專利名稱：山茱萸及其提取物在制備α－葡萄糖苷酶抑制劑類藥物中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥及其提取物新的藥用用途，具體的說，本發明涉及中藥山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)及其提取物在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物中的用途，可降低餐后血糖，治療I、II型糖尿病以及糖尿病并發癥。
背景技術：
多年來治療糖尿病主要以控制空腹血糖作為治療目標，治療藥物很長時間只有磺酰脲類和雙胍類，磺脲類通過刺激胰腺分泌胰島素而降低血糖；雙胍類則通過增加外周組織對葡萄糖的利用而降血糖，兩者對降低II型糖尿病病人的空腹血糖均有較好的療效，但對降低餐后血糖的作用卻十分有限。糖尿病時的餐后血糖是一天中血糖水平最高階段，其持續時間可達8小時之久或更長，長時間高水平的餐后血糖可加重糖尿病本身，使血糖進一步升高，餐后血糖也是糖尿病并發癥的主要危險因子，如果在進餐時就能很好地控制高血糖，則可以避免其餐后血循環中的糖份堆積，因此，控制餐后血糖可以說是控制高血糖、防治糖尿病的重要措施。
α-葡萄糖苷酶抑制劑是七十年代后期研究開發出的一類新型口服降血糖藥物，其作用機理為競爭性地抑制α-葡萄糖苷酶，延緩和阻礙碳水化合物的消化，延遲來自雙糖，低聚糖及多糖的葡萄糖吸收，有效推遲并減輕餐后血糖升高的時間及程度，長期服用還可降低空腹血糖水平，此類藥物對I、II型糖尿病均適用。α-葡萄糖苷酶抑制劑不僅對糖尿病有確切的療效，而且對于肥胖癥，慢性乙肝，艾滋病及腫瘤都有一定的治療作用。目前用于臨床的有阿卡波糖，伏格列波糖和米格列醇。
食物中的絕大部分碳水化合物為淀粉、蔗糖等，淀粉先后經唾液及胰液α-淀粉酶的作用分解為寡糖，寡糖在小腸上皮細胞刷狀緣處被α-葡萄糖苷酶分解為葡萄糖而被吸收后，導致餐后血糖高峰。
山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，性微溫，味酸，具有補益肝腎、收斂固澀的功效。現代研究表明，山茱萸的主要化學成份有苷類、有機酸類、多酚類、糖類及氨基酸類等。20世紀80年代，日本學者山原條二等，發現了山茱萸乙醚和乙酸乙酯提取物對鏈脲菌素所形成的糖尿病大鼠有明顯的降糖作用，其有效成分是熊果酸藥學雜志，1981，101(1)86；山茱萸乙醇提取對II型糖尿病大鼠的治療效應南通醫學院學報2000，20(4)337-339報道了山茱萸乙醇提取液對II型糖尿病的抑制作用；山茱萸不同工藝提取物的降糖作用實驗研究北京中醫1997，553-54公開了山茱萸醇提水沉法、水提法降低糖尿病大鼠高血糖作用；山茱萸對糖尿病小鼠血糖和組織糖原含量的影響咸寧醫學院學報，1999，13(1)12-14報道了山茱萸對四氧嘧啶、鏈脲佐菌素以及腎上腺素所致糖尿病大鼠有明顯的降糖作用；五味子、山茱萸等對蛋白質非酶糖化的抑制作用南京中醫大學學報，2001，17(3)，166-167報道了山茱萸對糖尿病并發癥的改善作用。臨床和實驗研究已肯定了山茱萸的降糖作用。CN1053371C的中國專利文獻公開了一種具有免疫作用和抗炎作用的山茱萸總皂苷提取物及其提取工藝。但目前尚未見山茱萸在制備具有α-糖苷酶抑制活性的藥物中的應用報道，也未見具有α-糖苷酶抑制活性的山茱萸總苷提取物在制備降低餐后血糖、治療I、II型糖尿病以及糖尿病并發癥的藥物中的應用報道。

發明內容
目前，臨床應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物并不多見，化合物類藥物拜唐蘋居主導地位，本發明的目的是提供中藥山茱萸(Cornusofficinalis Sieb.et Zucc)及其提取物在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物中的新用途，以提供新的α-葡萄糖苷酶抑制劑的用藥途徑。
