的硫酸軟骨素ABC酶在pH 6.0和37°C條件下lmin可以從硫酸軟骨素A催化產生1.0μmOl 2-乙酰氨基-2-脫氧-3-0- ( β -D-吡喃葡萄糖醛酸-4-烯)-4-0-硫酸-D-半乳糖(Λ Di_4S)或從硫酸軟骨素C催化產生1.0 μ mo I 2-乙酰氨基-2-脫氧-3-0- ( β -D-吡喃葡萄糖醛酸_4_烯)-6-0-硫酸-D-半乳糖(AD1-es)，這個降解的效率是明顯高于膠原蛋白類的降解的，能大大提升消化液的消化效率。
[0012]同時，由于上述兩種酶類本身具有僅對特異性底物水解的單一性，聯合消化沃頓膠的過程中可克服胰酶和膠原酶長期消化對臍帶間充質干細胞的影響，不會額外的造成干細胞的胞膜損傷，處理之后分離得到的間充質干細胞具有更加優良的增殖活性和分化能力。
[0013]進一步在本發明的上述消化液實施中，為了使消化過程中胞間質和酶進行相繼結合并同時消化，提升消化效率，消化液中透明質酸酶和硫酸軟骨素ABC酶的質量/酶活比為0.05?2mg/U (購買的透明質酸酶是質量計，而硫酸軟骨素ABC酶是按照活力單位U計)。在該量比范圍下，酶降解的效率基本和細胞間質中成分的比例相當，避免比例不平衡產生產物抑制而降低效率。當然，根據透明質酸、硫酸軟骨素等糖胺多糖占臍帶沃頓膠的近50%的成分特點，透明質酸酶和硫酸軟骨素ABC酶最優的質量/酶活比可以采用0.lmg/Uo
[0014]同時，由于沃頓膠用消化液進行消化的過程中，大多數干細胞自身存在適宜生長的PH范圍為7.2?7.4，通常低于pH6.8或者高于pH7.6可能對干細胞有害，同時造成消化分離得到的干細胞胞膜或者胞內代謝不正常，并且還會抑制或者降低得到的干細胞的活性。更重要地，上述消化液中的主要活性成分為蛋白酶類，在消化液制備和使用中，為了防止PH值過于劇烈的變化而造成蛋白質變性，因此在上述基礎上，本發明的消化液中添加緩沖系作為透明質酸酶和硫酸軟骨素ABC酶的溶劑。作為溶劑的緩沖系，根據細胞的適應性范圍，可以采用PH相符合的常用pKa (酸度系數)=7.2的PBS緩沖系、Tris-HCl緩沖系等。上述緩沖系作為溶劑添加在消化液后，在消化處理的過程中消化液自身存在無機離子，還可有利于維持細胞外的滲透壓力，避免干細胞出現吸脹破裂等等。
[0015]在本發明上述沃頓膠消化液的基礎上，本發明進一步還提出一種臍帶間充質干細胞的制備方法，包括如下步驟:
[0016]S10，獲取臍帶沃頓膠的破碎組織；
[0017]S20，將臍帶沃頓膠組織用沃頓膠消化液進行消化處理，并搜集消化液；
[0018]S30，從消化液中提取臍帶間充質干細胞。
[0019]其中，步驟SlO獲取原料沃頓膠的破碎組織，具體實施中可以采用如下步驟進行:
[0020]SI I，獲取臍帶；
[0021]該步驟Sll獲取臍帶可以是生產手術中剪下的臍帶，或者是其他途徑保存的可以直接使用的臍帶均可；獲取之后的臍帶為了保持其細胞組織形狀，獲取的臍帶可以放入含抗凝劑的無菌注射用生理鹽水中，4°C低溫保存備用。
[0022]S12，從步驟Sll獲取的臍帶中分離沃頓膠；
[0023]該步驟中用手術剪將臍帶外壁剪開，并用鑷子去除外壁；可見到透明的膠狀物質即沃頓膠，用鑷子仔細夾取即可得到沃頓膠。
[0024]S13，將步驟S12獲取的沃頓膠剪切破碎，成為便于消化的破碎組織；
[0025]實施中，剪切破碎的可以采用實驗室常用的手術剪進行，在培養皿中將沃頓膠剪碎成1-2_3的組織塊，剪碎的過程之前可以先在培養皿中添加破碎緩沖液，對組織細胞進行保護。同時，由于接來下的步驟是將破碎的組織用于消化，并且本發明的上述消化液中采用的溶劑即是PBS等緩沖系，因此可以直接采用消化液作為破碎緩沖液直接進行，剪碎之后然后直接轉移至進行步驟S20的消化處理。
[0026]上述組織破碎完成之后，步驟S20進一步將獲得的破碎組織進行消化處理，按照上述步驟S13以消化液作為破碎緩沖液進行切碎之后，破碎的組織漿液中含有消化液，因此不需要再繼續添加，而可以直接轉移至搖床上進行震蕩消化；同時，震蕩消化的過程中，可以控制消化的溫度為35?37°C，以保證消化過程中酶的活性最優。同時，消化過程中，根據反復的實驗和測試，在消化液的添加量合適的情況下，震蕩消化40min消化即可比較完全(如果為了確定保證消化完全，可以適當延長消化的時間)，得到用沃頓膠消化液消化處理之后生成的消化漿液。
[0027]在步驟S20之后，所生成的消化漿液中就具有較多游離出來的臍帶間充質干細胞，然后步驟S30從這消化漿液中進行分離提取即可得到臍帶間充質干細胞。分離的方法可以參見如下步驟進行:
[0028]S31，將步驟S20所獲得的消化液于200-400目無菌篩網上研磨并過濾后，取濾液(本次濾液中即含有消化過程中所游離出的臍帶間充質干細胞)；
[0029]S32，將步驟S31的濾液用含10 % FBS (胎牛血清)的DMEM/F12完全培養液進行終止消化處理；其中，上述完全培養液按照實驗室手冊配置中，均是按照10%的量比添加，實際實施中只要能滿足細胞的生長要求，可以適當的增減，控制在8?12%的范圍左右。
[0030]S33，將步驟S32終止消化處理后的濾液中加入PBS后，200g離心5min后棄去上清，則下層沉淀即為分離的臍帶間充質干細胞，然后再次用PBS重懸細胞后離心洗滌；重復洗滌3次后，搜集細胞體即為臍帶間充質干細胞。
[0031]本發明的上述實施過程完成之后，一般量較少，因此