一種共表達口蹄疫病毒vp1基因與免疫佐劑牛il-6基因的重組乳酸桿菌及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種重組乳酸桿菌及其制備方法和應用，特別涉及一種共表達口蹄疫 病毒VPl基因與免疫佐劑牛IL-6基因的重組乳酸桿菌及其制備方法和應用，屬于生物技術 領域。
【背景技術】
[0002] 黏膜免疫系統是一種局部免疫系統，主要由局部黏膜組織及免疫活性細胞組成。 黏膜免疫即黏膜免疫系統在病原體等抗原的刺激下，誘導的免疫應答反應。機體與外界抗 原接觸機會最多，面積最廣的就是機體的黏膜表面，因此，黏膜免疫系統是機體的第一道免 疫屏障。口蹄疫引起的黏膜免疫主要特征是在感染早期就產生分泌型IgA，在口蹄疫病毒感 染最初的幾天內，機體尚不能產生特異性的體液免疫反應，此時機體的主要保護能力就是 黏膜免疫系統分泌的SlgA以及起屏障作用的上皮細胞和內皮細胞，機體是發病還是隱性 感染很大程度上取決于黏膜免疫保護能力的高低。由于口蹄疫可通過呼吸道傳播，因而研 宄黏膜免疫對于預防口蹄疫有潛在的重要意義。
[0003] 研宄者對豬進行試驗，發現免疫后的豬在與自然毒接觸時，IgA含量高的豬實驗組 有較好的保護率（Eble，etal，2007)。有研宄報道，構建口蹄疫VPl表達載體，與CTB結合， 通過黏膜免疫途徑免疫豬和小鼠，結果發現，黏膜免疫能夠誘導產生IgA，試驗豬感染半數 致死量的毒，發現保護率可以達到80% (Song，etal，2005)。對于通過消化道和呼吸道感染 的傳染病而言，黏膜免疫具有重要的意義：能夠誘導局部黏膜免疫應答的發生和SlgA的分 泌，在入侵和感染部位抵抗病原菌，同時也能誘導體液免疫和細胞免疫。研宄表明，黏膜免 疫應答產生的抗體比血清中的抗體出現的時間早，持續時間長，在預防和抵抗病原微生物 方面起到非常重要的作用。
[0004] 黏膜免疫的研宄發展，使活菌載體疫苗成為疫苗研宄中的熱點。活細菌載體疫苗 能在黏膜表層誘導黏膜免疫應答的發生，刺激SlgA的產生，將病原菌阻擋在體外。乳酸菌 作為機體內的正常菌群，能長期的定植于機體內發揮其促進營養物質分子降解和吸收、維 持腸道內菌落平衡、調節免疫系統作用等益生作用和免疫佐劑作用，這使得其成為細菌活 載體疫苗研宄中載體的有力候選菌株。近年來，隨著分子生物學的發展和對乳酸菌認識的 加深，乳酸菌用于活載體疫苗的研宄取得很大進展。乳酸菌表達系統已經成功用于豬流行 性腹瀉、新城疫、破傷風、輪狀病毒等活載體疫苗的研宄。
[0005] Akinobu Kajikawa等構建了兩株重組嗜酸乳桿菌，通過不同銷定結構，來展示沙 門氏菌鞭毛蛋白（FliC)。其中一個例子，沙門氏菌鞭毛蛋白（FliC)融合到細胞被膜蛋白 酶的C-末端區域，靜電結合到細胞壁。另一個例子中，沙門氏菌鞭毛蛋白（FliC)與與粘液 結合蛋白的錨定區共軛連接，通過LPXTG結構域與細胞壁連接。這兩種重組乳酸桿菌的菌 體表面展示方式導致了髓樣樹突狀細胞的不同成熟情況以及髓樣樹突狀細胞的細胞因子 分泌。表面展示的抗原對模擬的胃和小腸液環境非常敏感。將重組乳酸桿菌與碳酸氫鹽緩 沖液以及大豆胰酶抑制劑混合，細胞壁表面抗原可以抵抗體外胃環境模擬實驗時的酶解作 用。保護試劑的使用可以提高乳酸桿菌在模模擬消化液的生存能力。這些結果證明了在口 服黏膜免疫的過程中，保護菌體及其表面展示抗原的重要性。
[0006] Xu等構建了共表達經典豬瘟⑶8+CTL表位290和豬細小病毒VP2抗原的基因工程 乳酸桿菌并分析其作為豬口服疫苗的免疫效果。研宄數據表明，在沒有任何佐劑的情況下， 重組乳酸桿菌能有效的誘導黏膜和系統免疫應答來預防經典豬瘟。同時，重組乳酸桿菌也 能誘導抗ppv_vp2的血清抗體IgG和黏膜抗體IgA的產生。這些結果暗示了，在未來經典 豬瘟和豬細小病毒病疫苗的發展中，重組乳酸桿菌微生態制劑是一種有價值的策略。
[0007] Tae-Young Lee等成功構建表達人乳頭瘤病毒16型E6蛋白抗原的基因工程干酪 乳酸桿菌L. caSei-PgSA-E6, 口服接種小鼠，結果表明該基因工程干酪乳酸桿菌在小鼠體內 引起T細胞介導的細胞免疫和抗癌抗菌素效應。
