專利名稱：一種從綿羊毛囊組織中提取總rna的方法
技術領域：
:本發明屬于RNA制備技術領域，具體涉及一種從綿羊毛囊組織中提取總RNA的方法。
背景技術：
:RNA是一種多功能分子，它作為DNA轉錄的產物及蛋白質的翻譯模板，與DNA、蛋白質及RNA本身都存在許多互作。不同的RNA在生化過程中充當著信使、酶及結構組分等多種角色，在生命活動的各環節發揮著重要的作用。隨著生物技術及計算機技術的不斷發展，越來越多的方法可用于RNA的檢測與研究，RNA種類及功能的多樣性也不斷的被發現。隨著研究的深入，人們也意識到RNA的研究在揭示生命過程本質及疾病治療等方面都有著重要意義。欲對RNA進行研究，首先要從組織中提取得到高質量的RNA。但RNA與DNA不同，極容易發生降解，RNA降解將對后續研究的真實性及可靠性產生極大的影像。引起RNA降解的主要因素是RNA酶(章國衛等，真核細胞中mRNA的降解機制；遺傳；1999，21 (6):49-53.)。RNA酶有2種來源，一種是外源性的，一種是內源性的。因此在采集用于RNA提取的樣品時，重點就在于如何防止外源性RNA酶污染及抑制內源性RNA酶活性上。外源性RNA酶可以通過DEPC等RNA酶抑制劑處理實驗用品以及嚴格的實驗操作和試驗環境的控制來加以排除。而內源性RNA酶卻很難去除，只能通過液氮或干冰制造低溫或者組織樣品保護液浸泡的方法來進行抑制(Mutter, G.L.et al.(2004).Comparison of frozen and RNALater solidtissue storage methods for use in RNA expression microarrays.BMC Genomics.5:88)。但對于某些組織來說，這樣的處理很難達到預期效果，比如毛囊組織。由于毛囊組織體積極小，使用液氮凍存后不方便研磨，且角質化程度高，使用組織樣品保護液無法快速滲透到組織內部，起不到抑制RNA酶的效果。這些都是影響毛囊組織RNA提取產量及質量的重要因素，特別是在野外現場對綿羊等動物進行毛囊采集時這種問題尤為明顯，這些問題都阻礙了對毛囊組織基因RNA水平表達研究的進展。本發明就是為了解決以上難題而提供了一種從現場樣品采集開始，包括樣品運輸、保存，到RNA提取的綿羊毛囊組織RNA提取方法。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供了一種獲得高質量RNA的方法。本發明提取的綿羊毛囊組織總RNA，不被外源或內源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的總RNA的純度，以利于后續試驗的利用。本發明操作簡單方便，成本低，無需液氮和RNA樣品保護液。本發明獲得的毛囊組織總RNA純度高、完整度好，可用于反轉錄cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA與microRNA的檢測等分子生物學的操作應用。實現本發明的技術方案如下所述:(1)現場采集毛囊組織及處理:
a)在活體狀態下，從綿羊體側成股拔取羊毛，用剪刀在距離羊毛根部毛囊泡Icm處將羊毛剪斷，收集毛囊至裝有700 μ L TRIzol的1.5mL錐形底離心管中，收集量至毛囊組織總體積占TRIzol液體體積的1/3即可；b)立刻用小型塑料研磨杵在離心管內研磨lmin，向離心管內補充300 μ L TRIzol使1.5mL離心管內的TRIzoI總量達lmL，蓋好蓋子甩動離心管讓毛囊完全浸泡在TRIzoI液體中，將離心管放入離心管盒內，即完成采集；c)在避光條件下，于24小時內將研磨后裝有樣品的離心管放入-20°c暫時凍存。(2)樣品運輸:將裝有樣品的離心管從_20°C取出放入泡沫盒，同時放入足夠量的冰袋，密封后進行運輸，使運輸過程中的冰袋不完全融化為準。(3)樣品保存在室溫下解凍浸泡在TRIzol中的樣，于4°C 12000rpm離心lOmin,吸取TRIzol液體至新離心管，此時，TRIzol液體可放入_80°C保存，至少I個月毛囊RNA不會降解。(4) RNA 提取:a)在室溫下解凍由步驟(3)中凍存的TRIzol樣品液體，向每ImL TRIzol樣品中加入200 μ L氯仿，劇烈 震蕩混勻20s，室溫靜置5min ；b)于4°C 12000rpm離心15min,取400 μ L所得上清至新離心管;c)向所得上清中加入400 μ L異丙醇，上下顛倒混勻10次，室溫靜置IOmin ；d)于4°C 12000rpm離心lOmin,可見管底有白色沉淀,棄液體；e)向離心管中加入ImL 75%濃度的乙醇溶液(該乙醇溶液用RNase-Free ddH20稀釋配制，使乙醇溶液的終濃度至75% )，用手指彈動離心管底，讓沉淀懸浮于液體之中；f)于4°C 7500rpm離心5min，棄液體。用槍頭吸干管底殘液，不要觸及沉淀，避免將沉淀吸走；g)室溫晾干沉淀后,用RNase-Free ddH20溶解沉淀,得到綿羊毛囊組織總RNA樣品O其中上述實驗所用到所有耗材均經由0.1 %濃度的焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液浸泡8h后12CTC高壓蒸汽滅菌30min。本發明的優點是:簡單方便，成本低，無需液氮及RNA組織樣品保護液，易于在羊場等野外環境下操作。所得到的總RNA完整度高，質量好，可用于下游的反轉錄cDNA、PCR或QPCR等實驗。


