CIV按1 :1混合，免疫劑量和免疫方式與首免 相同。三免結束后尾尖采血，分離血清，用間接ELISA方法測其抗體效價。細胞融合的前3d 對抗體效價最高的小鼠腹腔注射純化好的H3N2CIV 0. 3mL進行第四次免疫，3d后取小鼠脾 臟進行細胞融合。
[0042] 表1小鼠免疫程序
[0043]
[0044] 5、間接ELISA最佳H3N2CIV包被濃度的確定
[0045] a.包被：將純化的 H3N2CIV 按 I :100、1 :200、1 :400、1 :800、1 :1,600 的比例用包 被液稀釋后包被96孔酶標板，100 μ L/孔。以包被液作空白對照，4°C過夜孵育后，棄包被 液，PBST 洗滌 5 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）。
[0046] b.封閉：用含0. 5 % PVA的封閉液，200 μ L/孔，37 °C封閉Ih后，棄封閉液，PBST洗 滌 3 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）。
[0047] c.加樣：BALB/c 小鼠陽性血清作一抗，以 PBST 按 1 :200、1 :400、1 :800、1 :1，600、 1 :3,200、1 :6, 400的比例系列梯度稀釋；小鼠陰性血清以相同比例稀釋，作為陰性對照， 100 μ L/ 孔，37°C孵育 Ih 后，棄一抗，PBST 洗滌 5 次（200 μ L/ 孔，2min/ 次）。
[0048] d.孵育二抗：加 1 :10, 000 稀釋的 Goat anti-Mouse IgG(H&L)-HRP 二抗，100 μ L/ 孔，37°C孵育，進行ELISA方陣試驗。Ih后，棄二抗，PBST洗滌5次（200 μ L/孔，2min/次）。
[0049] e.顯色：加入TMB底物顯色液，100 μ L/孔，37°C避光顯色15min。
[0050] f.加終止液：加入2M H2SO^止顯色反應，100 μ L/孔。
[0051] g.測OD值：迅速用提前30min預熱的酶標儀進行雙波長檢測，參考波長設定為 630nm，測定 0D45(lnm{t。
[0052] 間接ELISA試驗結果的判斷標準：（1)抗原最適包被濃度的確定：陰性對照的A值 在0.2左右，陽性孔的A值在1.0左右，且P/N值最大。P/N=(陽性值一空白值V (陰性 值一空白值）。
[0053] (2)待檢樣品陰陽性的確定：待檢樣本P/N多2. 1為陽性，反之為陰性。
[0054] (3)待檢樣品ELISA效價的確定：待檢樣品按不同方式梯度稀釋后，測定各孔的OD 值，以P/N多2. 1時的最大稀釋度仍出現陽性反應的最大稀釋度作為待檢樣品ELISA效價。
[0055] 實驗結果：根據方陣試驗所得結果確定，H3N2CIV最適包被濃度為8. 25 μ g/ mL (200倍稀釋）（表2)。以此濃度H3N2CIV包被酶標板，測定3免后7d小鼠血清抗體效價。 將采集的小鼠血清從1 :5, 000倍比稀釋至1 :320, 000,測得效價均在1 :80, 000以上，抗體 水平達到融合需要（表3)。
[0056] 表2 H3N2CIV純化后ELISA最適包被濃度測定結果
[0057]
[0058] 表3小鼠3免后血清抗體效價檢測結果
[0059]
[0061] 6、雜交瘤制備
[0062] a.飼養細胞的制備：本實驗以BALB/c小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養層細胞，于細胞 融合前Id將其均勻鋪在96孔細胞板中。飼養細胞的制備過程如下：
[0063] SI.取一只8周齡的雌性BABL/c小鼠，摘眼球采血收集至I. 5mL EP管內，分離到 的血清作雜交瘤細胞篩選時的陰性對照，-20°C備用。小鼠處死后于75%酒精中浸泡5min ;
[0064] S2.無菌條件下剪開小鼠腹部皮膚，充分暴露，但不要破壞腹膜。吸取8mL HAT選 擇性培養液注入腹腔。反復吸打十余次，完畢后將含有腹腔巨噬細胞的培養基轉移至無菌 細胞培養皿中。先取少量在顯微鏡下計數細胞個數，然后在培養皿中補加 HAT培養液混勻， 調整細胞濃度為IO5個/mL ;將含飼養細胞的HAT培養液混勻后加至96孔細胞培養板中，每 孔100 μ L。之后，于37°C、5% CO2細胞培養箱中培養。24h后，觀察細胞狀態，細胞應無污 染，呈多形性，折光性好且貼壁緊密。
[0065] b.小鼠免疫脾細胞的制備
[0066] 本次實驗中，為提高融合細胞數量和防止單只小鼠脾細胞數量不足，取1號和3號 (表3)小鼠脾細胞混在一起使用，小鼠脾細胞制備為常規方法。
[0067] c.細胞融合
