減毒沙門菌vnp20009在基因表達中的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種減毒沙門菌VNP20009在基因表達中的應用，具體涉及一種以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應基因的方法。
【背景技術】
[0002]沙門菌是一種侵襲性胞內菌，它與宿主之間的反應通過III型分泌機制介導，這種機制使細菌的效應蛋白能直接轉移到真核細胞發揮作用，使其可以傳遞表達效應基因并同時表達多種治療性蛋白。巨噬細胞是沙門菌的天然靶點，不僅在局部形成沙門菌的細胞靶點，而且建立細胞儲存庫使細菌系統性擴散。沙門菌侵入淋巴系統，通過血液循環定居在脾臟和肝臟等器官。
[0003]VNP20009是一種將野生型鼠沙門菌通過基因修飾構建的基因工程沙門菌，部分刪除了編碼脂質體A的末端序列msbB(明顯減低誘導血液中單核細胞產生TNF-α的能力)，并敲除purl基因(由于pur系列基因編碼嘌呤合成途徑中的一系列酶，purl基因缺失將影響嘌呤合成，進而影響DNA的合成從而使細菌毒性降低)，兩種突變使細菌毒力降低10000倍，同時沒有影響沙門菌的腫瘤正常組織比(>1000:1)，并保持了它們在原發灶及轉移灶內生長能力。
[0004]目前蛋白表達主要采用原核表達和真核表達系統，但有些蛋白卻不易表達，本研宄采用以減毒沙門菌VNP20009為載體，自行構建表達減毒沙門體系來有效地傳遞多種效應基因，避免了蛋白不易表達和主要表達在包涵體的缺陷。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種種減毒沙門菌VNP20009在基因表達中的應用，具體為以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應基因的方法。
[0006]本發明所述應用包括下列步驟:
1、沙門氏菌感受態制備:挑取沙門氏菌VNP20009單菌落接種至3mL無抗性LB培養中，37° C 200 rpm搖床培養過夜(約16 h)，次日將400 uL活化菌液加到40 mL無抗性LB液體培養基中，37° C 200 rpm搖床培養100 min至OD 600到達0.4左右將培養物冰上放置0.5 h，同時離心機預冷，5000 rpm離心5 min棄上清，沉淀用10%甘油10 mL懸浮細胞，冰上放置10 min重復離心，上述步驟再重復一次，最后一次離心的沉淀用400 uL 10%甘油重新懸浮細胞，感受態置冰上備用；
2、疫苗菌株構建:用電轉化法將C20重組質粒分別導入感受態沙門氏菌VNP20009中，電轉化條件:電壓2.5kv、電容25 u F、電阻200 Q ；
3、細胞侵染實驗:！1印62.2.15細胞以1父1O5細胞/孔的密度接種于96孔板，用無抗性培養基培養過夜，重組質粒細菌接種于I 00 ng / mL Amp抗性的LB培養基中，37°C恒溫搖床200 rpm振蕩培養過夜，至對數生氏晚期(0D600>3)，PBS清洗后用含有10% FBS的無抗性1640細胞培養基重懸；5X 10 7菌落形成單位的重組疫苗細菌加入細胞培養板內感染HepG2.2.15細胞，并且以空載體細菌作為對照，細菌與細胞共孵育3 h后，去除細胞培養上清，并用PBS清洗三遍，添加雙抗(100 U / mL氨芐青霉素和100 U / mL硫酸鏈霉素)去除沒有進入細胞內的細菌，培養1-2天后，檢測細胞分泌乙肝表面抗原的量。
[0007]4、Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原:
