在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，包括將頭孢丙烯母核、酰化試劑溶解在兩水相聚合物溶液中，母核與酰化試劑摩爾比為1：1～4，加入固定化青霉素G酰化酶后再加入兩相分配調節劑，調節pH＝4.5～7，在5～30℃反應1～80h，酶在反應體系中的濃度為50～150U/ml。本發明的方法可有效抑制青霉素酰化酶的水解活性，從而降低酰化試劑的水解和產物的水解程度。與用水作為介質的方法相比，本方法使得產物與酶分配在不同的兩種水相中，反應物充分與酶接觸，使得合成/水解比值得到了很大提高，頭孢丙烯的產率可提高20%，最高得率達到78%。本發明采用新型的可回用兩水相體系，體系回收再利用，降低了生產成本。
【專利說明】在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及頭孢丙烯的制備方法，尤其涉及一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法。
【背景技術】
[0002]頭孢丙烯(Cefprozil),是頭孢菌素類廣譜抗菌藥。對G+、G—菌和厭氧菌的抗菌活性均很強，對G+菌尤為突出，對￠-內酰胺酶穩定，主要用于治療中耳炎，呼吸道感染及皮膚和皮膚軟組織感染等。頭孢丙烯生物利用度高，胃腸道吸收完全，抗菌譜廣，穩定性好，是一個發展前景很好的半合成頭孢類藥物。
[0003]頭孢丙烯的化學合成主要有兩種方法，一種是以頭孢母核為起始原料，經Wittig反應在3-位引入丙烯基，7-位脫保護基團后引入側鏈，最后在三氟乙酸作用下脫去7-位側鏈氨基和4-位羧基上的保護基團；另一種是通過青霉素衍生物丙二烯氮雜環丁酮與Z-丙烯基有機銅試劑進行1，4_共軛加成形成頭孢環，在3-位引入丙烯基，然后在7-位引入側鏈而得頭孢丙烯。
[0004]側鏈和母核含有羥基、羧基等活潑基團，且化學合成的選擇性低，在反應中往往會發生多種副反應。為了避免這些副反應，在合成時需要對活潑基團進行保護，通常選用硅烷化保護的母核與酸酐側鏈。一些反應條件如溶劑為二氯甲烷或者二甲基甲酰胺，硅烷化反應溫度為零下四十度，去保護基團時要用較多鹽酸等都增加了化學合成的復雜性。
[0005]Vroom的研究中，將苯甘氨酸、對羥基苯甘氨酸制成相應的酰胺衍生物,利用固定在凝膠和氨基酸多聚體上的青霉素酰化酶的催化作用，合成了頭孢丙烯等一系列藥物。Usher研究了用側鏈羧酸酯和含有`氨基的母核在青霉素酰化酶的作用下催化合成日-族抗生素。其中以7-氨基-3-丙烯基-3-頭孢菌素-4-羧酸為起始原料，在固定化青霉素酰化酶的作用下，與對羥基苯甘氨酸乙二醇酯縮合得到頭孢丙烯。馮勝昔以7-苯乙酰氨基-3-E-丙烯基-3-頭孢菌素-4-羧酸(反式GPRA)為原料，在青霉素酰化酶作用下水解得到3-E-丙烯基-3-頭孢菌素-4-羧酸(反式APRA)，將固相酶過濾后，調濾液pH分離得到反式APRA。然后將實驗用量的反式APRA與對羥基苯甘氨酸乙二醇酯在青霉素酰化酶作用下縮合得到反式頭孢丙烯。
[0006]酶催化合成反應在很多方面展現了比化學合成反應更大的優勢，酶法合成具有工藝簡單，無需基團保護，環境友好，反應條件溫和等優點，但是酶催化反應其本身有一定的局限性，比如在應用中普遍存在產物的積聚對酶帶來的反饋抑制，影響酶催化合成的能力并且容易造成產物的水解。為了克服這些弊端，需要選擇一個合適的反應介質，可以及時轉移酶周圍的產物并且保持底物與酶的接觸，這樣有利于促進酶催化反應的能力并且提高產率。
[0007]有機溶劑可以實現產物的分離，但是對酶的穩定性有不利影響，兩水相體系的生物相容度高，成相條件溫和，不會破壞酶的活性，且在相界面處有低的界面能，振蕩后一相在另一相中形成微小乳液，傳質速率快，通常可以基于物質的分配系數不同而將其分離，實現生物轉化反應與分離的耦合。所以兩水相體系可以為酶催化反應提供一個良好的介質，基于對產物的分配作用可以將其及時轉移，產物與酶的分配在不同的相可以減少自身的水解以及對酶的抑制。
[0008]對于青霉素酰化酶的催化合成頭孢丙烯反應的研究較少，用于酶催化合成的兩水相體系也是較為昂貴且為不易回收的聚乙二醇及鹽的體系。頭孢丙烯傳統化學合成方法存在弊端，亟待改進，酶催化合成雖然有一定優勢，但也有一定缺陷，傳統兩水相體系不能回收利用而限制了大規模生產。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在于提供一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，該合成頭孢丙烯的方法生產成本低，較為經濟，是一種溫和、有效、污染少、產率高的合成頭孢丙烯的方法，最高得率達到78%。
