一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法，特指離子液體氯化膽堿[Ch]ci和無機磷酸鹽K3PO4組成的離子液雙水相體系用于真菌多糖和蛋白質的選擇性分離，屬于生物活性物質分離純化技術領域。
【背景技術】
[0002]真菌多糖的分離純化方法有很多，如乙醇分級沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜和膜過濾等，研宄者必須根據多糖的性質選擇正確的分離純化方法，才能夠獲得均一的活性成分。其中，乙醇分級沉淀是一種簡單且行之有效的方法，但在提取多糖的同時蛋白質也隨之沉淀下來，而且蛋白質含量隨乙醇濃度增加而增加，這為后續多糖純化帶來一定困難。此外，離子交換色譜和凝膠過濾色譜是多糖分離純化過程中應用最普遍的一種方法，但純化過程具有耗時長、費用高、產品回收率低、溶劑用量大和操作繁瑣等缺點，因而限制了真菌多糖的工業化應用和開發。
[0003]近年來，作為一種高效而溫和的新型綠色分離體系，離子液雙水相體系結合了離子液體和雙水相萃取的優點，廣泛地應用于蛋白質、抗生素、生物堿、藥物、小分子有機化合物的分離和純化，而且在分離過程中保持了原有生物物質的活性及構象。特別地，國內外科技工作者通過咪唑類離子液體如1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([Bmim]BF4)和無機鹽組成的雙水相體系用于多糖和蛋白質的選擇性分離。然而，隨著人們對離子液體研宄的逐步深入，越來越多的報道發現被廣泛應用的咪唑類和吡啶類離子液體對生物體具有不同程度的毒害。研宄發現，膽堿類離子液體是一種生物相容性好的離子液體，且來源廣泛、便宜易得。因此，利用具有生物相容性的膽堿離子液體組成雙水相體系用于生物活性物質的分離具有十分重要的意義。
[0004]經檢索，目前還未見利用氯化膽堿[Ch]Cl和無機磷酸鹽K3PO4構成的離子液雙水相體系用于多糖和蛋白質選擇性分離的報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法，以實現“綠色”、高效、選擇性分離真菌多糖和蛋白質。
[0006]為了解決以上技術問題，本發明利用膽堿離子液雙水相體系用于真菌多糖和蛋白質的選擇性分離，以上層離子液相中蛋白質和無機鹽相中多糖提取率為指標，優化分離條件。具體技術方案如下:
一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法，其特征在于包括以下步驟:
步驟一，脫脂:將真菌菌絲體或子實體粉碎后置于索氏抽提器中，加入石油醚，沸程30~60°C，35°C回流6 h ;如此脫脂兩次后，自然晾干得脫脂后的真菌菌絲體或子實體；
步驟二，制備真菌水提物:將步驟一中所述脫脂后的真菌菌絲體或子實體按1:10 g/mL的料液比加入蒸飽水中，95°C回流提取8 h，再在轉速為5000 rpm條件下離心10 min，濃縮，蒸餾水透析48 h后冷凍干燥得真菌水提物；
步驟三，利用離子液雙水相體系選擇性分離真菌多糖和蛋白質:將步驟二中所述的真菌水提物配成質量濃度為10 mg/mL的真菌水提物水溶液，取1.0 mL真菌水提物水溶液加入到雙水相體系中，再置于20°C恒溫水浴中振蕩30 min，離心，分離上下兩相即含有真菌多糖的下層無機鹽相和含有蛋白質等雜質的上層離子液相；
所述的雙水相體系由離子液體氯化膽堿[Ch] Cl、無機磷酸鹽K3PO4和蒸餾水組成，所述離子液體氯化膽堿[Ch]Cl、無機磷酸鹽K3POjP蒸餾水的質量比例為:0.25-0.5:0.7-1.0:1.0 ；
