缺失crp的禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及缺失cr/7的禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株 及其構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 多殺性巴氏桿菌/Aocit/a)屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬。一 般將多殺性巴氏桿菌分為三個亞種，包括包括：多殺亞種（， multocida)，條氣覽蝸IP. multocida subspecies gallicidd)，敗奴覽蝸IP. multocidase/Vica)，多殺性巴氏桿菌/hocit/a)各亞種對不同的動物致 病力不同。該菌能在多種哺乳動物和禽類引起嚴重的疾病，主要使動物發生出血性敗血癥 或傳染性肺炎。人在被貓狗抓傷也可見感染該菌的病例。多殺性巴氏桿菌在世界范圍內廣 泛流行，可經呼吸道或口腔等方式感染多種動物，給養殖業和畜牧業造成重大經濟損失，其 引起的疾病統稱為巴氏桿菌病，被世界衛生組織定為一類重要動物傳染病。該菌可侵害包 括雞鴨在內的禽類，多引起以出血性敗血癥為特征的禽霍亂，患病禽類多呈急性經過，1至 3天便可死亡，在我國養禽業中造成的損失僅次于新城疫。
[0003]多殺性巴氏桿菌在我國也呈一定的流行。胡東良等對我國116株禽源多殺性巴氏 桿菌進行了血清型的分析研究，表明引起我國禽巴氏桿菌的主要血清型是A:1型。另外分 離自豬不同部位的豬源性巴氏桿菌，其血清型有差異，唐先春等對分離自豬的鼻拭子或肺 臟的66株多殺性多殺巴氏桿菌進行了血清型鑒定，D組多殺性巴氏桿菌占69. 7%，A組占 27. 3%。苑士祥等1985~1990年間我國不同地區的130株豬源巴氏桿菌進行了血清型分型 鑒定，結果表明存在豬鼻腔的菌株型是D: 3型，而存在于肺臟中的菌株型為A: 1和D: 3型。 我國牛源多殺性巴氏桿菌主要存在的是B組。
[0004]在原核生物中，全局調控基因cr/7編碼調控CAMP受體蛋白作為整體轉錄調控子 能調控多種毒力相關基因，從而影響細菌毒力。鞭毛是細菌的運動器官，直接影響到細菌 的吸附性和侵襲性，而這也正是細菌產生致病作用的第一步，cr/7能調控鞭毛的生物合成的 相關基因；還能調節細菌的群體感應效應，影響細菌的吸附力和侵襲力，包括運動、競爭、結 合、毒素的產生等；也可影響生物膜的形成，近幾十年來，研究逐漸表明自然界中的微生物 主要是以群體即生物膜的方式存在，這一形式具有更強的適應外界環境的能力，能導致微 生物產生抗藥性及感染性疾病并難以治療；cr/7能調節細菌對外界如鐵離子的吸收，從而 直接影響細菌的生長及間接影響毒素的產生；cr/7對細菌致病力的影響最重要的是表現在 對毒力基因的調控上，例如在鼠疫耶爾菌森氏菌中，對毒力基因謙]負調控作用，在腸 道細菌中還能調控腸道毒素的產生，例如在霍亂弧菌中霍亂毒素及其相關纖毛的表達受到 了 Crp-cAMP復合物的負向調節，在大腸桿菌中，腸毒素STa和STb也受到Crp-cAMP復合 物的調節。
[0005] cr/7基因已在鼠傷寒沙門氏菌等細菌減毒突變疫苗中被廣泛研究應用。Roy等 通過構建沙門氏菌A cr/7 A cja雙基因缺失株，突變后菌株的生長速度較野生株明顯減 慢，通過口服免疫少量缺失株30天后，動物對野生性鼠傷寒沙門氏菌獲得免疫效應。 Peighambari等以禽致病性大腸桿菌△ cja突變株制備疫苗，對其安全性，免疫原性 及效能做了評價，實驗結果顯示，實驗組動物沒有發生病變，且體內IgG抗體水平明顯升 高，能夠達到一定的保護作用。在鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌等一系列細菌中，c/y?，cja等 全局調控基因的缺失引起細菌的毒力明顯下降，除本身可作為減毒疫苗保護強毒野生株感 染外，還由于其通常表現出很好的免疫耐受性和免疫原性，可通過構建平衡致死系統，作為 載體表達外源抗原制備活菌疫苗，為研究防治其他細菌感染的疫苗提供選擇。
[0006] 隨著對多殺性巴氏桿菌遺傳學、生物化學和毒力研究的廣泛深入，基因缺失疫苗 不僅成為當前新型疫苗的研究趨勢，更是我國發展經濟、安全、高效獸用疫苗的政策要求。 而在多殺性巴氏桿菌中全局調控基因cr/7研究尚未見報道，現有技術尚未將其納入已知或 潛在的毒力相關基因，更沒有報道通過對cr/7改造是否可以獲得減毒菌株。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的之一是提供一株禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株，該減毒菌株缺失了 cr/7基因片段；所述CT/基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；該減毒菌株的分類命 名為subsp. strpmOSIS Ac/y?,保藏于武漢市武昌 珞珈山的中國典型培養物保藏中心（武漢大學），保藏號為CCTCC NO: M 2014523,保藏時 間為2014年10月29日。