序列表SEQID NO:1是本發明的應用實施例中擴增的18S基因的部分核苷酸序列(119bp)。序列表SEQID NO:2是本發明的應用實施例中擴增的GAPDH基因的部分核苷酸序列(15Ibp)。序列表SEQID NO:3是本發明的應用實施例中擴增的KRTAP11.1基因的部分核苷酸序列(127bp)。序列表SEQID NO:4和5是應用實施例中擴增18S基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:6是應用實施例中擴增GAPDH基因片段的引物序列(上游引物)。序列表SEQ ID NO:7和8是應用實施例中擴增KRTAP11.1基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:9是本發明的應用實施例中擴增的5S基因部分核苷酸序列(116bp)。序列表SEQ ID NO: 10是本發明的應用實施例中擴增的U6基因的部分核苷酸序列(91bp)。序列表SEQ ID NO:11和12是本發明的應用實施例中擴增5S基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:13和14應用實施例中擴增U6基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO:15和16是應用實施例中擴增miR_31基因片段的引物序列(上、下游引物)。序列表SEQ ID NO: 17是應用實施例中擴增的miR_31基因的部分核苷酸序列(65bp)ο序列表SEQ ID NO:18是應用實施例中反轉錄miR_31基因的莖環引物序列(44bp)。

序列表SEQ ID NO:19是應用實施例中擴增GAPDH基因片段的引物序列(下游引物)。圖1:毛囊采集時所用到的1.5mL離心管(如圖左所示)及小型塑料研磨杵(如圖右所示)。圖2:利用本發明提取的綿羊毛囊組織RNA電泳結果。泳道1、2、3分別對應編號為1、2、3的三只不同的綿羊個體的毛囊組織RNA。圖3:18S、GAPDH、KRTAP11.1 基因 PCR擴增產物電泳結果。泳道M為 IOObp Marker,I為18S擴增產物，2為GAPDH擴增產物，3為KRTAP11.1擴增產物。圖4:5S、U6、miR-31基因PCR擴增產物電泳結果。泳道M為50bp Marker, I為5S擴增產物，2為U6擴增產物，3為miR-31擴增產物。圖5:18S、GAPDH、KRTAP11.1基因QPCR擴增曲線圖。圖中:縱坐標為熒光強度，橫坐標為PCR循環數。其中:1為18S擴增曲線，2為GAPDH擴增曲線，3為KRTAPl1.1擴增曲線。圖6:5S、U6、miR-31基因QPCR擴增曲線圖。圖中:縱坐標為熒光強度，橫坐標為PCR循環數。其中:1為5S擴增曲線，2為U6擴增曲線，3為miR-31擴增曲線。
具體實施例方式實施例1:從西藏綿羊毛囊組織中提取總RNA本實驗在西藏林芝地區羊場采樣，在湖北武漢華中農業大學進行RNA提取。實驗所用試劑包括=TRIzol購買于Invitrogen公司(貨號:15596026) ；RNase-Free ddH20購買于天根生化科技有限公司(貨號:RT121);焦碳酸二乙酯(DEPC)購買于Sigma公司(貨號:D5758)。1.樣品采集(I)在羊場從綿羊體側成股拔取羊毛，用剪刀在距離羊毛根部毛囊泡Icm處將羊毛剪斷，收集毛囊至裝有700 μ L TRIzol液體的1.5mL錐形底離心管中。收集量為毛囊體積占TRIzoI液體體積的1/3。(2)用小型塑料研磨杵在離心管內研磨lmin，向離心管內補充300 μ L TRIzol，使毛囊全部浸泡在TRIzol液體中。樣品當天在_20°C下過夜。2.樣品運輸次日樣品同若干冰袋一起放入泡沫盒中進行空運，2日后到達實驗室。開封檢查，冰袋并未完全融化。3.樣品保存將樣品解凍，于4°C 12000rpm離心lOmin,吸取TRIzol液體至新離心管,棄去沉淀毛囊。將吸出的TRIzoI液體樣品放入_80°C冰箱凍存。4.RNA 提取(I) I個月后，解凍TRIzoI液體樣品，向ImLTRIzol樣品中加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩混勻20s，室溫靜置5min。(2)在4°C 12000rpm離心15min，取400 μ L所得上清至新離心管。

