一種無血清培養基及其配制方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種無血清培養基及其配制方法，屬于細胞培養技術領域。
【背景技術】
[0002]無血清培養基是指不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基，可以應用于培養免疫細胞，例如淋巴細胞(例如，T淋巴細胞、B細胞、NK細胞等)、樹突狀細胞(也稱DC細胞)、單核/巨噬細胞等。
[0003]通常來說，免疫細胞在體外存活和擴增所需要的營養物質包括:白蛋白、轉鐵蛋白、胰島素、氨基酸、維生素、糖、脂質、無機鹽、生長因子等。這些成分中，白蛋白對細胞生長和存活的影響最大，也是功能和組成最復雜的成分。而無血清培養基中，白蛋白所發揮的功能主要是由它所攜帶的脂肪酸和微量元素等成分決定的。
[0004]不同來源的白蛋白，例如不同種屬的牛白蛋白和人白蛋白，它們所攜帶的脂肪酸差異很大；例如，重組白蛋白與人血白蛋白所攜帶的脂肪酸不同；例如在重組白蛋白中，水稻胚乳提取的與酵母菌發酵生產的重組白蛋白所攜帶的脂肪酸不同；不同產地的，也有不同。另外，后期生產加工過程也會造成白蛋白所攜帶的脂肪酸差異，例如不同生產廠家生產的、不同的批次的白蛋白所攜帶的脂肪酸也有很大的不同。總之，以上這些差異就導致添加了白蛋白的無血清培養基的成分復雜、不穩定。
[0005]無血清培養基中添加的白蛋白，其所攜帶的脂肪酸被細胞攝取后，用于構建細胞膜結構、信號傳導分子、轉化成能量、或者參與其它物質的合成等。因此，培養基中的白蛋白所攜帶的脂肪酸的差異會影響到免疫細胞的生長增殖、細胞功能等各個方面。特別是，往往某些脂肪酸含量過高或過低也會不利于免疫細胞的增殖及其殺傷活性，比如過高含量的亞麻酸或過低含量的亞油酸對免疫細胞增殖和殺傷活性不利。
[0006]特別是，對于淋巴細胞來說，體外富集、活化，并擴增淋巴細胞，可用于回輸治療多種諸如惡性腫瘤、感染、自身免疫病的疾病。然而，在體外擴增的過程中，需要用到適宜體外支持淋巴細胞存活和擴增的培養基。
[0007]目前，一些文獻公開了一些無血清培養基，例如適合培養T淋巴細胞和DC細胞的無血清培養基，但都沒有公開針對白蛋白的組成復雜性的解決方案。

【發明內容】

[0008]鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發明提供了一種成分更穩定的無血清培養基及其配制方法，改善了因白蛋白的組成復雜性而導致的培養基成分不穩定的情況。
[0009]本發明一方面提供了一種無血清培養基的配制方法，所述無血清培養基包括基礎培養基和適用于所述無血清培養基的血清替代物，所述血清替代物包括白蛋白、人轉鐵蛋白、胰島素和膽固醇，該配制方法包括以下步驟:步驟一，獲取無脂肪酸白蛋白；步驟二，將脂肪酸負載到所述無脂肪酸白蛋白上以獲得白蛋白溶液；步驟三，配制無血清培養基:將步驟二所獲得白蛋白溶液，以及除白蛋白以外的其他血清替代物溶解到所述基礎培養基中，以獲得無血清培養基。
[0010]優選的，所述步驟二中，將特定的脂肪酸負載到所述無脂肪酸白蛋白上；所述特定的脂肪酸包含棕櫚酸和/或硬脂酸、油酸和亞油酸；所述步驟二中，按照每Immol無脂肪酸白蛋白添加0.l-2mmol的棕櫚酸和/或硬脂酸，0.l-2mmol的油酸和0.l-2mmol的亞油酸的比例，將所述特定的脂肪酸添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液中混合，以獲得白蛋白溶液。
[0011]優選的，所述特定的脂肪酸還包含花生四烯酸，所述花生四烯酸與所述亞油酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0012]優選的，所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和硬脂酸、油酸和亞油酸，所述硬脂酸與所述棕櫚酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0013]優選的，步驟二中，將所述特定的脂肪酸用無水乙醇溶解后，再添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液，在0-37.5°C攝氏度的條件下，攪拌混合達4小時以上。
[0014]優選的，步驟三中，按照每IL基礎培養基添加0.015?0.15mmol白蛋白的比例，將步驟二所獲得的白蛋白溶液添加到基礎培養基中。
[0015]優選的，采用樹脂吸附或活性炭吸附的方法將白蛋白上所攜帶的脂肪酸去除，以獲得無脂肪酸白蛋白。
[0016]優選的，所述的白蛋白為牛血清白蛋白、人血白蛋白或重組人血白蛋白。
[0017]優選的，所述的重組人血白蛋白為水稻胚乳表達的重組人血白蛋白或者轉基因酵母菌表達的重組人血白蛋白。
