一種測序模板的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種測序模板的制備方法。
【背景技術】
[0002]高通量測序模板是測序樣品準備中一個至關重要的環節，通過高效的模板制備可以獲得高質量的單分子多拷貝測序模板，為下一步測序反應打下基礎，乳液PCR是現有的高通量測序平臺中最為常用的單分子多拷貝測序模板制備技術之一，因此對基于乳液PCR的模板進行優化有著重大的意義。
[0003]在新一代的高通量測序技術平臺中，有多種測序技術都是基于乳液PCR的測序模板制備技術。主要通過在磁性微球上進行高效的乳液PCR擴增:利用乳液PCR的特點，在乳液制備或城中使每個微球反應液滴中只含有一個分子的測序文庫和相應的擴增組分，一次來獲得高效的單分子多拷貝測序模板微球，為下一步測序過程中獲得更好的測序信號和數據提供了保障。現有技術中存在幾點問題，首先是乳液體系不穩定，乳液體系若不穩定，不僅降低了乳液擴增成功的幾率，同時增加了試驗成本，浪費了時間。其次是乳液體系液滴中，單克隆的含量比例較低，增加單克隆比例不但能提高模板的制備效率，同時也能縮短時間，降低成本。最后是磁珠的富集效率較低。所以急需建立一種新的測序模板。

【發明內容】

[0004]本發明的一個目的是一種測序模板的制備方法，包括以下步驟:
(1)emPCR擴增混合液的準備；
(2)DNA文庫的捕獲；
(3)乳化;
(4)emPCR 擴增；
(5)DNA文庫微球的富集回收。
[0005]所述乳化過程采用TissueLyser于20Hz破碎4分鐘。
[0006]所述乳液PCR的反應體系中包括水相、油相、引發劑、保護劑、表面活性劑與助表面活性劑。
[0007]所述所述水相與油相的體積比為4:9-4:7，優選為8:17。
[0008]所述油相為DC5225C、PGFE, DC193、DC556和礦物油中的I種或幾種，優選為DC5225C、DC193 和 DC556。
[0009]所述所述引發劑為過硫酸鈉。
[0010]所述所述保護劑為BSA和人血清蛋白中的一種或兩種，優選為BSA。
[0011]所述表面活性劑為span80、TritonX-lOO、tween80、tween60 和 tween20 中的一種或幾種，優選為span80、TritonX-100、tween80和tween60 ;在微乳液制備時，span80、tween80、tween60 和 tween20 溶于油相，TritonX-100 溶于水相。
[0012]所述表面活性劑占體系的體積比為span80 2.5-5%, TritonX-100 0.4-1.0%，tween80 0.2-0.5%，tween60 0.3-0.5%、tween20 0.2-0.8% ;優選為 span80 2.5-3.5%，TritonX-100 0.7-0.9%, tween80 0.3-0.4%, tween60 0.4_0.5%和 tween20 0.4-0.7%o
[0013]所述助表面活性劑為聚乙二醇和丙三醇中的一種或兩種。
[0014]所述水相中包括emPCR助劑、擴增液、引物、DNA聚合酶、dNTP、PPiase (肽脯氨酰順反異構酶)、!\%(312和水；所述emPCR助劑包括betaine(甜菜堿)、D_ (+) trehalose(右旋海藻糖)、L_carnitine (左旋肉堿)、NP_40 (乙基苯基聚乙二醇)、DTT( 二硫蘇糖醇)、formamide(甲酰胺)和DMSO( 二甲基亞砜)中的一種或幾種，優選為betaine、D-(+) trehalose、L-carnitine、NP-40、DTT、formamide 和 DMSO ；占體系的比例為 Betaine 0.4-1.0M, D- (+)trehalose 0.2-0.5M，L-carnitine 0.1-0.4M，NP-40 0.2-0.6%，DTT 1-2.5mM, formamide
0.l-0.2%，DMSO 1-2.5% (其中的百分含量為體積比)。
所述DNA文庫磁珠的富集回收時，進行破乳，破乳采用二丁醇或者異丙醇。
