一種半滑舌鰨皮膚組織rna提取的前處理方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體地涉及一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法。
【背景技術】
[0002]半滑舌鰨(Cynoglossus semi laevis Gilnter)是我國第一種進行人工養殖的舌鰨科魚類，俗稱牛舌頭、鰨目、鰨米、龍利，屬鱗形目Pleuronectiformes、舌鰨科Cynoglossidae,自然分布于我國沿海海區，以渤海、黃海為多，棲息于泥沙質海底，是一種名貴的底棲大型魚類，目前，由于具有良好的市場經濟價值，有“富貴魚”、“海洋中的黃金”之稱。但是半滑舌鰨的攝食習性非常特殊，習慣夜間攝食，對顆粒飼料采取底匍攝食，明顯不同于鲆鰈類養殖品種牙鲆和大菱鲆等采取投喂后主動從池底躍起攝食的習性。這種特殊的攝食行為，使人工養殖條件下的投喂非常困難，攝食差、死亡率高并表現出生長緩慢現象，這已成為制約半滑舌鰨推廣養殖的瓶頸。因此，探索半滑舌鰨的攝食行為，對于促進其攝食以及為其他鰨科魚類的養殖開發提供借鑒，都具有重要的理論意義和經濟意義。近年來，半滑舌鰨攝食行為和感覺生理成為研宄熱點。前期研宄表明半滑舌鰨的側線系統在攝食行為中起主導作用。半滑舌鰨的側線系統是由覆蓋在有眼側皮膚的管道神經丘和只分布在無眼側頭部皮膚的游離神經丘兩部分組成，而半滑舌鰨的活體皮膚具有管道神經丘以及游離神經丘，是從分子水平探索半滑舌鰨攝食行為和感覺生理的重要實驗材料。
[0003]目前，很多研宄都針對改良RNA的提取方法，對前處理方法涉及很少，有關半滑舌鰨皮膚組織的獲取的探索研宄更是少之又少。研宄發現半滑舌鰨皮膚黏液腺發達，各黏液腺通過黏液分泌管相互連結，并通過無數個開孔通向皮膚表面，致使魚體半滑舌鰨皮膚表面覆蓋厚厚的粘液，同時肌肉剝離困難，易混入肌肉中的RNA，因此要從半滑舌鰨魚體中獲取單一皮膚組織存在很多困難，。

【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題在于提供一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，該方法所需費用極低，材料易得，操作簡便，效果顯著。利用本方法可快速、高效的獲得半滑舌鰨皮膚組織，用于獲取高質量的皮膚RNA ;為半滑舌鰨皮膚功能基因的相關研宄提供了重要且可靠的分子實驗材料。
[0005]一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，包括以下步驟
[0006](I)首先用I XPBS緩沖液清洗魚體表面，去皮膚表面覆蓋的粘液；
[0007](2)在選取的皮膚部位，利用解剖刀切入深度為1.8-3.0mm方塊，所述方塊面積大約為0.25-4cm2，且不要脫離魚體；
[0008](3)利用移液槍向步驟⑵中1.8-3.0mm深的方塊四周裂口處注滿4%多聚甲醛溶液，固定處理lmin-4min ；
[0009](4)然后吸取4% (g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所處理的方塊皮膚表面，固定處理 30s_lmin ；
[0010](5)選取方塊的一角，用鑷子直接撕取該組織塊表面皮膚，獲取的皮膚組織能夠直接用于RNA的提取或冷凍保存。
[0011]本發明與現有技術相比的有益效果:
[0012]1、本發明所需材料主要是IXPBS緩沖液和4%多聚甲醛溶液，材料易獲取，需用量極少，費用較低。
[0013]2、本發明首次利用固定液的固定特性，第一能夠有效去除半滑舌鰨皮膚表面的粘液蛋白，并減少其分泌；第二能夠使肌肉組織固定變硬，致使皮膚組織與肌肉組織剝離，可以干凈快速獲取半滑舌鰨單一皮膚組織。與常規方法相比一方面能夠簡易快速獲得皮膚組織，而且有效減少了粘液蛋白含量，能夠顯著降低了皮膚RNA降解；另一方面皮膚中不會殘留肌肉組織，能夠得到更純的皮膚RNA，獲得更可靠的后續實驗結果。
[0014]3、本發明首次利用4% (g/100ml)多聚甲醛溶液能夠更好的保存RNA完整性的特性，短時間內基本不會破壞RNA的完整性，能夠獲得高質量的RNA。
【附圖說明】
[0015]圖1:本發明方法提取的RNA電泳圖。
[0016]圖2:本發明方法與常規方法獲取半滑舌鰨皮膚組織提取RNA比對效果圖:1，、2，、
3、4代表常規方法提取的RNA ;5和6代表本發明方法提取的RNA。
【具體實施方式】
[0017]下面通過實施例來對本發明的技術方案作進一步的改進，但本發明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。
[0018]實施例
[0019]一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，具體方法如下(本實驗所需試劑和耗材均需RNA-free，所用的魚為剛剛死亡的半滑舌鰨，體長37cm，體重750g)；
[0020](I)首先用I XPBS緩沖液清洗魚體表面，此步驟盡量除去皮膚表面覆蓋的粘液；
[0021](2)在選取的皮膚部位，利用解剖刀切入深度為1.8mm方塊，所述方塊面積大約為Icm2，且不要脫離魚體；
[0022](3)利用移液槍向步驟⑵中1.8mm深的方塊四周裂口處注滿4%多聚甲醛溶液，固定處理Imin ；
[0023](4)然后吸取4%多聚甲醛溶液滴加到所處理的方塊皮膚表面，固定處理30s ；
[0024](5)選取方塊的一角，用鑷子直接撕取該組織塊表面皮膚，獲取的皮膚組織能夠直接用于RNA的提取或冷凍保存。
[0025]RNA的提取選用天根動物組織總RNA提取試劑盒，具體步驟如下:
[0026]I)組織勻漿處理
