抗結核藥物及抗結核藥物篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗結核藥物以及抗結核藥物篩選方法，本發明還涉及含有該抗結核藥 物的組合物，以及該抗結核藥物用于制備預防或治療結核病的藥物的用途。
【背景技術】
[0002] 近年來結核病感染人數逐年攀升，2012年全球結核病新增860萬人，結核病死亡 人數約130萬人 [1];中國是高結核病負擔國家，多藥耐藥結核病以及與HIV結合感染情況的 增加，使結核病疫情的防控面臨著更為嚴峻的挑戰。快速研發新型抗結核藥物解決結核病 治療所面臨的難題成為控制結核病疫情的當務之急。
[0003] 針對已經確認的靶點尋找全新結構抗結核新藥是最快捷而有效的途徑。丙氨酸消 旋酶（alanine racemase，ALR)是已經確認的抗結核藥物祀點，該酶可以催化L-丙氨酸與 D-丙氨酸之間相互轉化[2'3]。D-丙氨酸是菌體細胞壁中肽聚糖合成的必需前體物質，而自 然界中只存在天然來源的L-丙氨酸，因此L-丙氨酸進入菌體后必須通過ALR的催化作用 生成D-丙氨酸，用于細胞壁的合成 [4]。
[0004] ALR廣泛存在于原核細胞中，且在不同的生物體中的相似性較高，氨基酸序 列覆蓋率為35%-50%，在部分細菌中存在兩個編碼基因 air和dadX，而結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis，MTB)的基因組中只存在一個ALR的編碼基因 alr[5]。由于 人體細胞中不存在ALR，所以針對ALR靶點的抗菌藥物在人體中具有高度的選擇性。
[0005] ALR屬于5-磷酸批卩多醒（pyridoxal5' -phosphate, PLP)依賴型的異構酶家族， 其活性構型是由兩個43kD的單體組合而成的二聚體結構，每個單體中含有兩個活性結 合位點：即PLP結合位點和丙氨酸結合位點[ 6]，已經發現的ALR抑制劑中多數是以PLP 結合位點為靶點的競爭性抑制劑，由于原核生物中PLP依賴型的酶普遍存在[7_8]，所以 以ALR為靶點的藥物很可能是多靶點的。目前，作用于ALR的抗結核藥物D-環絲氨酸 (D-cycloserine，DCS)已應用于臨床，但DCS對ALR的抑制活性偏低，且DCS對人體有較大 的毒副作用 [9]，對于DCS的結構改造也沒有明顯的改善其毒性[1(H11]。因此，針對ALR靶點 建立新的抗結核藥物篩選模型以及尋找不同作用機制的新型抗結核藥物具有重要的意義。

【發明內容】

[0006] 本發明的發明人通過大量實驗和反復摸索，建立了以丙氨酸消旋酶為靶點的抗結 核藥物篩選模型，并篩選出了具有較好抗結核活性、抗菌譜廣、細胞毒性低的抗結核藥物。
[0007] 本發明第一方面涉及式I所示的化合物，或其藥學上可接受的鹽。
[0008]
[0009] 本發明第二方面涉及藥物組合物，其含有本發明第一方面任一項的化合物或其藥 學上可接受的鹽，以及藥學上可接受的載體或賦形劑。
[0010] 本發明第三方面涉及本發明第一方面任一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在 制備抗結核藥物中的用途。
[0011] 本發明還涉及本發明第一方面任一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在體內/ 體外作為丙氨酸消旋酶抑制劑的用途，優選地，所述丙氨酸消旋酶為分枝桿菌的丙氨酸消 旋酶，更優選地，所述丙氨酸消旋酶為結核分枝桿菌的丙氨酸消旋酶。
[0012] 本發明還涉及本發明第一方面任一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在體內/ 體外用于抑制分枝桿菌活性的用途，優選地，所述分枝桿菌為結核分枝桿菌。
[0013] 在本發明的實施方案中，所述結核分枝桿菌為H37RV。
[0014] 本發明還涉及本發明第一方面任一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在制備抗 分枝桿菌藥物的用途，優選地，其中所述分枝桿菌為結核分枝桿菌。
[0015] 在本發明的實施方案中，所述結核分枝桿菌為H37RV。
[0016] 本發明還涉及本發明第一方面任一項的化合物或其藥學上可接受的鹽在制備預 防或治療結核病的藥物中的用途。
[0017] 在本發明的實施方案中，其中所述的結核病為肺結核或肺外結核(例如骨關節結 核、結核性腦膜炎、結核性胸膜炎、腎結核、腸結核等)。
[0018] 本發明還涉及一種篩選抗結核藥物的方法，所述方法包括以下步驟：
[0019] (1)建立反應體系，所述反應體系中包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、丙氨酸脫 氫酶（ALD)、D-丙氨酸、丙氨酸消旋酶（ALR)、待測樣品以及反應緩沖液，同時設立陽性對照 和陰性對照，該反應體系在一定溫度下反應一定時間；