[0010]為了實現上述目的，本發明采用如下的技術方案:
一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，包括如下步驟:
(1)將頭孢丙烯母核、酰化試 劑溶解于可回用兩水相聚合物溶液中，其中加入的頭孢丙烯母核與酰化試劑的摩爾比為1:1-4 ;
(2)將固定化青霉素酰化酶加入步驟(I)獲得的溶液中，再加入使頭孢丙烯在兩相之間進行分配的調節劑，調節反應體系pH值為4.5-7.0，反應體系在5-30°C反應I-80 h，分離獲得所述頭孢丙烯，其中青霉素酰化酶在反應體系中的濃度為50-150U/ml (IU=I個酶活單位)，頭孢丙烯母核在反應體系中的濃度為10-80mM。
[0011]本發明步驟(I)中，所述頭孢丙烯母核為具有結構式(I)的化合物或其鹽酸鹽，可從市售夠得，也可通過化學合成方法獲得，結構式(I )的化合物為7-氨基-3-丙烯基頭孢烷酸:
【權利要求】
1.一種在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)將頭孢丙烯母核、酰化試劑溶解于可回用兩水相聚合物溶液中，其中加入的頭孢丙烯母核與酰化試劑的摩爾比為1:1-4 ; (2)將固定化青霉素酰化酶加入步驟(I)獲得的溶液中，再加入使頭孢丙烯在兩相之間進行分配的調節劑，調節反應體系pH=4.5-7.0，反應體系在5-30°C反應I-80 h，分離獲得所述頭孢丙烯，其中青霉素酰化酶在反應體系中的濃度為50-150U/ml，頭孢丙烯母核在反應體系中的濃度為10-80mM。
2.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述頭孢丙烯母核為具有結構式(I )的7-氨基-3-丙烯基頭孢烷酸或其鹽酸鹽:
3.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述酰化試劑為具有結構式(II)的化合物:
4.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:所述可回用兩水相體系是由兩種可回用的聚合物形成的，每種可回用聚合物在兩水相體系中的濃度為2%-5% (w/w)。
5.根據權利要求4所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:所述可回用兩水相體系是溫度響應的聚合物Pnb與PH響應的聚合物Padb形成的兩水相體系，或者是兩種PH響應的聚合物Padb與Padba形成的兩水相體系，或者是PH響應的聚合物PADB與檸檬酸鈉形成的兩水相體系。
6.根據權利要求1、4或5所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:所述聚合物Pnb通過調節溫度至其低溫臨界溶解溫度對其進行回收利用，所述聚合物Padb與Padba通過調節PH值至相應聚合物的等電點進行回收利用。
7.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(2)中，使頭孢丙烯在兩相之間進行分配的調節劑為硫酸銨、磷酸二氫鈉或者磷酸二氫鉀，其濃度為IOmM-lOOmM。
8.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:所述頭孢丙烯母核在反應體系中的濃度為30-50mM ;所述頭孢丙烯母核與酰化試劑的摩爾比為1:3。
9.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于:步驟(2)中，反應體系的反應溫度為10-20°C ;反應體系的反應時間為30-80h ;反應體系的pH值為5.0-6.5。
10.根據權利要求1所述的在可回用兩水相體系中利用固定化青霉素酰化酶催化合成頭孢丙烯的方法，其特征在于，所述固定化青霉素酰化酶為固定化的青霉素G酰化酶；該青霉素G酰化酶來源于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)或幾產 喊菌(Alcaligenes faecalis)。
【文檔編號】C12P35/04GK103451259SQ201310341198
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月7日 優先權日:2013年8月7日
【發明者】曹學君, 祝超慧, 唐子安, 趙志炎, 李玉丹, 陳佳伶 申請人:南通康鑫藥業有限公司, 華東理工大學