[0068] SI.分別取出準備好的SP2/0骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞，懸浮混勾，按細胞個數1 : 10的比例吸取兩種細胞于50ml離心管中。混勾后，1，OOOr/min離心10min，棄上清。用手 指輕輕拍打管底，將沉淀細胞彈成泥漿。在以下各步試驗中應保持離心管置于含37°C滅菌 CldH2O的燒杯中。
[0069] S2.吸取37°C預熱的Iml 50% PEG-1000細胞融合劑，在Imin內加至細胞泥漿， 靜止lmin。接下來開始滴加 DMEM基礎培養基以終止融合，在第一個Imin內加 lmL，第二個 Imin內加2mL，第三個Imin內加3mL，第四個Imin內加4mL，第五個Imin內加5mL。在進行 這步操作時要均勻緩慢滴加培養基和輕輕晃動離心管。最后用DMEM基礎培養基緩慢補加 至40mL。輕輕混勾后，1，000r/min離心10min，棄上清。緩慢加入HAT選擇性培養液并輕輕 搖勻；將融合后的細胞加到已鋪好飼養細胞的96孔板中，每孔100 yL，于37°C、5% CO2細 胞培養箱中培養。使用HAT培養液每3d半量換液一次。待培養孔中出現細胞集落且長至 孔底面積約20%~30%時，及時采集這些孔的上清液，鑒定是否有特異性抗體產生。第IOd 以后，采用HT培養液半量換液。第17d以后采用完全DMEM培養基培養細胞。
[0070] S3.陽性雜交瘤細胞株的亞克隆
[0071 ] 在融合細胞集落長到孔底面積20 %~30 %時，采用間接ELISA方法對有融合細胞 生長的細胞培養上清液及時鑒定，以確定其中是否存在針對H3N2CIV的特異性抗體。方法 同上述步驟5。不同之處為，一抗采用融合細胞培養上清液。試驗中同時取骨髓瘤細胞培養 上清液、免疫小鼠陽性血清及正常小鼠血清做對照，陽性孔需及時進行下一步的亞克隆和 擴大培養。
[0072] 在陽性孔細胞亞克隆化前一天，使用完全DMEM培養基在96孔板內制備好飼養層 細胞，IO 4個/100 μ L/孔。用完全DMEM培養基將待亞克隆的細胞從培養板輕輕沖下，計算 細胞數。采用有限稀釋法將細胞逐步均勻稀釋至10個/mL，加至含飼養細胞的96孔培養板 中，100 μ L/孔。每天觀察細胞狀態，第4d時，用完全培養基半量換液。待雜交瘤細胞長至 孔底面積20%~30%時，用間接ELISA法再次檢測上清。從中選取僅單個細胞集落生長且 陽性值較高孔進行第二次亞克隆。之后如此重復，直至所有克隆細胞孔都為陽性。獲得穩 定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株后，先用24孔細胞板，再用6孔細胞板及時逐步擴大培 養并凍存（_8〇°C冰箱中梯度過夜降溫后，轉移至液氮罐內，長期保存備用）。
[0073] 實驗結果：將融合后的細胞分裝于4塊96孔細胞培養板中，經HAT培養液的選擇 性培養，細胞于融合后前2d有大量死亡，從第5d開始出現雜交瘤細胞，如圖2。待其長至孔 底面積約20%~30%時，取培養上清液進行ELISA檢測，結果見表4至表8。
[0074] 表4細胞融合后第lid ELISA檢測結果（第1板）
[0075]
[0076]
[0077] 表5細胞融合后第lid ELISA檢測結果（第2板）
[0078]
[0079] -表6細胞融合后第η天的ELISA檢測^果Z第3板)-' ' ' '
[0080]
[0081]-表7細胞融合后第11天的ELISA檢測結果（第4板)
[0084] 表8各板對照組檢測結果
[0085]
[0086] 注：小鼠陽性血清均提前稀釋40, 000倍。
[0087] 根據表4至表8的數據并結合顯微鏡觀察，對11株陽性孔雜交瘤細胞進行第一次 亞克隆。其中，僅2C5(第2板的C5孔）第一次亞克隆后有陽性孔，其它株未篩出陽性。對 2C5使用有限稀釋法連續進行第二次和第三次亞克隆，陽性率均為100%。三次亞克隆的檢 測結果見表9。
[0088] 表9 2C5的亞克隆檢測結果
[0089]
[0090] 注：各次亞克隆中，小鼠陽性血清均提前稀釋20, 000倍。其中，El為小鼠陽性血 清對照，E2為小鼠陰性血清對照，Fl為SP2/0細胞上清對照，F2為空白對照。
[0091] 將2C5進行保藏，該細胞株于2015年5月13日保藏在中國典型培養物保藏中心， 雜交瘤細胞株命名為H3N2-CIV-HA-2C5,保藏編號為CCTCC C201555。
[0092] 實施例2單克隆抗體的制備
[0093] 雌性BALB/c小鼠腹腔內注射FICA，0. 5mL/只。7d后用滅菌生理鹽水洗滌懸浮對 數期生長的雜交瘤細胞2C5 (取對數生長期細胞培養液上清，測定McAb效價），細胞密度調 至2 X IO6個/mL。每只小鼠腹腔注射0. 5mL細胞懸液，逐日觀察小鼠腹部是否膨大，待其明 顯鼓起時抽取腹水，置于EDTA處理過的