一種保存外周血中游離dna的保存劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及DNA保存領域，尤其涉及一種保存外周血中游離DNA的保存劑。
【背景技術】
[0002] 目前，外周血中的游離DNA在臨床上的應用越來越多，例如無創產前基因檢測和 腫瘤診斷都是以外周血中的游離DNA為檢測目標。在檢測過程中游離DNA的量的多少是一 個關鍵的指標，如果外周血中有白細胞或者核紅細胞破裂，那么基因組DNA將降解進入到 血漿中污染游離DNA，這會嚴重影響檢測結果。所以，在上述檢測過程中，外周血都要求在6 個小時之內分離出血漿，低溫保存運輸，并且保存時間不能過長。
[0003] 因此，現有技術還有待于改進和發展。

【發明內容】

[0004] 鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種保存外周血中游離DNA的 保存劑，旨在解決現有的血漿游離DNA保存方法保存時間短、保存溫度低的問題。
[0005] 本發明的技術方案如下： 一種保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，按質量百分比計，包括： 超純無菌水 60~80% ; 抗凝劑 5~8% ; 防腐劑 10~25% ; 代謝抑制劑 1~5%; 核酸酶抑制劑0. 5~3%。
[0006] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述抗凝劑包括EDTA鉀鹽、EDTA鈉 鹽、檸檬酸鈉、肝素及枸杞酸鈉中的一種或多種組合。
[0007] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述防腐劑包括二唑烷基脲、咪 唑烷基脲、1，3-二氯-5, 5-二甲基乙內酰脲、鈉羥甲基甘氨酸、二羥甲基脲、2-溴-2-硝 基-1，3-二醇、惡唑烷、鈉羥甲基甘氨酸及金剛烷季銨中的一種或多種組合。
[0008] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述代謝抑制劑包括ATA、甘油醛、 磷酸二羥丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化鈉及鉀代謝抑 制劑中的一種或多種組合。
[0009] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述核酸酶抑制劑硫酸銨、二硫蘇 糖醇、0 _巰基乙醇、半胱氨酸、二硫赤蘚醇及二價陽離子的一種或多種組合。
[0010] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述二價陽離子為Mg2 +、Mn2 +、Zn2 +、Fe2 +、Ca2 + 或Cu2 +。
[0011] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述防腐劑的濃度為50g/L~500g/ L〇
[0012] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述防腐劑的濃度為150g/ L~250g/L。
[0013] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述保存劑為半固態。
[0014] 所述的保存外周血中游離DNA的保存劑，其中，所述保存劑保存在真空采血管中。
[0015] 有益效果：本發明的保存劑可以保證外周血在常溫下保存7天以上，最多可至14 天，常溫運輸72小時以上，最多可至96小時，并且游離DNA的量在此期間內不會發生明顯 變化。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明實施例真空采血管（100yL保存劑）中血液樣品0天后的DNA片段 分布圖。
[0017] 圖2為本發明實施例真空采血管（100yL保存劑）中血液樣品3天后的DNA片段 分布圖。
[0018] 圖3為本發明實施例真空采血管（100yL保存劑）中血液樣品7天后的DNA片段 分布圖。
[0019] 圖4為本發明實施例StreckBCT管中血液樣品0天后的DNA片段分布圖。
[0020] 圖5為本發明實施例StreckBCT管中血液樣品7天后的DNA片段分布圖。
[0021] 圖6為本發明實施例真空采血管（200yL保存劑）中血液樣品0天后的DNA片段 分布圖。
[0022] 圖7為本發明實施例真空采血管（200yL保存劑）中血液樣品7天后的DNA片段 分布圖。
[0023] 圖8為本發明實施例真空采血管（200yL保存劑沖血液樣品14天后的DNA片段 分布圖。
【具體實施方式】
[0024] 本發明提供一種保存外周血中游離DNA的保存劑，為使本發明的目的、技術方案 及效果更加清楚、明確，以下對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施 例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0025] 本發明所提供的一種保存外周血中游離DNA的保存劑，按質量百分比計，包括： 超純無菌水 60~80% ; 抗凝劑 5~8% ; 防腐劑 10~25% ; 代謝抑制劑 1~5% 核酸酶抑制劑0. 5~3%。
[0026] 其中的超純無菌水，經過滅菌處理的超純水。
[0027] 進一步，所述抗凝劑包括EDTA鉀鹽、EDTA鈉鹽、檸檬酸鈉、肝素及枸杞酸鈉中的一 種或多種組合。抗凝劑的主要作用為防止血液凝固。
[0028] 進一步，所述防腐劑包括二唑烷基脲、咪唑烷基脲、1，3-二氯-5, 5-二甲基乙內酰 脲、鈉羥甲基甘氨酸、二羥甲基脲、2-溴-2-硝基-1，3-二醇、惡唑烷、鈉羥甲基甘氨酸及金 剛烷季銨中的一種或多種組合。防腐劑的主要作用是防止血液變質。優選地，所述防腐劑 為二唑烷基脲或咪唑烷基脲。
[0029] 進一步，所述代謝抑制劑包括ATA、甘油醛、磷酸二羥丙酮、甘油醛-3-磷酸、3-磷 酸-2-磷酸甘油酸、磷酸、丙酮酸、氟化鈉及鉀代謝抑制劑中的一種或多種組合。代謝抑制 劑可以減少游離DNA降解，也減少了細胞裂解，使得細胞DNA不會成為混入到游離DNA中。 優選地，所述代謝抑制劑為ATA、氟化鈉、甘油醛和它們的任意組合。更優選地，所述代謝抑 制劑為甘油醛、磷酸二羥丙酮、甘油醛-3-磷酸和它們的任意組合。
[0030] 進一步，所述核酸酶抑制劑為硫酸銨、二硫蘇糖醇（DTT)、巰基乙醇、半胱氨 酸、二硫赤蘚醇及二價陽離子的一種或多種組合。添加核酸酶抑制劑可防止DNA酶的活 性的降低，影響游離DNA的質量和數量。優選地，所述核酸酶抑制劑硫酸銨，二硫蘇糖醇 (DTT)〇
[0031] 進一步，所述二價陽離子為Mg2 +、Mn2 +、Zn2 +、Fe2 +、Ca2 + 或Cu2 +。
[0032] 進一步，所述防腐劑的濃度為50g/L~500g/L。更優選地，進一步，所述防腐劑的濃 度為150g/L~250g/L。所述防腐劑的濃度是應當小于核酸和蛋白交聯一起的濃度，該交聯 可以用瓊脂糖凝膠電泳所指示。
[0033] 進一步，本發明中的保存劑可位于一個專門的設備中，并在采血之前加入。更優 選，該設備是一個抽真空采集容器中，通常是一個管，也可以但不僅僅是真空采血管。所述 保存劑為半固態。其可以是高粘性的，使得其可以有效地作為一種半固態的涂層使用。
[0034] 真空采血管中保存劑的量足以維持細胞形態和防止細胞降解，同時也防止了游離 狀態中有害Dnase(核酸酶）活性。當然，核酸酶的活性也可以足夠低，使得在樣品中的游 離核酸沒有實質性稀釋。
[0035] 血液樣品被吸入到本發明的真空采血管中，至少7天后，游離DNA的存在量，至多 增加約5%。如果無保存液存在，則7天后游離DNA的量會增加至少10倍，甚至達到20倍 以上。游離DNA和細胞DNA混合會減少在血液樣品中的任何一種測量游離DNA的量的精確 度。例如，在某種特定癌癥的嚴重程度可通過游離DNA的