一種化學品胚胎毒性預測模型及其建立方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種化學品胚胎毒性預測模型及其建立方法，尤其設及一種小鼠胚胎 干細胞定向誘導分化為具有搏動能力的屯、肌細胞，并在所獲得的屯、肌細胞上建立化學品胚 胎毒性的識別和預測模型，并應用于新化學品胚胎毒性的預測中。
【背景技術】
[0002] 目前，化學品的毒性數據多在實驗動物中獲得，如急性毒性試驗，亞急性毒性試 驗，慢性毒性試驗等。但是，開展動物實驗存在幾個不容忽視的問題；1.需要大量的財力， 2.實驗周期長，3.需要大量的實驗動物，4.因體內影響因素較多，難W進行代謝和機制 研究。出于動物保護原則，Russell和Burch提倡"3R"原則，即減少（Reduction),優化 化efinement)和替代化巧lacement)，無論是從科學角度還是從經濟角度，毒理學替代法 對外源性化學物的危害評價及管理都有非常重要的意義。
[0003] 據歐洲化學品管理、評估和限制機構（REACH)估計，接下來的15年中將會有30000 種化學品需要進行安全性測試，根據現有的測試指南，將犧牲7百萬只動物，其中約64%是 用于化學品的生殖和發育毒性評價；每檢測2000種新化合物的發育毒性，約需耗資6億歐 元。而新化合物的數目W每年1000種遞增，其中90%W上沒有安全性評價的數據。在該 一過程中，無論是動物的使用情況，還是測試過程中人力、物力、財力的消耗，如此巨大的數 字，讓人觸目驚屯、。
[0004] 我國幅員迂闊，人口眾多，因此在面臨評價化合物暴露導致的健康問題時情況將 比其他國家更為復雜。并且由于各地化合物種類、比例不同，在開展流行病學調查的時候重 點也不相同，加上工業快速發展、城市化進程加快的同時也帶來了新型污染物及其快速擴 散的問題。毒理學替代法的應用與推廣同樣適用于我國的國情。
[0005]自1986年歐盟實施動物福利指導原則W來，歐盟大力支持替代法的發展與使用。 胚胎干細胞試驗巧ST)是經過歐洲替代方法研究中屯、巧U化-ECVAM)驗證的一類用于預測 化合物潛在胚胎毒性的實驗方法。該方法充分利用了胚胎干細胞的分化潛能，設置分化的 觀察終點，結合細胞的一般毒理學數據，通過判別方程式對化合物的潛在胚胎毒性進行評 估和分級，從而實現對化合物的安全性評價，屬于一種測試方法的替代體系。借助EST，在 誘導的不同階段或不同的誘導方向進行化學品的暴露，可模擬反應分化過程中化合物對機 體發育的影響，在毒性篩選、毒性祀器官確定、毒性作用機制等毒理學研究中具有獨特的優 勢。隨著國際上干細胞生物學研究的不斷深化，胚胎干細胞模型也得到進一步發展，即利 用其分化潛能尋找祀器官或監測分化過程中關鍵基因的表達，發現化合物對肝臟、肌肉、血 管、骨等器官組織的影響，通過選擇多個觀察終點，可W分別評估化合物對相應器官組織的 潛在毒性。整個評估周期在10至21天之間，并且在整個實驗過程中都不需要用到活體的 動物，節約人力、物力、財力和時間，可重復性強，易于操作，符合國際上化合物毒性評價替 代研究的要求，因而引起廣泛的關注。
[0006]EST適用于從細胞水平分析發育過程，并判斷某因素是否具備胚胎毒物或致崎潛 能。目前，EST多選擇屯、肌細胞作為分化發育后的衡量指標，其原因有第一、屯、臟發育始于 胚胎發育早期，使得在體外通過誘導胚胎干細胞（簡稱ES或者ESC)分化為屯、肌細胞模擬 體內的屯、臟發育過程較易實現；第二、屯、臟發育是一個高度特化的過程，對發育過程的細微 干擾即可導致屯、臟發育出現異常，因而具備較高的靈敏度；第S、由于ES誘導分化的屯、肌 細胞具有搏動能力，作為觀測終點具有良好的可視性。
[0007] 為了驗證EST的準確性，Scholz進行了W下實驗；1.受試物對分化的3T3成纖維 細胞的細胞毒性效應；2.受試物對未分化的ES細胞的細胞毒性效應；3.受試物對ES細胞 向屯、肌細胞分化的影響。W相應的體內試驗資料作為根據，在10種受試物中，100%準確地 判斷了非胚胎毒性物質，88. 9%準確地判斷了弱胚胎毒性物質，91. 7%準確地判斷了強胚 胎毒性物質。在此實驗數據基礎上，結合受試物的體內試驗信息，Genschow等建立了判別 方程模型，對化合物的胚胎毒性開展=級預測，即判斷化合物為無胚胎毒性、低胚胎毒性或 者高胚胎毒性。EST具備篩選化合物胚胎毒性的功能，因此被世界各大化學品制造商、藥廠 等用于對新原料或新藥的篩選及胚胎毒性的安全性測試。
[0008] 國際上許多致力于優化EST的科學家通過大量的研究，提出了EST的標準化操作 流程中存在W下兩點亟待優化的地方；第一、EST是基于ES細胞系D3建立和推廣的，建議 同時采用其他ES細胞系建立模型，保證評價結果的準確性；第二、觀測屯、肌細胞的搏動受 主觀因素影響較大，因此建議W分子生物學指標作為觀測終點，W提高準確度。