(3)向所得上清中加入400 μ L異丙醇，上下顛倒混勻10次，室溫靜置lOmin。(4)在4°C 12000rpm離心lOmin,可見管底有白色沉淀,棄液體。(5)向離心管中加入ImL 75%濃度的乙醇溶液(用RNase-Free ddH20配制，使乙醇溶液的終濃度至75% )，用手指彈動離心管底，讓沉淀懸浮于液體之中。(6)在4°C 7500rpm離心5min，棄液體。用槍頭吸干管底殘液，不要觸及沉淀，避免將沉淀吸走。(7)室溫晾干沉淀后，用20 μ L RNase-Free ddH20溶解沉淀，得到毛囊組織總RNA樣品。(8)用該發明提取了 3只西藏綿羊的毛囊組織總RNA，濃度及純度檢測結果如表1，總RNA電泳結果見圖2。表1:3只西藏綿羊毛囊組織總RNA濃度及純度檢測
樣品編號濃度(ng/μΙ.)OD260/280OD260/230
_I_90.76_L99_h90_
2 97.62 1.99 1.93_3_90.94_Z03_h95_從結果可以看出，使用本發明提取的RNA純度較高，電泳得到的28S、18S、5S條帶清晰，28S條帶亮度近似18S的2倍，說明RNA完整度良好，無明顯降解現象。說明使用本發明可以獲得較高質量的綿羊毛囊組織總RNA。實施例2:用本發明從綿羊毛囊組織中提取的總RNA進行基因mRNA水平表達的PCR檢測1.使用實施例1中提取的毛囊組織總RNA進行反轉錄合成cDNA。試劑使用寶生物工程大連有限公司的“P「imeSc「ipt RT reagent Kit With gDNA Eraser”試劑盒(貨號:DRR047S)，儀器為Bio-red公司的MyCycler PCR儀。具體操作步驟如下:(I)基因組DNA的去除反應，反應體系(總體積)10 μ L，反應液配方如下:
權利要求
1.一種從綿羊毛囊組織中提取總RNA的方法，其特征在于以下步驟: (1)現場采集: a)取綿羊毛囊至裝有700μ L TRIzol的1.5mL錐形底離心管中，毛囊組織的收集量至毛囊組織總體積占TRIzol液體體積的1/3 ； b)立刻用小型塑料研磨杵在離心管內研磨lmin，向離心管內補充300μ L TRIzol使1.5mL離心管內的TRIzoI總量達ImL ;蓋好蓋子甩動離心管讓毛囊完全浸泡在TRIzoI液體中，將離心管放入離心管盒內，即完成采集； c)在避光條件下，于24小時內將研磨后裝有樣品的離心管放入_20°C暫時凍存； (2)樣品運輸: 將裝有樣品的離心管從_20°C取出放入泡沫盒，同時放入足夠量的冰袋，密封后進行運輸，使保證運輸時冰袋中的冰不完全融化為準； (3)樣品保存: 在室溫下解凍浸泡在TRIzol液體中的樣品，于4°C 12000rpm離心lOmin，吸取TRIzol液體至新離心管，將TRIzoI液體放入-80°C保存，保存期至少為I個月至毛囊RNA不被降解；(4)RNA 提取: a)在室溫下解凍由步驟(3)中凍存的TRIzoI樣品液體，向每ImLTRIzol樣品中加入`200 μ L氯仿，劇烈震蕩混勻20`s，于室溫下靜置5min ；` b)于4°C12000rpm離心15min，得上清，取400 μ L所得的上清至新的離心管； c)向所得的上清中加入400μ L異丙醇，上下顛倒混勻10次，于室溫下靜置IOmin ； d)于4°C12000rpm離心lOmin，可見管底有白色沉淀，棄液體，保留管底的白色沉淀； e)向離心管中加入ImL75%濃度的乙醇溶液，用手指彈動離心管底，讓沉淀懸浮于液體之中； f)于4°C7500rpm離心5min，棄液體，用槍頭吸干管底殘液，不要觸及沉淀，避免將沉淀吸走；` g)于室溫下晾干沉淀后，用RNase-FreeddH20溶解沉淀，得到綿羊毛囊組織總RNA樣品O
全文摘要
本發明屬于RNA制備技術領域，具體涉及一種從綿羊毛囊組織提取總RNA的方法。其特征包括，從野外現場采集綿羊毛囊，樣品低溫運輸、保存和RNA提取步驟得到毛囊總RNA。本發明提取毛囊總RNA，不會被外源或內源RNA酶降解到最低限度，能最大限度地保持被提取的總RNA的純度，以利于后續試驗的利用。本發明操作簡單方便，成本低，無需液氮和RNA樣品保護液。本發明獲得的毛囊組織總RNA純度高、完整度好，可用于反轉錄cDNA、PCR、QPCR等下游操作及mRNA與microRNA的檢測應用。
文檔編號C12N15/10GK103243085SQ20121002376
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月3日 優先權日2012年2月3日
發明者余梅, 柳廣斌, 趙書紅, 李新云, 曹建華, 李小平, 李長春, 朱猛進, 陳若男 申請人:華中農業大學