本發明的技術方案是提供中藥山茱萸(Cornus officinalis Sieb.etZucc)及其提取物在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物中的用途。
上述的山茱萸提取物是水或有機溶劑提取物，進一步地，該山茱萸提取物含有山茱萸總苷，其重量比為10～90％，更進一步地，還含有山茱萸多酚類成份，其重量比為5～30％，更優選的，所述的山茱萸提取物中含有山茱萸總苷，其重量比為45～90％，山茱萸多酚類成份，重量比為10～30％。
本發明將提供一種得到該山茱萸提取物的制備方法，包括以下步驟a、將中藥山茱萸粉碎，用水、甲醇或乙醇，或含水醇類提取、濃縮、沉淀離心，得上清液備用；具體地，將原材料經過適當的粉碎，用水、甲醇或乙醇，或含水醇類在靜或動態下，室溫或加熱(包括回流)提取，提取溶劑為原生藥重量的5～12倍，可重復提取1～3次，合并提取液濾去藥渣，在常壓或減壓動態狀態下濃縮至一定濃度(0.5～2.0克/毫升)，通過醇沉、絮凝等方法，使雜質沉淀，再經離心或過濾(包括常壓、減壓、微濾、超濾)，除去不溶物，得清液備用。
b、將a步驟處理后得到的上清液，再上大孔樹脂柱，以水洗凈不吸附的雜質，再用醇、酮或含水醇洗脫，收集洗脫液，濃縮，真容干燥、冷凍干燥、收集液直接噴霧干燥得干粉。
上述的中藥提取物的制備方法中，優選的方法是提取溶劑為水、含水乙醇，大孔樹脂為非極性大孔樹脂，洗脫液為25～95％乙醇。
本發明還提供以所說的中藥山茱萸及其提取物為有效藥用成份的α-葡萄糖苷酶抑制類的藥物制劑，可用于降低餐后血糖、治療I、II型糖尿病以及糖尿病并發癥，也可用作功能食品。
以上述所說的山茱萸或其提取物，與藥學上可接受的輔助添加性成分混合后，按相應的常規藥物制劑方法，可以制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類的藥物。例如，與在口服制劑中可以被接受的如崩解劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑等常用的輔助添加成份混合后，按常規的操作方法和過程，可以制成為片劑、丸劑、膠囊劑或多種相應的緩釋劑、控釋劑等固體口服制劑形式的藥物；與常規的增溶劑、乳化劑、潤濕劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩定劑、矯味劑、增稠劑等混合后，按相應的常規方法，可以制成為如水劑、糖漿等液體制劑形式的口服藥物。
本發明上述所說的可作為有效藥用成分使用的山茱萸提取物，其原料為天然藥物山茱萸，藥源充足，提取制備的方法簡便易行。實驗結果顯示，以該提取物在作為α-糖苷酶抑制劑藥物的有效活性成分，可具有較強抑制α-糖苷酶的作用，不僅可用于降低餐后血糖，還可用于I、II型糖尿病以及糖尿病并發癥的治療，療效好，毒副作用小。本發明的中藥山茱萸及其提取物能有成效地抑制小腸內的α-葡萄糖苷酶活性，通過體內外實驗證實，能明顯地抑制體外α-葡萄糖苷酶活性，降低正常小鼠和糖尿病小鼠餐后血糖高峰，用于糖尿病，特別是控制糖尿病人餐后血糖升高非常有效。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。


圖1是山茱萸提取物SZY-1、山茱萸提取物SZY-2、山茱萸提取物SZY-3對α-葡萄糖苷酶活性的抑制效應的測定結果。縱座標代表酶活性抑制率，橫座標代表SZY-1、SZY-2、SZY-3、拜唐蘋。圖中比較了以麥芽糖、蔗糖、淀粉為底物時，山茱萸提取物SZY-1、山茱萸提取物SZY-2、山茱萸水煎煮提取物SZY-3、拜唐蘋對α-葡萄糖苷酶的抑制活性。
具體實施例方式
實施例1 山茱萸提取物SZY-1(乙醇浸漬)的制備200克干燥山茱萸粉碎后，依次用加5倍量的70％乙醇回流3次，每次0.5小時；將乙醇提取液過濾后合并，減壓濃縮至干，得浸膏SZY-1共45g。