[0009] 目前，除了D3細胞系外，在其他的研究中，J1，R1，E14TG2a，E14. 1，DBA/llacZ等 ES細胞系也被使用，并發現了不同細胞系對誘導分化的敏感性不同，并造成了分化為具搏 動能力屯、肌的時間存在差異。然而，該些已使用的ES細胞系核型均為XY，即都是"雄性"的 ES。當前尚無利用核型為XX的ES細胞系建立胚胎毒性評價模型并開展應用的先例。
[0010] 利用分子生物學手段檢測關鍵的特異性基因在ES誘導的屯、肌細胞中的表達可更 精確地建立劑量一效應曲線，在Seiler等人的實驗中，強調了利用分子觀測終點獲得受試 化合物抑制屯、臟發育的相關數據，獲得了良好的劑量一效應曲線W及與傳統觀測終點在評 價結果中的一致性。然而，當前已有的EST僅采用編碼屯、肌蛋白重鏈的基因Myh6作為分子 觀測終點，其他的基因的表達情況是否也能作為可用于EST預測化學品胚胎毒性的分子觀 測終點，仍待確證。

【發明內容】

[0011] 為了彌補上訴現有技術中存在的不足，本發明公開了一種化學品胚胎毒性預測模 型，包括細胞種類；該細胞種類包括核型為XX的SP3ES細胞誘導分化出的屯、肌細胞。
[001引進一步地，還包括分子觀測終點；該分子觀測終點包括Myl4。
[0013] 進一步地，該細胞種類還包括核型為XY的R1ES細胞誘導分化出的屯、肌細胞。
[0014] 進一步地，該分子觀測終點還包括cTnT和/或Myh6。
[00巧]進一步地，還包括Myl4的上游引物序列；AAGAAACCCGAGCCTAAGAAGG，和Myl4的下 游引物序列；TGGGTCAAAGGCAGAGTCCT。
[0016] 進一步地，還包括cTnT的上游引物序列；CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG，cTnT的下游引 物序列；CTCCATCGGGGATCTTGGGT，Myh6 的上游引物序列；GCCCAGTACCTCCGAAAGTC和Myh6 的 下游引物序列；GCCTTAACATACTCCTCCTTGTC。
[0017] 本發明還揭示了如上所述的化學品胚胎毒性預測模型的建立方法，其特征在于， 包括W下步驟：
[001引步驟一：小鼠胚胎成纖維細胞的分離和培養；
[001引步驟二：小鼠ES的體外擴增培養；
[0020] 步驟立；小鼠ES的核型分析及性別鑒定；
[0021] 步驟四：小鼠ES多能性的維持和鑒定；
[0022] 步驟五：小鼠ES體外誘導分化為屯、肌細胞；
[0023] 步驟六：小鼠ES誘導分化的屯、肌細胞的屯、肌特異性標志蛋白的免疫化學檢測；
[0024] 步驟^;：;小鼠ES誘導分化的屯、肌細胞的表達譜的Real-timePCR檢測；
[0025] 步驟八；模式化合物的選擇；選擇4種及W上模式化合物使得該模式化合物集合 包含強致崎性化合物、弱智崎性化合物、無致崎性化合物W及在雌雄性別中致崎性有所不 同的化合物；
[0026] 步驟九：模式化合物細胞毒性的檢測；獲得各模式化合物對細胞的半數致死劑量 1〔50;
[0027] 步驟十；模式化合物對ES分化能力的抑制效應的檢測；獲得各模式化合物對ES 細胞分化的半數抑制劑量1町。的值；
[0028] 步驟十一；模式化合物胚胎毒性的評價：通過步驟九得到的ICg。和步驟十得到的 1町。分析各模式化合物對胚胎毒性的影響程度，建立得到所述化學品胚胎毒性預測模型，從 而推廣到對其他化學品胚胎毒性的預測；
[0029] 所述ES包括SP3ES細胞。
[0030] 進一步地，還包括步驟十二；分子觀測終點和傳統觀測終點用于反映模式化合物 對ES分化能力的抑制作用下的相關性分析，即采用SPSS19. 0軟件的配對散點圖功能對分 子觀測終點和傳統觀測終點用于測量半數分化抑制能力間的相關性進行分析，同時計算決 定系數；當分子觀測終點和傳統觀測終點間決定系數大于0. 9時，分子觀測終點和傳統觀 測終點高度相關性；W此判斷所述化學品胚胎毒性預測模型的準確性和有效性。
[0031] 進一步地，所述步驟六中所述的屯、肌特異性標志蛋白包括cTnT;所述步驟走中的 所述表達譜包括Myh6、Myl4和cTnT基因；所述步驟八中的所述模式化合物包括5-氣尿喀 晚、阿司匹林、嘲噪美辛、抗壞血酸、青霉素G;所述步驟四中包括WNIH3T3成纖維細胞為 對照；所述ES還包括R1ES細胞。
[0032] 進一步地，所述步驟九中獲得各模式化合物對3T3細胞和ES細胞的半數致死劑量 IC^3T3和ICwES;所述步驟十中獲得各模式化合物對ES細胞分化的半數抑制劑量1化。的 值；所述步驟十一中通過將所述ICw3T3、ICsnES和IDs。數據代