步驟四，制備真菌多糖:將步驟三中所述的含有真菌多糖的下層無機鹽相蒸餾水透析48 h，利用濃度為95%的乙醇對真菌多糖透析液進行沉淀；所述乙醇的體積是真菌多糖透析液的4倍；4°C靜置過夜，再在轉速為5000 rpm的條件下離心10 min，收集沉淀物后冷凍干燥，得真菌多糖；
步驟五，回收離子液體:將步驟三中所述含有蛋白質等雜質的上層離子液相用二氯甲烷萃取3~5次，二氯甲烷相濃縮時溫度彡45°C，回收離子液體[Ch]Cl。
[0007]所述真菌為桑黃、香菇、靈芝、灰樹花、冬蟲夏草、金針菇、杏鮑菇中的任一種。
[0008]本發明具有有益效果。本發明通過將由[Ch]CVK3PO4組成的離子液雙水相體系用于真菌多糖和蛋白質的選擇性分離，以上層離子液相中蛋白質和無機鹽相中多糖提取率為指標，從而優化了分離條件，達到“綠色”、高效、選擇性分離桑黃多糖和蛋白質的目的。本發明的膽堿離子液雙水相體系適合于大規模工業化生產活性多糖，離子液體可循環使用，降低生產成本，且能普遍應用于真菌如桑黃、香菇、靈芝、灰樹花、冬蟲夏草、金針菇和杏鮑菇等活性多糖和蛋白質的選擇性分離。
【具體實施方式】
[0009]下面通過實施例對本發明做進一步詳細描述，需要指出的是，以下所述實施例旨在便于對本發明的理解，而對其不起任何限定作用。本發明以上層離子液相中蛋白質的提取率和下層無機鹽相中多糖的提取率來綜合評價[Ch]CVK3PO4組成的離子液雙水相體系選擇性分離真菌多糖和蛋白質的效果。蛋白質提取率定義為上層離子液相蛋白質質量與真菌水提物中蛋白質質量的比值，蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍染色法。多糖提取率定義為下層無機鹽相多糖質量與真菌水提物中多糖質量的比值，多糖含量測定采用苯酚-硫酸比色法。
[0010]實施例一:以桑黃菌絲體為研宄對象
步驟一，脫脂:桑黃菌絲體粉碎，脫脂棉布包裹，置于500 mL索氏抽提器中，加入200-300 mL石油醚(沸程:30~60°C)，35°C回流6 h，如此脫脂處理2次，自然晾干，得脫脂的桑黃菌絲體。
[0011]步驟二，制備桑黃水提物:稱取步驟一中脫脂后桑黃菌絲體100 g按l:10g/mL的料液比加入蒸餾水1000 mL，置于2000 mL圓底燒瓶中，充分攪拌均勻后，于95°C回流提取8 ho混合物用300 mL塑料離心管，5000 rpm、10 min離心，上清液合并于45°C旋轉蒸發器減壓蒸發，濃縮至原體積的1.5倍，蒸餾水透析48 h，真空冷凍干燥，得桑黃水提物。
[0012]步驟三，利用離子液雙水相體系選擇性分離桑黃多糖和蛋白質:
將1.0 mL質量濃度為10 mg/mL的桑黃水提物溶液加入到由1.0 g離子液體[Ch]Cl、2,8 g K3POjP 4.0 mL蒸餾水組成的離子液雙水相體系中，三者的質量比為0.25:0.7:1.0。充分振蕩使離子液體和無機鹽完全溶解，置于20°C恒溫水浴中振蕩30 min, 3000 rpm、10min離心，分離上下兩相。測得上層離子液相中蛋白質的提取率為75.1%，下層無機鹽相中桑黃多糖的提取率為78.8%。
[0013]步驟四，制備桑黃多糖:下層含桑黃多糖的無機鹽相蒸餾水透析48 h，桑黃多糖透析液用4倍體積的95%乙醇沉淀，4°C靜置過夜，離心，冷凍干燥，得桑黃多糖；
步驟五，回收離子液體:上層離子液相用二氯甲烷萃取3~5次，二氯甲烷相濃縮 45°C)，回收離子液體[Ch]Cl。
[0014]實施例二:以香菇子實體為研宄對象
試驗處理過程同實施例一，其不同之處在于其中離子液體[Ch]Cl 2.0 g、K3PO4 4.0 g和蒸餾水4.0 mL,三者的質量比為0.5:1.0: 1.0測得上層離子液相中蛋白質的提取率為86.3%，下層無機鹽相中香菇多糖的提取率為55.5%。