用莫諾苷為對照標準品，用分光光度法(鄭虎占等，中藥現代研究與應用，第48頁)，對干粉狀產物中的山茱萸總苷含量進行測定，山茱萸總苷(重量比)為15％。用靛胭脂液為指標劑，用標準KMnO4溶液滴定，測得多酚類含量為9％。
實施例2 山茱萸提取物SZY-2的制備200克干燥山茱萸粉碎后，依次用加5倍量的60％乙醇回流3次，每次0.5小時；將乙醇提取液過濾后合并，減壓蒸餾除去乙醇，得濃縮水溶液，用去離子水稀釋至1600毫升，離心備用。取200克D-140型非極性大孔樹脂裝柱，將上述水溶液以20毫升/分鐘的流速通過該大孔樹脂柱，然后用500毫升去離子水以20毫升/分鐘的流速洗柱，再用1000毫升75％乙醇洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮，真空干燥得山茱萸提取物SZY-2共8.593g，為棕色粉末。可加入適當輔料制成片劑、膠囊、顆粒劑。
用莫諾苷為對照標準品，用分光光度法，對以上山茱萸提取物SZY-2干粉狀產物中的山茱萸總苷含量進行測定，山茱萸總苷(重量比)為81％。用靛胭脂液為指標劑，用標準KMnO4溶液滴定，測得多酚類含量為15％。
實施例3 山茱萸提取物SZY-3的制備200克干燥山茱萸經粉碎后，加入10倍量的水煎煮30分鐘，共煎煮三次。將三次煎煮液合并，離心備用。取200克D-140型非極性大孔樹脂裝柱，將上述煎煮液以20毫升/分鐘的流速通過該大孔樹脂柱，然后用500毫升去離子水以20毫升/分鐘的流速洗柱，再用1000毫升75％乙醇洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮，真空干燥得山茱萸提取物SZY-3共8.789g。可加入適當輔料制成片劑、膠囊、顆粒劑。
用莫諾苷為對照標準品，用分光光度法，對以上干粉狀產物中的山茱萸總苷含量進行測定，山茱萸總苷(重量比)為63％。用靛胭脂液為指標劑，用標準KMnO4溶液滴定，測得多酚類含量為24％。
實施例4 山茱萸提取物SZY-1、SZY-2、SZY-3對α-葡萄糖苷酶的體外抑制作用；1)以淀粉為底物時，山茱萸提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定用實施例1所得的山茱萸提取物SZY-1、實施例2所得到的山茱萸提取物SZY-2、實施例3所得的山茱萸提取物SZY-3分別溶于生理鹽水，配制成濃度為0.1mg/ml山茱萸提取物溶液，再分別將此三種溶液20微升與2微升α-淀粉酶(0.4U/ul，購自SIGMA公司)混合，在37℃溫育10分鐘，加入1％淀粉溶液，室溫孵育3-5分鐘，用碘滴定顯色法，在630nm波長下測定OD值，通過淀粉消耗量計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率；設定空白對照，陰性對照，陽性對照(拜唐蘋(生產廠家北京拜耳醫藥保健有限公司))，抑制率＝(樣品-陰性/空白-陰性)×％。
2)以麥芽糖為底物時，山茱萸提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定用實施例1所得的山茱萸提取物SZY-1、實施例2山茱萸提取物SZY-2、實施例3所得的山茱萸提取物SZY-3分別溶于生理鹽水，配制成0.28mg/ml溶液，再分別將此三種溶液20微升與2微升α-葡萄糖苷酶(0.02U/ul，購自SIGMA公司)混合，在37℃溫育10分鐘，然后加入麥芽糖，37℃繼續溫育10分鐘；采用葡萄糖氧化酶法，在490nm波長下測定OD值，以葡萄糖的生成量，計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率；設定空白對照，陰性對照，陽性對照(拜唐蘋)。酶活性抑制率＝(陰性-樣品)/(陰性-空白)×100％。
