專利名稱：枸杞多糖分離純化新技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程制藥領域。
背景技術：
中國藥典1977年以后版本明確藥用枸杞是寧夏枸杞Lycium barbaum L.的干燥成熟果實。亦稱枸杞子。醫學界通過藥理和臨床試驗研究，認為寧夏枸杞中的主要生物活性物質是枸杞多糖(Lycium Barbarum polysaccharida.LBP)，是一種非特異性的免疫增強劑，能提高機體免疫功能，增強抗病能力，從而達到抗衰老、抗氧化、抗肝炎、抗腫瘤以及抗艾滋病等作用。
現有技術對枸杞多糖(LBP)的分離純化，一般選用干枸杞子作原料，采用“劃分沉淀法”，即利用溶解度不同，加入乙醇調節不同濃度來劃分沉淀，即“乙醇沉淀法”提取枸杞多糖(粗品)。然后，在實驗室里應用高壓液相色譜儀或制備型高壓液相色譜儀的小規格層析柱，采用傳統經典的“柱層析方法”，先用DEAE柱層析脫色去雜。流動相洗脫液選用梯度摩爾濃度的不同堿液進行洗脫，由于上述化學反應原因產生了‘鹽’，再用裝填吸水量小、顆粒小的Sephadex柱脫鹽，如Sephadex G-25柱；此后，再用裝填吸水量大、顆粒大的Sephhadex柱層析分離，如Sephadex G-100、G-300等柱。由于采用梯度摩爾濃度的堿液洗脫，在紫外監測器的紫外圖譜460nm處，出現吸收峰值，即被命名為一個‘枸杞多糖’組份。這樣一來每個不同的堿液或不同梯度的摩爾濃度洗脫液洗脫，都會在460nm波長處出現一個吸收峰值，即枸杞多糖或枸杞多糖組份。故此，國內各個實驗室課題組分離純化出了很多枸杞多糖或枸杞多糖組份，其分子量亦不同，六個單糖組成的排列順序和摩爾比值亦不相同。普遍認為枸杞多糖是一個復合多糖。

發明內容
枸杞多糖分離純化新技術。主要是突破了傳統經典的“柱層析方法”。首先，原料未使用枸杞子以“乙醇沉淀法”提取分離的枸杞多糖(粗品)；而采用了使用新鮮枸杞漿果用“膜分離提取技術”、“真空冷凍干燥”等先進新技術，分離提取的枸杞多糖(粗品)作原料。
本發明的技術方案是這樣的枸杞多糖(粗品)用雙蒸餾水溶解→加入DEAE柱，雙蒸餾水常壓、恒量，洗脫。紫外檢測器監控→再常壓、恒量，進入串聯的DEAE柱，脫色、去雜質。紫外檢測器監控→洗脫液高壓(≤5MPa)、恒量加入Sephadex G-100柱→雙蒸餾水高壓(≤5MPa)、恒量洗脫，紫外檢測器監控→在紫外圖譜波長553.6nm處出現吸收峰值，收取洗脫液→真空冷凍升華干燥→白色疏松絮狀纖維結晶—-枸杞多糖(LBP)。
DEAE柱層析、Sephadex G-100柱層析，流動相洗脫液選擇了雙蒸餾水。這一點是非常重要的！是分離純化出的LBP除去雜質。DEAE柱裝填采用濕法裝填，用雙蒸餾水把DEAE調制成均勻的漿液，自然壓力均勻裝填，不要使層析時出現湍流現象。整個層析過程都在紫外檢測器監控之下。(其紫外圖譜見附圖
一、二)3、LBP(粗品)經DEAE柱層析脫去色素、雜質后，再用Sephadex G-100柱進行分離純化。層析柱裝填的交聯葡聚糖凝膠(Sephadex)，實際是一種分子篩，由于含有大量的羥基，故有親水特性，能在水解質中溶漲成凝膠粒子。當有分子大小不同的物質溶液通過網狀結構的凝膠粒時，小分子物質自由擴散于凝膠粒的孔隙中，大分子物質則被排阻于凝膠粒外。在加入洗脫液(通常為水、鹽類或一定PH緩沖液)向下移動時，各種大小分子物質在兩相中不斷擴散與排阻，隨著不同物質的分配系數(kd)不同，則最大分子的物質最先流出，最后流出的是含有最小分子量物質的洗脫液。故此，依次分段收集，可以得到各種分子量的區斷。然后，用加適當的有機溶劑使多糖析出或用真空冷凍干燥方法獲得多糖。
由于枸杞多糖的分子量在9900d～88000d之間，而交聯葡聚糖凝膠G-100分離多糖的范圍在分子量1000d～100000d之間。故此，選擇Sephadex G-100是最合適的選擇。