(I)加樣:根據檢驗要求，將選擇的預包被板條固定于板架，加入25ul樣品稀釋于板架，加入25ul樣品稀釋液于反應孔中。每次檢驗設陰性對照3孔、陽性對照2孔，加陰性、陽性對照各75ul ;設空白對照I孔，不加樣品，其余孔加入待測樣品75ul，振蕩混勻。
[0008](2)溫育:置37 ± 1° C溫浴60分鐘。
[0009](3)加酶:空白對照孔不加酶標記物，其余孔加入酶標記物50ul，振蕩混勻。
[0010](4)溫育:置37±1° C溫育30分鐘
(5)洗滌:棄去孔內液體，將稀釋后的洗液注滿各孔，靜置30-60秒，棄去孔內洗液。重復洗6次后拍干。
[0011](6)顯色:每孔加入底物緩沖液50ul，再加入底物液50ul，振蕩混勻，置37±1° C溫育30分鐘。
[0012](7)終止:每孔加入終止液50ul，輕拍混勻。
[0013](8)讀值:用酶標儀讀值，在單波長450nm (須以空白對照孔校零)或雙波長450nm/620nm-700nm 下讀取各孔 A 值。
[0014]本發明的有益效果:本發明以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應基因，既可攜帶原核表達質粒也可攜帶真核表達質粒，簡單方便，快速高效，適用于一些不易表達或主要表達在包涵體的蛋白。
【具體實施方式】
[0015]本發明所述應用包括下列步驟:
1、沙門氏菌感受態制備:挑取沙門氏菌VNP20009單菌落接種至3mL無抗性LB培養中，37° C 200 rpm搖床培養過夜(約16 h)，次日將400 uL活化菌液加到40 mL無抗性LB液體培養基中，37° C 200 rpm搖床培養100 min至OD 600到達0.4左右將培養物冰上放置0.5 h，同時離心機預冷，5000 rpm離心5 min棄上清，沉淀用10%甘油10 mL懸浮細胞，冰上放置10 min重復離心，上述步驟再重復一次，最后一次離心的沉淀用400 uL 10%甘油重新懸浮細胞，感受態置冰上備用；
2、疫苗菌株構建:用電轉化法將C20重組質粒分別導入感受態沙門氏菌VNP20009中，電轉化條件:電壓2.5kv、電容25 u F、電阻200 Q ；
3、細胞侵染實驗:！1印62.2.15細胞以1父1O5細胞/孔的密度接種于96孔板，用無抗性培養基培養過夜，重組質粒細菌接種于I 00 ng / mL Amp抗性的LB培養基中，37°C恒溫搖床200 rpm振蕩培養過夜，至對數生氏晚期(0D600>3)，PBS清洗后用含有10% FBS的無抗性1640細胞培養基重懸；5X 10 7菌落形成單位的重組疫苗細菌加入細胞培養板內感染HepG2.2.15細胞，并且以空載體細菌作為對照，細菌與細胞共孵育3 h后，去除細胞培養上清，并用PBS清洗三遍，添加雙抗(100 U / mL氨芐青霉素和100 U / mL硫酸鏈霉素)去除沒有進入細胞內的細菌，培養1-2天后，檢測細胞分泌乙肝表面抗原的量。
[0016]4、Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原: (I)加樣:根據檢驗要求，將選擇的預包被板條固定于板架，加入25ul樣品稀釋于板架，加入25ul樣品稀釋液于反應孔中。每次檢驗設陰性對照3孔、陽性對照2孔，加陰性、陽性對照各75ul ;設空白對照I孔，不加樣品，其余孔加入待測樣品75ul，振蕩混勻。
[0017](2)溫育:置37 ± 1° C溫浴60分鐘。
[0018](3)加酶:空白對照孔不加酶標記物，其余孔加入酶標記物50ul，振蕩混勻。
[0019](4)溫育:置37±1° C溫育30分鐘
(5)洗滌:棄去孔內液體，將稀釋后的洗液注滿各孔，靜置30-60秒，棄去孔內洗液。重復洗6次后拍干。
[0020](6)顯色:每孔加入底物緩沖液50ul，再加入底物液50ul，振蕩混勻，置37±1° C溫育30分鐘。