[0015]實施例三:以冬蟲夏草菌絲體為研宄對象
試驗處理過程同實施例一，其不同之處在于其中離子液體[Ch]Cl 1.2 g、K3PO4 3.2 g和蒸餾水4.0 mL，三者的質量比為0.3:0.8:1.0，測得上層離子液相中蛋白質的提取率為85.7%，下層無機鹽相中冬蟲夏草多糖的提取率為71.9%。
[0016]通過以上實施例可以看出，[Ch]CVK3PO4組成的離子液雙水相體系能夠用于桑黃、香菇、冬蟲夏草多糖和蛋白質的選擇性分離，且具有綠色、快速和高效的效果。
【主權項】
1.一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法，其特征在于包括以下步驟: 步驟一，脫脂:將真菌菌絲體或子實體粉碎后置于索氏抽提器中，加入石油醚，沸程30~60°C，35°C回流6 h ;如此脫脂兩次后，自然晾干得脫脂后的真菌菌絲體或子實體； 步驟二，制備真菌水提物:將步驟一中所述脫脂后的真菌菌絲體或子實體按1:10 g/mL的料液比加入蒸飽水中，95°C回流提取8 h，再在轉速為5000 rpm條件下離心10 min，濃縮，蒸餾水透析48 h后冷凍干燥得真菌水提物； 步驟三，利用離子液雙水相體系選擇性分離真菌多糖和蛋白質:將步驟二中所述的真菌水提物配成質量濃度為10 mg/mL的真菌水提物水溶液，取1.0 mL真菌水提物水溶液加入到雙水相體系中，再置于20°C恒溫水浴中振蕩30 min，離心，分離上下兩相即含有真菌多糖的下層無機鹽相和含有蛋白質等雜質的上層離子液相； 所述的雙水相體系由離子液體氯化膽堿[Ch] Cl、無機磷酸鹽K3PO4和蒸餾水組成，所述離子液體氯化膽堿[Ch]Cl、無機磷酸鹽K3POjP蒸餾水的質量比例為:0.25-0.5:0.7-1.0:1.0 ； 步驟四，制備真菌多糖:將步驟三中所述的含有真菌多糖的下層無機鹽相蒸餾水透析48 h，利用濃度為95%的乙醇對真菌多糖透析液進行沉淀；所述乙醇的體積是真菌多糖透析液的4倍；4°C靜置過夜，再在轉速為5000 rpm的條件下離心10 min，收集沉淀物后冷凍干燥，得真菌多糖； 步驟五，回收離子液體:將步驟三中所述含有蛋白質等雜質的上層離子液相用二氯甲烷萃取3~5次，二氯甲烷相濃縮時溫度彡45°C，回收離子液體[Ch]Cl。
2.根據權利要求1所述的一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法，其特征在于:所述真菌為桑黃、香菇、靈芝、灰樹花、冬蟲夏草、金針菇、杏鮑菇中的任一種。
【專利摘要】本發明公開了一種利用膽堿離子液雙水相體系分離多糖和蛋白質的方法，屬于生物活性物質分離純化技術領域，特指氯化膽堿[Ch]Cl和無機磷酸鹽K3PO4組成的離子液雙水相體系用于真菌多糖和蛋白質的選擇性分離，其特征主要包括以下步驟：將粉碎的真菌菌絲體或子實體用石油醚脫脂后，95℃熱水回流提取8 h，離心，濃縮，透析，冷凍干燥，得真菌水提物；由氯化膽堿[Ch]Cl和無機磷酸鹽K3PO4組成的離子液雙水相體系進行萃取分離；下層無機鹽相透析，乙醇沉淀，冷凍干燥，得真菌多糖；上層離子液相用二氯甲烷萃取，濃縮，回收離子液體。本發明的離子液雙水相體系適合于工業化生產活性多糖，具有綠色、快速和高效的效果，離子液體可循環使用，降低生產成本，且能普遍應用于多種真菌多糖和蛋白質的選擇性分離。
【IPC分類】C08B37-00, C07K1-14
【公開號】CN104861082
【申請號】CN201510296253
【發明人】閆景坤, 馬海樂, 王振斌, 裴娟娟, 姜宇
【申請人】江蘇大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月3日