3)以蔗糖為底物時，山茱萸提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性測定將20微升的山茱萸提取物溶液SZY-1、山茱萸提取物溶液SZY-2、山茱萸提取SZY-3(濃度均為0.28mg/ml)，分別與2微升轉化酶(0.106U/ul，購自SIGM A公司)混合，在37℃溫育10分鐘，然后加入蔗糖，37℃繼續溫育10分鐘；采用葡萄糖氧化酶法，在490波長下測定OD值，以葡萄糖的生成量，計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率；同時設定空白對照，陰性對照，陽性對照(拜唐蘋)。酶活性抑制率＝(陰性-樣品)/(陰性-空白孔)×100％。
結論以上實驗結果表明，山茱萸提取物SZY-1、SZY-2、SZY-3體外對α-葡萄糖苷酶有顯著抑制作用。體外實驗結果見圖1。
實施例5 正常小鼠淀粉負荷糖耐量試驗將實施例3所得的山茱萸提取物SZY-3溶于生理鹽水使成5％溶液，待用。取體重22～26克昆明種小鼠，眶后靜脈叢采集空腹血，分離血清測定血糖，選取血糖值差異較小的鼠，按每組10只、雌雄各半分為6組，即淀粉負荷組、拜唐蘋組(生產廠家北京拜耳醫藥保健有限公司)(西藥陽性對照)、山茱萸提取物(SZY-3)高劑量組、中劑量組、低劑量組、桑枝顆粒(生產廠家海爾藥業)(中藥陽性對照)高、中劑量組，拜唐蘋劑量為20毫克/公斤(體重)，山茱萸高劑量組為400毫克/公斤，中劑量組為200毫克/公斤，低劑量組為100毫克/公斤，桑枝顆粒高劑量組為400毫克/公斤，中劑量組為200毫克/公斤；給藥10分鐘后(模型組灌胃生理鹽水)，各組均灌胃淀粉5克/公斤，分別于30、60、90、120分鐘取眶后靜脈叢血，以葡萄糖氧化酶法在96孔板中測定血糖含量，結果見表1。
表1 山茱萸提取物SZY-3對正常小鼠淀粉負荷糖耐量的影響組別 例數劑量血糖值(mmol/L)(只)(mg/kg) 0h0.5h 1h 1.5h 2h對照組106.48±1.4915.23±3.9714.02±3.7711.62±3.529.98±3.12(glu升高值) 8.75±3.12 7.55±3.02 5.14±2.54 3.50±2.37拜唐蘋組 10 206.88±1.289.01±1.95**10.07±2.31**9.45±2.29 8.48±2.31(glu升高值) 2.13±0.97**3.19±1.66**2.57±1.69**1.60±1.63**SZY-3(高) 10 400 6.73±1.6211.98±2.12*10.84±2.028.33±1.37*7.53±0.93*(glu升高值) 5.24±1.98*4.11±2.09*1.60±0.95**0.80±1.21*SZY-3(中) 10 200 6.79±1.6112.10±2.85*10.48±1.73*8.18±1.20*7.62±1.39*(glu升高值) 5.31±2.56**3.68±1.62*1.39±1.30**0.82±0.94*SZY-3(低) 10 100 6.53±0.8711.66±2.4810.21±1.44*7.89±1.02**7.46±0.88(glu升高值) 5.13±2.84*3.69±1.27**1.36±0.82**0.93±1.09*桑枝(高) 10 400 5.63±1.1112.37±1.89*10.78±3.058.16±1.85*7.32±1.51*(glu升高值) 6.73±1.93 5.14±2.29 2.53±1.67**1.68±1.45*桑枝(中) 10 200 6.24±1.2314.19±2.5912.38±2.158.62±1.91*7.18±1.46**(glu升高值) 7.96±2.45 6.14±2.23 2.38±1.86*0.94±1.31**與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01結果分析從表1可以看出，三種劑量的山茱萸提取物對正常小鼠淀粉負荷后各時間點的血糖值均有顯著的降低，且在1.5小時和2小時抑制血糖升高作用優于劑量為20mg/ml的西藥拜唐蘋；山茱萸與中藥桑枝顆粒比較，在0.5和1小時，三種劑量的山茱萸作用均強于桑枝顆粒，在1.5和2小時，山茱萸略低于桑枝顆粒。
