一種與小麥葉銹病抗性相關的類甜蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與小麥葉銹病抗性相關的類甜蛋白及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 小麥Linn.)作為重要的糧食作物，在食品工業和農業生產 中占有重要地位（曹亞萍，2008)。小麥葉銹病在中國各大產麥區均普遍發生，是影響小麥 產量和品質的重要病害之一（Bolton et al.，2008)。近年植物基因工程技術發展迅速，以 抗病基因和各類抗病相關基因的克隆和轉化為核心的分子育種途徑已經成為育種的新方 向。
[0003] 病程相關蛋白是指由寄主植物編碼，在病理或病理相關環境下誘導產生的一類 蛋白（Van et al.，1999)。按植物來源、電泳遷移率（分子量）、血清學關系以及氨基酸 序列的同源性為標準的分類體系，可將PRP分為17個家族，即PRl到PR17(Van Loon et al.，2006)。其中，PR5蛋白也被稱為類甜蛋白（Thaumatin-like Protein, TLP)，和非 洲植物西非竹竽￡/a/?ieT7i L.)的甜蛋白在氨基酸序列上有很高的同源 性（Pierpoint et al.，1990)，但兩者的理化性質不相同，甜蛋白具有甜味無抗真菌活性， 類甜蛋白無甜味具有抗真菌活性（Ho et al.，2007);目前已經從很多植物中發現了 PR5 蛋白，例如大豆，玉米，楊樹等，大多數PR5蛋白分子量在24~25KD (姜曉玲等，2012)， 能誘導植物的細胞程序性死亡（programmed cell death, P⑶），增加植物抗逆境能力 (D'angeli et al.，2007;高慶華等，2013)。植物基因組中的PR5基因以基因家族的形 式出現，分布于不同的細胞或組織中。PR5蛋白抗真菌活性非常顯著（姜曉玲等，2012)，參 與超敏反應（HR)和植物系統獲得性反應（SAR)，在植物抵抗生物和非生物的脅迫中扮演著 非常重要的作用。
[0004] 由于小麥基因組相對龐大（1.6X IO9 bp)，且結構復雜，直接從中克隆的防衛基因 數量較少，這些因素很大程度地限制了小麥抗葉銹病機制的研究和抗性資源的儲備利用。 在小麥葉銹菌與寄主互作中PRs基因分子水平研究報道還較少，對小麥中PR5基因的表達 模式進行研究具有重要意義，將明確該基因在小麥抗葉銹病防御反應中發揮的作用，為深 入揭示PR5蛋白參與小麥與葉銹菌互作的分子機制和小麥抗葉銹病分子育種提供基礎資 料。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是在優良的小麥抗葉銹病近等基因系材料TcLrl9中分 離一類病程相關蛋白基因--類甜蛋白基因，明確及表達模式及其與小麥抗葉銹病的相關 性。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明所用引物序列包括TcLrl9PR5_F和TcLrl9PR5_R，由 序列表中上游序列（29個堿基）和下游序列（33個堿基）組成，見表1。
[0007] 表1用于擴增類甜蛋白基因的引物上下游序列
【主權項】
1. 一種用于克隆與小麥葉銹病抗性相關的類甜蛋白基因的引物序列，是由序列表中引 物TcLrl9PR5_F和TcLrl9PR5_R核苷酸序列組成的引物對。
2. 根據權利要求1所述的引物序列在TcLrl9小麥中克隆類甜蛋白基因采 用的擴增反應條件特征在于：所述的PCR反應體系包含100 ng模板cDNA，lOiimol/L引物 liiL，10 mmol/L dNTP 0.5iiL，lU /即 DNA 聚合酶 0.31^，10\?0?緩沖液2.5111，加入 滅菌CldH2O至25 ii L ;PCR反應程序為：94°C預變性I min ;94°C變性30 s，62°C退火I min， 72°C延伸 2 min，35 個循環；72°C延伸 10 min。
3. 根據權利要求2所述，明確獲得的類甜蛋白基因的結構特征：該序列不含內含子， 開放閱讀框（open reading frame, 0RF)長516 bp，編碼171個氨基酸殘基，屬于糖苷水 解酶 64 家族類甜蛋白超家族（glycoside hydrolases of family 64-thaumatin-like proteins, GH64-TLP-SF),具有一個甜蛋白保守結構域（thaumatin, THN)，，與小麥 aestira? Lina )PR5 蛋白相似性為 92%，與燕麥 satiFah 高梁（SbrgAtt? 辦icoJror)、玉米（Zea 和大麥（//orofewfi? 等植物PR5蛋白的氨基酸序列相 似性在80%左右。
4. 根據權利要求3所述，明確基因在小麥中的時間和空間表達模式；特征 為：實時熒光定量PCR分析表明，在接種葉銹菌后不同時間點，該基因在非親和組合中表達 量比親和組合中高，表明基因的表達受小麥葉銹菌誘導，且莖部表達量高于葉 部和根部表達量，同時明確其表達受脫落酸（abscisic acid, ABA)和水楊酸（salicylic acid，SA)逆境信號分子的誘導。
5. 根據權利要求3和4,基因可能在小麥抗葉銹病防御反應中發揮作用，將 為深入探討小麥與葉銹菌互作的分子機理提供基礎資料，為培育抗葉銹病小麥品種提供理 論依據。
【專利摘要】本發明公開了一個與小麥葉銹病抗性相關的類甜蛋白基因TcLr19PR5及其編碼的蛋白。是應用RT-PCR及電子克隆技術在小麥中克隆了一個516bp的類甜蛋白基因，編碼171個氨基酸殘基；實時熒光定量PCR分析表明，在接種葉銹菌后不同時間點，該基因在非親和組合中表達量比親和組合中高，表明其表達受小麥葉銹菌誘導，且莖部表達量高于葉部和根部表達量，同時明確其表達受脫落酸（abscisic acid，ABA）和水楊酸（salicylic acid，SA）逆境信號分子的誘導。本發明將為深入探討小麥與葉銹菌互作的分子機理提供基礎資料，為培育抗葉銹病小麥品種提供理論依據。
【IPC分類】C12N15-11, C12N9-24, C12N15-56
【公開號】CN104862307
【申請號】CN201410066121
【發明人】王海燕, 劉大群, 高琳
【申請人】河北農業大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2014年2月26日