[0021 ] (7)終止:每孔加入終止液50ul，輕拍混勻。
[0022](8)讀值:用酶標儀讀值，在單波長450nm (須以空白對照孔校零)或雙波長450nm/620nm-700nm 下讀取各孔 A 值。
【主權項】
1.一種減毒沙門菌VNP20009在基因表達中的應用，其特征是: A、沙門氏菌感受態制備:挑取沙門氏菌VNP20009單菌落接種至3mL無抗性LB培養中，37° C 200 rpm搖床培養過夜(約16 h)，次日將400 uL活化菌液加到40 mL無抗性LB液體培養基中，37° C 200 rpm搖床培養100 min至OD 600到達0.4左右將培養物冰上放置0.5 h，同時離心機預冷，5000 rpm離心5 min棄上清，沉淀用10%甘油10 mL懸浮細胞，冰上放置10 min重復離心，上述步驟再重復一次，最后一次離心的沉淀用400 uL 10%甘油重新懸浮細胞，感受態置冰上備用； B、疫苗菌株構建:用電轉化法將C20重組質粒分別導入感受態沙門氏菌VNP20009中，電轉化條件:電壓2.5kv、電容25 u F、電阻200 Q ； C、細胞侵染實驗:！1印62.2.15細胞以1父1O5細胞/孔的密度接種于96孔板，用無抗性培養基培養過夜，重組質粒細菌接種于I 00 ng / mL Amp抗性的LB培養基中，37°C恒溫搖床200 rpm振蕩培養過夜，至對數生氏晚期(0D600>3)，PBS清洗后用含有10% FBS的無抗性1640細胞培養基重懸；5X 10 7菌落形成單位的重組疫苗細菌加入細胞培養板內感染HepG2.2.15細胞，并且以空載體細菌作為對照，細菌與細胞共孵育3 h后，去除細胞培養上清，并用PBS清洗三遍，添加雙抗(100 U / mL氨芐青霉素和100 U / mL硫酸鏈霉素)去除沒有進入細胞內的細菌，培養1-2天后，檢測細胞分泌乙肝表面抗原的量； D、Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原: (1)加樣:根據檢驗要求，將選擇的預包被板條固定于板架，加入25ul樣品稀釋于板架，加入25ul樣品稀釋液于反應孔中； 每次檢驗設陰性對照3孔、陽性對照2孔，加陰性、陽性對照各75ul ;設空白對照I孔，不加樣品，其余孔加入待測樣品75ul，振蕩混勻； (2)溫育:置37± 1° C溫浴60分鐘； (3)加酶:空白對照孔不加酶標記物，其余孔加入酶標記物50ul，振蕩混勻； (4)溫育:置37±1° C溫育30分鐘； (5)洗滌:棄去孔內液體，將稀釋后的洗液注滿各孔，靜置30-60秒，棄去孔內洗液，重復洗6次后拍干； (6)顯色:每孔加入底物緩沖液50ul，再加入底物液50ul，振蕩混勻，置37±1°C溫育30分鐘； (7)終止:每孔加入終止液50ul，輕拍混勻； (8)讀值:用酶標儀讀值，在單波長450nm(須以空白對照孔校零)或雙波長450nm/620nm-700nm 下讀取各孔 A 值。
【專利摘要】一種減毒沙門菌VNP20009在基因表達中的應用包括：沙門氏菌感受態制備；疫苗菌株構建；細胞侵染實驗；Elisa法檢測乙型肝炎病毒表面抗原。本發明以減毒沙門菌VNP20009為載體來傳遞效應基因，既可攜帶原核表達質粒也可攜帶真核表達質粒，簡單方便，快速高效，適用于一些不易表達或主要表達在包涵體的蛋白。<b/>
【IPC分類】C12R1-42, C12N15-74, C12N15-51
【公開號】CN104805113
【申請號】CN201510223921
【發明人】陳廷濤, 鄧侃, 辛洪波
【申請人】南昌大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年5月6日