實施例6 四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠淀粉負荷糖耐量試驗取體重22-26克昆明種小鼠，腹腔注射200毫克/公斤四氧嘧啶，72小時后測定血糖，選取血糖值在13毫摩爾/升以上的小鼠，按每組10只、雌雄各半分為6組，即糖尿病模型組、拜唐蘋組、實施例3所得的山茱萸提取物SZY-3高劑量組、中劑量組、低劑量組、桑枝顆粒組，拜唐蘋劑量為20毫克/公斤(體重)，山茱萸提取物(SZY-3)高劑量組為400毫克/公斤，低劑量組為400毫克/公斤，桑枝顆粒組為400毫克/公斤；給藥10分鐘后(模型組灌胃生理鹽水)，各組均灌胃淀粉5克/公斤，分別于30、60、90、120分鐘取眶后靜脈叢血，以葡萄糖氧化酶法在96孔板中測定血糖含量，結果見表2。
表2 山茱萸提取物SZY-3對四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠淀粉負荷糖耐量的影響組別 例數 劑量 血糖值(mmol/L)(只) (mg/kg) 0.5h1h 1.5h2h對照組 1025.44±9.30 44.43±9.10 41.68±7.5039.92±9.18 37.14±8.89(glu升高值) 18.99±5.28 16.24±5.1614.47±5.51 11.70±6.67Acarbose 10 20 26.82±4.98 28.68±3.73**30.89±5.67**30.76±4.70*31.43±5.35(glu升高值) 1.86±3.27**4.06±2.56**3.94±2.74**4.61±1.39**SZY-3(高)10 40027.34±4.16 30.86±4.63**31.81±4.97**31.61±4.94*31.94±4.34(glu升高值) 3.53±1.41**4.47±1.66**4.28±2.15**4.61±2.31*SZY-3(中)10 20027.53±4.64 32.37±5.69*34.14±6.23*34.27±5.44 32.82±4.00(glu升高值) 4.84±2.83**6.61±2.51**6.74±2.60**5.30±3.54*SZY-1(低)10 10025.94±8.77 34.53±5.09*38.57±6.4435.25±7.09 33.82±6.97(glu升高值) 8.59±6.99**12.63±6.329.31±5.46*7.88±7.67桑枝(高) 10 40025.53±4.32 33.91±3.90**37.97±5.8536.61±5.18 36.25±6.35(glu升高值) 8.38±3.71**12.44±3.2911.09±4.17 10.72±4.66與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，結果分析從表2可以看出，糖尿病小鼠給予淀粉后，血糖值明顯升高。山茱萸提取物SZY-3高劑量在各時間點均顯著抑制糖尿病小鼠的血糖升高，除0.5小時作用較弱外，其余時間點的作用與拜唐蘋相當；山茱萸提取物(SZY-3)與桑枝顆粒比較，山茱萸提取物SZY-3的作用顯著優于桑枝顆粒，桑枝顆粒僅在高劑量0.5小時對淀粉負荷引起的糖尿病小鼠血糖升高有抑制作用。
通過上述實施例，經過體外實驗證明山茱萸提取物體外對α-葡萄糖苷酶有顯著抑制作用，動物實驗表明通過淀粉負荷糖耐量試驗，給予劑量為100-400mg/kg山茱萸提取物后，顯著降低正常小鼠和糖尿病小鼠淀粉負荷后的血糖升高，對控制餐后血糖的升高非常有效，可以用于I型特別是II型糖尿病以及糖尿病并發癥的治療。