[0015]本發明的制備方法操作簡單，非常有利于大規模應用。有以下優點:使用的油相、水相表面活性劑以及助表面活性劑使配制的乳液體系非常穩定，乳液擴增的效率高，錯配率低，提高了乳液擴增的成功率，降低了實驗成本，節省了人力物力成本。乳液體系中，液滴的單克隆比例含量高，單克隆比例的增加顯著了提高了乳液擴增的效率。同時，磁性微球的富集效率高。引發劑的選擇進一步改善了乳液的乳化效果。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
1.emPCR擴增混合液的準備
(I)配制油相，混合 DC5225C 500 yL、DC193 650 μ L 和 DC556 1200 μ L0
[0017](2)配制水相，加入 1x擴增液 100 μ L 10μΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助劑 350 μ L BSA 12 μ L 雙蒸無菌水余量總計 100yL
其中，emPCR 助劑為 Betaine 0.4M，D- (+) trehalose 0.5M，L-carnitine 0.1M，NP-40
0.2%，DTT 2.5mM，DMSO 1%。
[0018]2.DNA文庫的捕獲
(1)對基因組DNA進行片段化，連接接頭，處理后得到單鏈DNA文庫；
(2)將清洗后的微球分裝至2mlEP管中；
(3)在分裝好的EP管中加入稀釋后的單鏈DNA文庫10μ L，渦旋震蕩10s，得到文庫混合液。
[0019]3.乳化
(I)按占體系的體積比，將span80 2.5%、tween80 0.4%、tween20 0.7%和聚乙二醇溶于油相，TritonX-100 0.4%溶于水相，混合。
[0020](2)加入文庫混合液和過硫酸鈉，置于TissueLyser進行乳化，20Hz破碎4分鐘。
[0021]4.emPCR 擴增 (I) PCR 擴增。
[0022]5.DNA文庫微球的富集回收 (I)收集乳化液。
[0023]( 2)使用異丙醇清洗微球。
[0024]( 3 )使用KCl清洗微球。
[0025]實施例2
1.emPCR擴增混合液的準備
(I)配制油相，混合 PGPE 450 yL 和 DC556 1300 μ L0
[0026](2)配制水相，加入 1x擴增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L PPiase2 μ L MgCl2(IM) 30 μ L emPCR 助劑 350 μ L 人血清蛋白 1yL 雙蒸無菌水余量總計 100yL
其中，emPCR 助劑為 Betaine 1.0M, D- (+) trehalose 0.2M，L-carnitine 0.4M，NP-40
0.6%，DTT ImM，DMSO 2.5%。
[0027]2.DNA文庫的捕獲
(1)使用CaptureBead Wash Buffer TW對磁性微球禍旋震蕩，重復兩次，5000rpm離心，除去上清；
(2)將清洗后的微球分裝至2mlEP管中；
(3)在分裝好的EP管中加入稀釋后的單鏈DNA文庫10μ L，渦旋震蕩10s，得到文庫混合液。
[0028]3.乳化
(I)將 span80 3.5%、tween80 0.3%、tween60 0.3% 和丙三醇 0.6 %。溶于油相，TritonX-100 0.7%溶于水相，混合。
[0029](2)加入文庫混合液和過硫酸鈉，置于TissueLyser進行乳化，20Hz破碎4分鐘。
[0030]4.emPCR 擴增 (I) PCR 擴增。
[0031]5.DNA文庫微球的富集回收 (I)收集乳化液。
[0032](2)使用異丙醇清洗磁性微球。
[0033](3 )使用NaCl清洗磁性微球。
[0034]實施例3
1.emPCR擴增混合液的準備
(I)配制油相，混合 DC5225C 300 μ L,PGFE 200 yL、DC193 800 yL、DC556 300 μ L 和礦物油400 μ Lo
[0035](2)配制水相，加入 1x擴增液 100 μ L ΙΟμΜ 引物 I 120yL 25 μ M 引物 2 40 μ L DNA聚合酶 80 μ L dNTP 120 μ L P