[0027]取組織20mg加入300 μ L裂解液RL (裂解液RL使用前取I μ L裂解液加入1yL的巰基乙醇配成濃度1%的終溶液)，用研磨杵將組織徹底研磨，然后向勻漿液中加入590 μ L RNase-Free ddH20 和 10 μ L Proteinase K，混勾后 56°C水浴處理 15min，水浴處理時每阿隔5分鐘搖晃一次，以便充分熱處理；
[0028]注意:取得組織量確定不要超過20mg，否則過多將會導致RNA提取率和質量下降。
[0029]2) 12000rpm離心5min，取上清液進行下面的操作；
[0030]3)緩慢加入0.5倍上清液體積的無水乙醇，混勻，如果此出現沉淀，則將得到的溶液和沉淀一并轉入吸附柱CR3中(吸附柱提前放在收集管中)，12000rpm離心60秒，棄掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
[0031]4)向吸附柱CR3中加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111離心60秒，棄掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
[0032]5)配制DNasel工作液:取10 μ L DNasel儲存液放入新的RNase-free離心管中，加入70 μ L的RDD溶液，輕輕混勻；
[0033]6)向吸附柱CR3中央加入80yL剛配置的DNasel工作液，室溫情況下放置15min ；
[0034]7)向吸附柱CR3中加入35(^1^去蛋白液1^1，12000印111離心60秒，棄掉廢液，將吸附柱放回收集管中；
[0035]8)向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW(使用前確定已經加入了乙醇)，室溫情況下放置2min，12000rpm離心60秒，倒掉廢液，將吸附柱CR3放回收集管；
[0036]9)重復步驟8 (向吸附柱CR3中加入500 μ L漂洗液RW，室溫情況下放置2min，12000rpm離心60秒，棄廢液，將吸附柱CR3放回收集管)一次；
[0037]10) 12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫下放置8分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；
[0038]注:此步驟的目的是將吸附柱CR3中殘余的漂洗液去除，漂洗液的殘留可能會影響后續的RT等實驗。
[0039]11)將吸附柱CR3轉入一個新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加40 μ L RNase-Free ddH20，室溫情況下放置2min，12000rpm離心2min，得到RNA溶液。
[0040]注意:1、洗脫緩沖液體積即RNase-Free ddH20不應少于30 μ L，用量過少將會影響RNA的回收效率。
[0041 ] 2、得到的RNA溶液放于-70 °C保存。
[0042]12) RNA完整性檢測
[0043]RNA可用普通瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。電泳條件:膠濃度1.0 % ;0.1 X TAE電泳緩沖液；220電壓下電泳8min。由于細胞中RNA70% -80%為rRNA，電泳后UV下應能看到非常明顯的rRNA條帶。28S rRNA的量約為18S rRNA的兩倍，說明RNA的完整性較好。
[0044]RNA提取結果如圖1
[0045]13)實驗結果分析:采用本發明方法所獲得RNA經瓊脂糖跑膠檢測沒有拖帶，說明幾乎沒有降解，而且28S rRNA帶的亮度約為18S rRNA帶的亮度的兩倍，說明RNA的完整性較好。通過不斷驗證實驗證實本發明的實驗方法能夠較穩定且高效率的獲得高質量的RNA。同時本發明方法提取的RNA與常規方法提取的RNA的對比實驗見圖2。
【主權項】
1.一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，其特征在于它包括以下步驟 (1)首先用IXPBS緩沖液清洗魚體表面，去除皮膚表面覆蓋的粘液；(2)在選取的皮膚部位，利用解剖刀切入深度為1.8-3.0mm方塊，所述方塊面積大約為.0.25-4cm2，且不要脫離魚體； (3)利用移液槍向步驟⑵中1.8-3.0mm深的方塊四周裂口處注滿4% (g/100ml)多聚甲醛溶液，固定處理lmin-4min ； (4)然后吸取4%(g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所處理的方塊皮膚表面，固定處理.30s_lmin ； (5)選取方塊的一角，用鑷子直接撕取該組織塊表面皮膚，獲取的皮膚組織能夠直接用于RNA的提取或冷凍保存。
【專利摘要】一種半滑舌鰨皮膚組織RNA提取的前處理方法，屬于分子生物學領域，本發明方法利用4％多聚甲醛溶液處理皮膚表面，能夠得到更純的皮膚RNA。該方法所需費用極低，材料易得，操作簡便，效果顯著。利用本方法可快速、高效的獲得半滑舌鰨皮膚組織，用于獲取高質量的皮膚RNA；為半滑舌鰨皮膚功能基因的相關研究提供了重要且可靠的分子實驗材料。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104830840
【申請號】CN201510271513
【發明人】馬愛軍, 商曉梅, 王新安, 夏丹丹, 毛美霖
【申請人】中國水產科學研究院黃海水產研究所
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月26日