Sephadex柱裝填采用濕法裝填，用雙蒸餾水把Sephadex調制成均勻的漿液，然后用快速的高壓氮氣脈沖裝填。這有利于色譜分離時分離柱的基線穩定；能使裝好的制備柱與裝柱器分離時柱層結構不破壞。
Sephadex柱層析進樣和洗脫都要使用可以恒量的高壓泵，小規格柱使用柱塞泵，大規格柱使用蠕動泵。壓力最高控制在5Mpa。
整個層析過程都在紫外檢測器監控中，由于進行了多次重復科學試驗，可以認定在紫外波長553.6nm處的吸收峰值圖譜為枸杞多糖的指紋圖譜。(見附圖三)同時，在Sephadex柱層析的試驗過程中，我們發現在紫外波長553.6nm處，枸杞多糖的吸收峰值與枸杞多糖含量的多少呈線性關系。這就為枸杞多糖含量多少的測定，探索到了一個可靠的科學檢測方法即以LBP(純品)作為標準樣，使用高壓液相色譜(HPLC)儀紫外檢測器在553.6nm波長處的吸收峰面積，與枸杞多糖的線性關系，制定了“HPLC法”檢測LBP含量新方法。(另外申報專利)4、LBP(粗品)經DEAE柱、Sephadex柱層析后，洗脫液經過真空冷凍干燥，即獲得白色疏松絮狀纖維結晶—枸杞多糖(LBP)。真空冷凍干燥設備必須具備條件如下復合制藥醫療衛生要求，可以消毒殺菌；捕水器—-冷阱工作溫度必須保持達到零下60℃以下，才能很好的保證升華干燥進行；在干燥倉中必須具備自動液壓控制真空容器封口裝置，在真空冷凍干燥完成后，開倉門前，將LBP很好的真空密封保存，否則LBP極易吸潮結塊、變質。
5、1000kg新鮮枸杞漿果采用“膜分離—真空冷凍干燥”新技術，可以提取分離LBP(粗品)24kg左右；再采用改進的“DEAE柱、Sephadex柱層析—真空冷凍干燥”新技術，可以分離純化出LBP 1200g。
6、新技術分離純化出的LBP性能特征1)、感官白色疏松絮狀纖維結晶體。極易吸潮，吸潮后為淡黃色，結塊。2)、溶解性極易溶于水；溶于稀堿液；不溶于乙醇、丙酮、氯仿。3)、顯色反應(1)、硫酸-苯酚反應，顯色，呈棕黃色，分解后成單糖。(2)、硫酸-蒽酮反應，呈陽性。(3)、考馬斯亮蘭反應，呈陽性。(4)、斐林試劑反應，呈陰性。(5)、碘-碘化鉀反應，呈陰性。4)、吸收峰值枸杞多糖水溶液，在紫外圖譜波長550nm～560nm處，有最大吸收峰值。在一定的范圍內，吸收峰值與枸杞多糖含量有線性關系。5)、旋光度測定枸杞多糖水溶液，加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉淀；然后上清液中再加入乙醇，使其濃度為20％～25％，離心得第二次沉淀。兩次沉淀物的比旋度相同，說明枸杞多糖為單一組份。6)、凝膠柱層析法鑒定在Sephadex G-100柱層析時，在紫外圖譜波長553.6nm處的吸收峰，是單一的兩側對稱峰形狀。說明枸杞多糖的組份為單一組份。(圖譜見附圖三)7)、層析分離純化的枸杞多糖，LBP含量分析總含量92.41％。(1)、六個單糖總量84.34％。(2)、微量元素含量4.48％。(3)、氨基酸含量3.59％。
權利要求
1.枸杞多糖分離純化新技術，采用改進的‘柱層析方法’、‘真空冷凍干燥方法’從枸杞多糖(粗品)中分離出枸杞多糖(LBP)，其特征在于枸杞多糖(粗品)溶于雙蒸餾水后，然后用DEAE柱進行兩次脫色除去雜質；再用SephadexG-100柱進行分離純化；然后再經過真空冷凍升華干燥，即得到白色疏松絮狀纖維結晶—-枸杞多糖(LBP)純品。
2.根據權利要求1所述，枸杞多糖分離純化新技術，其特征之一在于原料‘枸杞多糖(粗品)’是用新鮮枸杞漿果制備的枸杞原汁，經過膜分離提取和真空冷凍干燥，獲得小于10萬分子量的枸杞多糖(粗品)。其主要特點是LBP含量高；而傳統工藝‘乙醇沉淀法’從枸杞子中分離提取的枸杞多糖(粗品)，在枸杞干制以及乙醇沉淀中多次受化學制劑的作用，對枸杞多糖結構中的糖鏈多少有影響，并且獲得的枸杞多糖中LBP含量很低，雜質偏高，不是分離提取LBP的最合適原料。