實施例7 山茱萸原生藥膠囊的制備取200g干燥山茱萸，在滅菌器中于110℃下濕熱滅菌30分鐘，干燥，粉碎成細粉，過100目篩，加淀粉40g，y硬脂酸鎂0.4g，混勻，裝成30粒膠囊。人口服劑量每次1粒，每天3次。
權利要求
1.中藥山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)及其提取物在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述的山茱萸提取物是水或有機溶劑提取物。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述的山茱萸水或有機溶劑提取物中含有山茱萸總苷，其重量比為10～90％。
4.根據權利要求2或3所述的用途，其特征在于所述的山茱萸水或有機溶劑提取物，還含有山茱萸多酚類成份，其重量比為5～30％。
5.根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述的山茱萸提取物中含有山茱萸總苷，重量比為45～90％，山茱萸多酚類成份，重量比為10～30％。
6.權利要求3～5中所述的山茱萸提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟a、將中藥山茱萸粉碎，用水、甲醇或乙醇，或含水醇類提取、濃縮、沉淀離心，得上清液備用；b、將a步驟處理后得到的上清液，再上大孔樹脂柱，以水洗凈不吸附的雜質，再用醇、酮或含水醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥，得到成品。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于a步驟的提取溶劑為水、含水乙醇。
8.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟b的大孔樹脂為非極性大孔樹脂，洗脫液為25～95％乙醇。
9.一種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的藥物組合物，其特征在于其活性成分是山茱萸的原生藥或如權利要求2～5所述的山茱萸提取物。
10.一種具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的藥物組合物，其特征在于由山茱萸的原生藥或如權利要求2～5所述的山茱萸提取物加上藥學上可接受的輔料或載體組成。
11.根據權利要求9或10所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的劑型為口服制劑。
12.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是降低餐后血糖的藥物。
13.根據權利要求12所述的用途，其特征在于所述的藥物是對I、II型糖尿病以及糖尿病并發癥有治療作用的藥物及功能食品。
全文摘要
本發明提供一種具有抑制α－葡萄糖苷酶活性的山茱萸原生藥及山茱萸的水或有機溶劑提取物，山茱萸提取物含有從山茱萸中提取的總苷和多酚類成分，系從山茱萸中經水煎煮或甲醇、乙醇、水醇浸漬，經大孔吸附樹脂分離而獲得，在以淀粉、麥芽糖以及蔗糖為底物時的體外實驗中，顯示良好的α－葡萄糖苷酶抑制作用；淀粉負荷糖耐量試驗顯示，給予劑量為100－400mg/kg山茱萸提取物后，顯著降低正常小鼠和糖尿病小鼠淀粉負荷后的血糖升高，對控制餐后血糖的升高非常有效，可以用于I型特別是II型糖尿病以及糖尿病并發癥的治療，療效好，毒副作用小。
文檔編號A61P3/10GK1565467SQ0313521
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月17日 優先權日2003年6月17日
發明者高小平, 羅弟祥, 徐大勇, 劉忠榮, 李伯剛, 鄒文俊, 黃瑜 申請人:成都地奧制藥集團有限公司