[0020] (2)通過檢測反應產物還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)的濃度計算酶的反應 速率，并根據酶的反應速率計算得到待測樣品對丙氨酸消旋酶的抑制率，選擇抑制率> 50% 的樣品作為抗結核藥物；
[0021] (3 )任選地，可以重復進行步驟（1)和（2 )。
[0022] 在本發明的實施方案中，其特征在于以下（1)~（8)項中的一項或多項：
[0023] (1)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的反應濃度為5-20mmol/L，例如8-12mmol/L，例如 10mmol/L ；
[0024] (2)丙氨酸脫氫酶的濃度為0.025-0. 15U/ml，例如為0.05-0. 10U/ml，例如為 0.08U/ml ；
[0025] (3) D-丙氨酸的濃度為 5_20mmol/L，例如 8_12mmol/L，例如 10mmol/L ;
[0026] (4)丙氨酸消旋酶的濃度為2. 1-8. 4υ/100μ 1，例如為3. 8-4. 6υ/100μ 1，例如為 4. 2U/100y 1 ；
[0027] (5)步驟（1)中的反應溫度為34-40°C，例如為36-38°C，例如為37°C ;
[0028] (6)步驟（1)中的反應時間為30-50min，例如為40min ;
[0029] (7)步驟（1)中的反應pH值為7. 0-9.0,例如為8. 5-9.0 ;
[0030] (8)步驟（1)中的反應緩沖液為Tris-HCl緩沖液或PBS緩沖液。
[0031] 在本發明的具體實施方案中，所述陽性對照藥物為作用于丙氨酸消旋酶的抑制 劑，例如為D-環絲氨酸。
[0032] 在本發明的實施方案中，所述陰性對照藥物為溶解藥物的溶劑。在本發明的具體 實施方案中，所述陰性對照藥物為DMS0。
[0033] 在本發明的實施方案中，所述反應緩沖液可以為本領域常用的緩沖溶液，例如為 Tris-HCl緩沖液或PBS緩沖液。在本發明的具體實施方案中，所述緩沖液為Tris-HCl緩沖 液。在本發明的具體實施方案中，Tris-HCl緩沖液的濃度為100mm 〇l/L，pH為8. 0。
[0034] 在本發明的實施方案中，反應體系的體積為100 μ 1。
[0035] 在本發明的實施方案中，所述酶的抑制率（IR%)的計算方法為：
[0036] IR (%) = (1_VS/VN) X 100%，其中Vs代表待測樣品孔的酶反應速率，Vn代表陰性對 照孔的平均酶反應速率。
[0037] 在本發明的實施方案中，所述酶的反應速率的計算方法為：
[0038] V= (Qt2-Qtl) AVt1)，其中Q為反應體系中生成的產物濃度，&和t2為反應在線性 范圍內的兩個時間點。
[0039] 發明的有益效果
[0040] 本發明以丙氨酸消旋酶為靶點構建了抗結核藥物篩選模型，利用該模型成功地篩 選出抗結核藥物，為更多新抗結核藥物的篩選奠定了基礎。同時，篩選出的藥物具有較好的 抗結核活性，且抗結核菌譜廣，細胞毒性低。
【附圖說明】
[0041] 圖Ialr的PCR擴增結果，I :DNA分子量標準，2 :alr的PCR產物
[0042] 圖 2pET28a: :alr 的雙酶切驗證，I :DNA 分子量標準；2 :pET28a: :alr 經 EcoRI 和 HindIII雙酶切
[0043] 圖 3ALR SDS-PAGE 蛋白圖譜，I :Fermentas#SM0671marker ;2 :全蛋白；3 :沉淀；4 : 上清；5 :流川液；6-7 :雜質峰；8-10 :純化的ALR蛋白
[0044] 圖4NADH濃度與OD34tl關系
[0045] 圖5ALR的穩定性
[0046] 圖6篩選條件優化，A:最適溫度；B:最適pH ;C:最佳D-alanine濃度；D:最佳NAD 濃度；E:最佳LAD濃度；F:最佳酶量；G = DMSO濃度對酶活的影響
【具體實施方式】
[0047] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規產品。
[0048] 實施例1MTB ALR的表達載體的構建
[0049] 以 MTB H37Rv 基因組為模板，以 ALR-PF :5' CGGGAATTCATGAAACGGTTCTGGGAGAATGT CGGAAAGC3'（SEQ ID NO :1)和 ALR-PR :5' CATAAGCTTACCACGGTTTTCAGCCTCGCGATAGGTCCT3' (SEQ ID N0:2)為引物(下劃線為酶切位點)，進行PCR擴增，條件為：95°C預變性5min;9