3.根據權利要求1所述，枸杞多糖分離純化新技術，其特征之二在于首先，使用改進的DEAE柱進行層析。使用二乙基氨基乙基(DEAE)(OH-型)纖維素柱，串聯兩個柱更好地脫色除去雜質。通過科學試驗，我們已將制備型3、DEAE柱規格，從φ16mm×h 200mm逐步擴大到φ300mm×h 1000mm的大柱，對枸杞多糖(粗品)進行柱層析脫色除去雜質，可以達到工業化制備的規模；DEAE柱裝填采用濕法裝填。
4.跟據權利要求1所述，枸杞多糖分離純化新技術，其特征之三在于在使用DEAE柱層析后，再用Sephadex交聯葡萄糖凝膠G-100進行分離純化。經過科學實驗，我們已經將Sephadex柱規格擴大，從φ16mm×h 200mm，逐步擴大到φ100mm×h 1000mm高壓玻璃柱層析，再擴大即使用不銹鋼層析柱；作為流動相的洗脫液，選擇了雙蒸餾水溶液；Sephadex柱裝填采用濕法裝填，先將Sephadex G-100用雙蒸餾水調制成均勻的漿液，再用高壓氮氣脈沖裝填。在進料和洗脫時，小規格柱用高壓柱塞泵恒量進樣，大規格柱用蠕動泵恒量進樣。壓力要求控制在最高5Mpa。
5.根據權利要求1所述，枸杞多糖分離純化新技術，其特征之四在于DEAE柱和Sephadex層析時，使用制備型高壓液相色譜儀的紫外檢測器進行監控，在553.6nm波長處譜線出現吸收峰值。經多次重復試驗，可以認定SephadexG-100柱層析紫外檢測器553.6nm波長處的吸收峰值譜線圖是枸杞多糖(LBP)的指紋圖譜。
6.根據權利要求1所述，枸杞多糖分離純化新技術，其特征之五在于經DEAE柱和Sephadex柱層析后，再將洗脫液真空冷凍升華干燥，制備得—-白色疏松絮狀纖維結晶枸杞多糖(LBP)純品。要求，真空冷凍干燥設備的捕水器—-冷阱，溫度必須在零下60℃以下才能保證其升華干燥；真空冷凍干燥設備必須具備可以消毒殺菌條件，并且在干燥倉內有液壓自動控制真空封口設備，以保證制備的LBP附合醫藥衛生規定，并且可以在真空狀態下保存不變質。
7.根據權利要求1所述，枸杞多糖分離純化新技術，其特征之六在于DEAE和Sephadex柱層析，洗脫液選擇了雙蒸餾水。傳統工藝一般來說都是使用‘梯度摩爾濃度堿液’進行洗脫，由于堿液的作用，首先就產生了‘鹽’，就要用另外的設備如Sephadex G-25柱進行脫鹽；其二就是使易在堿性、酸性、酶作用下水解的多糖由于堿性作用而水解。即出現了每一個摩爾濃度的堿液洗脫，在紫外監測器460nm處層析分離出一個“枸杞多糖組份”，使枸杞多糖人為的變成復合多糖。而我們使用雙蒸餾水洗脫，不會產生水解作用，組成枸杞多糖的六個單糖的糖鏈不會被打斷，在紫外圖譜波長553.6nm處只出現一個吸收峰值，這個峰是一個以軸線對稱的峰；分離出的LBP水溶液加入乙醇使其濃度為10％，離心得沉淀，然后上清液再加入乙醇使其濃度為20％～25％，離心得沉淀物，兩次沉淀物的比旋度亦相同。證明了分離出的枸杞多糖是單一組份的枸杞多糖(LBP)，純度在92％以上。經檢測分析六個單糖總量84.34％，氨基酸含量3.59％，微量元素含量4.48％。總計92.41％。由于可以認定LBP是單一組份，純度在90％以上，就具備了我們國家規定申報中藥第一類新藥的基本條件。
全文摘要
枸杞多糖分離純化新技術屬生物工程制藥領域。采用新鮮枸杞漿果分離提取的枸杞多糖(粗品)作原料，首先用DEAE兩個柱串聯層析，進行脫色、除去雜質；再用SephadexG－100柱層析，進樣和洗脫使用恒量、高壓(≤5MPa)泵。在柱層析時，洗脫液都使用的是雙蒸餾水，制備柱已經擴大到工業中試規模。層析過程使用了紫外檢測器進行監控，在紫外圖譜波長550mm～560mm處出現吸收峰。洗脫液經真空冷凍升華干燥，獲得白色疏松絮狀纖維結晶——枸杞多糖(LBP)。新技術分離純化的枸杞多糖，LBP含量在92％以上，是單一組份，在SephadexG－100柱紫外波長553.6nm吸收峰值圖譜為LBP的指紋圖譜。
文檔編號C08B37/00GK1448408SQ0210891
公開日2003年10月15日 申請日期2002年4月3日 優先權日2002年4月3日
發明者敖爾戈勒 申請人:敖爾戈勒