[0018]其中，植物源重組人血白蛋白是指利用基因重組技術在植物中表達的人血白蛋白，例如，武漢禾元生物科技有限公司生產的重組人血白蛋白(OsrHSA);轉基因酵母菌表達的重組人血白蛋白是指利用基因重組技術在酵母菌中表達的人血白蛋白，例如，華北制藥集團有限責任公司生產的重組人血白蛋白。
[0019]優選的，所述的基礎培養基為IMDM培養基，以基礎培養基的體積為基準，所述人轉鐵蛋白的添加量為I?100mg/L，所述胰島素的添加量為I?100mg/L，所述膽固醇的添加量為I?10mg/Lo
[0020]優選的，所述血清替代物還包含乙醇胺，其添加量為I?10mg/L，以基礎培養基的體積為基準。
[0021]優選的，步驟三中，將所述無血清培養基的pH值調節到6.8?7.5之間。
[0022]本發明另一方面還提供了一種無血清培養基，所述無血清培養基包括基礎培養基和適用于所述無血清培養基的血清替代物，所述血清替代物包含白蛋白、人轉鐵蛋白、胰島素和膽固醇，所述白蛋白是通過在無脂肪酸白蛋白上負載脂肪酸而形成的。
[0023]優選的，所述白蛋白是通過在無脂肪酸白蛋白上負載特定的脂肪酸而形成的；所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和/或硬脂酸、油酸和亞油酸；按照每Immol無脂肪酸白蛋白添加0.l-2mmol的棕櫚酸和/或硬脂酸，0.l_2mmol的油酸和0.l_2mmol的亞油酸的比例，將所述特定的脂肪酸添加到所述無脂肪酸白蛋白的溶液中混合而形成。
[0024]優選的，所述特定的脂肪酸還包括花生四烯酸，所述花生四烯酸與所述亞油酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0025]優選的，所述特定的脂肪酸包括棕櫚酸和硬脂酸、油酸和亞油酸，所述硬脂酸與所述棕櫚酸的添加量的比值為1:6?1:1。
[0026]優選的，所述無血清培養基中，所述白蛋白的添加量為0.015?0.15mmol/L，以基礎培養基的體積為基準。
[0027]優選的，所述的白蛋白為牛血清白蛋白、人血白蛋白或重組人血白蛋白。
[0028]優選的，所述的重組白蛋白為水稻胚乳表達的重組人血白蛋白或者轉基因酵母菌表達的重組人血白蛋白。
[0029]優選的，所述的基礎培養基為IMDM培養基，以基礎培養基的體積為基準，所述人轉鐵蛋白的添加量為I?100mg/L，所述胰島素的添加量為I?100mg/L，所述膽固醇的添加量為I?10mg/Lo
[0030]優選的，所述血清替代物還包含乙醇胺，其添加量為I?10mg/L，以基礎培養基的體積為基準。
[0031]優選的，所述無血清培養基的pH值為6.8?7.5。
[0032]本發明再一方面還提供了上述的配制方法所配制的無血清培養基或者上述的無血清培養基在培養免疫細胞方面的應用。
[0033]優選的，所述的免疫細胞為淋巴細胞或DC細胞。
[0034]優選的，所述的淋巴細胞為T淋巴細胞或NK細胞。
[0035]本發明的無血清培養基配制方法，將脂肪酸負載到無脂肪酸白蛋白上后，再將獲得的成分穩定的白蛋白溶液添加到基礎培養基中，由此獲得的無血清培養基成分更穩定，功能一致性更好，不會因白蛋白的種屬來源或加工批次的差異有所不同。
【附圖說明】
[0036]圖1為實施例1?4的無血清培養基的細胞增殖能力的結果；
[0037]圖2為對比例I?4的無血清培養基的細胞增殖能力的結果；
[0038]圖3為實施例1?11與對比例5?7的無血清培養基的細胞增殖能力的結果；
[0039]圖4為實施例1?11與對比例5?7的無血清培養基的淋巴毒性實驗的結果；
[0040]圖5為實施例2與對比例5?7的無血清培養基的DC細胞培養計數結果。
【具體實施方式】
[0041]以下通過實施例對本發明作進一步的說明，但本發明并不限于這些【具體實施方式】。
[0042]實施例1?4
[0043]實施例1?4的無血清培養基的配制過程如下:
[0044]步驟一:獲取無脂肪酸白蛋白；
[0045]實施例1取牛血清白蛋白(購自SIGMA公司的A1933產品)1.5mmol，加注射用水配成2000ml溶液，加入50g活性炭，混勻；采用2mol/L的鹽酸溶液調pH值到pH3.0 ;置于56°C水浴中30分鐘或4°C放置過夜；離心處理(4000轉/分鐘)去除活性炭；再用2mol/L的NaOH溶液調pH值到pH7.0 ;最后過濾除菌獲得實施例1的無脂肪酸白蛋白溶液；
[0046]實施例2取人血白蛋白(購自基立福(Grifols)公司的人血白蛋白(產品規格為20% 50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過5mol/mol白蛋白))1.5mmol，具體操作過程同實施例1，獲得實施例2的無脂肪酸白蛋白溶液；
[0047]實施例3取人血白蛋白(購自武漢生物制品研宄所有限責任公司的人血白蛋白(產品規格20% 50ml*10g/瓶，其中辛酸鈉的含量不超過10mol/mol白蛋白))1.5mmol，具體操作過程同實施例1，獲得實施例3的無脂肪酸白蛋白溶液；
[0048]實施例4