[0008] IL-6有促進漿細胞分化和B細胞產生抗體的作用，還有促進鼠原生細胞和人骨髓 瘤細胞的生長的作用。在抗感染過程中，IL-6是主要的促炎癥細胞因子，可促進CD4細胞 分化的作用。IL-6是多功能細胞因子，由抗原遞呈細胞表達如DC細胞、吞噬細胞、B細胞和 其它造血系統的細胞，但也包括一些非造血系統的細胞如角蛋白細胞、成纖維細胞、上皮細 胞、星形細胞。本研宄中，我們成功克隆了牛的IL-6基因，從而為牛IL-6作為疫苗分子佐 劑提供了理論依據。
[0009] 因此，本申請通過構建共表達Asial型口蹄疫病毒VPl基因與免疫佐劑牛IL-6 的重組乳酸桿菌表達載體pSIP/Asial/VPl/IL-6,并將該重組載體電轉化導入到乳酸桿菌 NC8中，利用導入成功的乳酸桿菌NC8表達Asial型口蹄疫病毒VPl基因與免疫佐劑牛IL-6 基因，免疫學檢測證實外源基因在乳酸菌中獲得了表達，并且具用反應原性，而且重組基因 工程乳酸菌可以在黏膜表層誘導黏膜免疫應答的發生，刺激SlgA的產生，將病原菌阻擋在 體外。本申請旨在利用乳酸菌構建共表達Asial型口蹄疫病毒VPl基因與免疫佐劑牛IL-6 的活載體疫苗，通過黏膜免疫途徑免疫實驗動物，研宄該疫苗的黏膜免疫情況，為下一步研 制Asial型口蹄疫病毒口服基因工程疫苗提供理論基礎和實驗依據。

【發明內容】

[0010] 相對于大腸桿菌原核表達系統，乳酸菌表達系統還不夠成熟，主要表現在外源蛋 白的表達量較低、乳酸菌的某些遺傳背景不夠清楚，操作比較繁瑣，表達條件相對不夠穩定 等，本發明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供一種高效表達Asial型口蹄疫病毒 VPl基因與免疫佐劑牛IL-6的重組乳酸桿菌載體系統，提高外源基因表達量，而實現口服 免疫的效果。
[0011] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的：
[0012] 一種共表達口蹄疫病毒VPl基因與免疫佐劑牛IL-6基因的重組乳酸桿菌，其特征 在于，所述重組乳酸桿菌含有由在N端引入改造的乳酸桿菌信號肽基因的口蹄疫病毒VPl 基因序列與免疫佐劑牛IL-6基因序列連接在一起而得到的融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
[0013] 含有該核苷酸序列的表達載體pSIP/Asial/VPl/IL-6也當然屬于本發明的保護 范疇之內。
[0014] 在本發明中，優選的，改造的乳酸桿菌信號肽基因借一連接短肽GSGGSGG與口蹄 疫病毒VPl基因進行連接，連接后的基因序列再與免疫佐劑牛IL-6基因序列進行融合。
[0015] 在本發明中，優選的，所述的口蹄疫病毒為Asial型口蹄疫病毒。
[0016] 制備所述的重組乳酸桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0017] (1)利用提高N端正電荷和H區疏水性的方法，對乳酸桿菌信號肽的結構進行改 造，將改造的乳酸桿菌信號肽基因借一連接短肽GSGGSGG與口蹄疫病毒VPl基因進行連接， 連接后的基因序列再與免疫佐劑牛IL-6基因序列進行融合，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示；
[0018] (2)將融合后的基因序列插入大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體中，構建重組質粒 pSIP/Asial/VPl/IL-6 ；
[0019] (3)將pSIP/Asial/VPl/IL-6重組質粒轉化至乳酸桿菌。
[0020] 在本發明中，優選的，采用反轉錄PCR方法擴增牛IL-6基因，所用引物序列為：
[0021] 上游引物：5' -AAGCTTATGAATTCTAGATTTACTTCCGCTTTCACC-3' ；
[0022] 下游引物：5 ' - CTCGAGCTTCATCCTGATGGCCCTCAACGAG-3 '。
[0023] 在本發明中，優選的，步驟（3)將重組質粒pSIP/opti-FMDV-A/VPl電轉化導入 到乳酸桿菌NC8中，電轉化后的乳酸桿菌NC8涂布于MRS培養基上，在37°C培養箱中培 養24h-72h，將平板上的菌落挑斑后分別于MRS液體培養基中過夜培養，將上述菌液