[0008] 所述減毒菌株中的cr/7基因片段由卡那霉素基因片段所替代，所述卡那霉素基因 片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 本發明通過敲除cr/7基因得到了禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株，發現了 cr/7基因在 構建減毒菌株的應用。任何利用其它常規方法敲除cr/7基因并獲得禽多殺性巴氏桿菌的方 法，均沒有背離本發明的保護范圍和精神，仍屬本發明的保護范疇。
[0010] 本發明的目的之二是一種禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株的構建方法，該方法包括如 下步驟： 1) 對cr/7基因片段的上同源臂和下同源臂進行擴增；對卡那霉素基因片段進行擴增； 2) 以禽多殺性巴氏桿菌山0818基因組為模板，克隆cr/7基因片段的上同源 臂和下同源臂，以質粒DNA pYA4372為模板，克隆卡那霉素基因片段； 3) 融合片段構建：以cr/7基因片段的上同源臂和下同源臂為模板，擴增同源臂融合片 段； 4) 用酶切質粒pRE112,回收純化酶切產物，用連接試劑盒連接pRE112大片段與 同源臂融合片段，連接產物經轉化和質粒抽提后，得到質粒PRE112-A cr/7; 5) 用和分別雙酶切pRE112-A cr/7質粒和卡那霉素基因片段，純化回收酶 切產物，用連接試劑盒連接pRE112-Acr/7酶切回收產物和卡那霉素基因片段酶切回收產 物，連接產物經轉化和質粒抽提后，得到質粒PRE112- A c/77: : ^a/7; 6) 將 pRE112-Acr/7:: 轉化入 c7213 感受態細胞，以含有 pRE112-A cr/7:: 的 c7213菌株為供體菌，以A 0818菌株為受體菌，進行接合轉移，經PCR鑒定后，得 到禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株； 所述cr/7基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 所述卡那霉素基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示； 所述cr/7基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示； 所述cr/7基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0011] 優選地，所述步驟1)中，對cr/7基因片段的上同源臂進行擴增，擴增片段為381bp ; 對cr/7基因片段的下同源臂進行擴增，擴增片段為406bp，其中上臂的末端和下臂的前端包 含18bp相同的重復序列，便于上下臂的融合。
[0012] 上下游同源臂的大小在300至1200之間均可，選擇該大小區間擴增片段可較好滿 足實驗的需要。
[0013] 在所述構建方法中，進行步驟2)的克隆時，PCR反應體系為：模板DNA liiL， 25mmol/L MgCl2 0? 5 ii L，buffer 10 ii L，10μmol/L 上、下游引物各 1 ii L，2mmol/L dNTPs 1 ii L，DNA polymerase 0? 75 ii L，ddH20 34. 75 ii L，供 50 ii L ;具體反應條件為：98°C 變性 5min后進入循環，循環參數為94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次，循 環后72°C延伸10min。
[0014] 所述構建方法中，進行步驟3)的融合片段構建時，PCR反應體系為：于50yL反 應體系中：上下同源臂各liiL，25mmol/L MgCl2 0. 5iiL，10iimol/L上、下游引物各liiL， 2mmol/L dNTPs，DNA polymerase 0.2iiL，ddH20 33.75 iiL;具體反應條件為：98°C 變性 5min后進入循環，循環參數為94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共循環30次，循 環后72°C延伸10min。
[0015] 所述步驟6)的PCR鑒定的步驟為：吸取適量菌液涂布于含終濃度為50 y g/mL卡 那霉素的BHI瓊脂平板，于37°C培養20h ;用基因內引物indF/indR進行菌株的PCR 初步鑒定；疑似菌落再用引物OcF/InhwR和Oc-R/In^a/7-F進一步鑒定；所述引物為： incrp-F：AGGTGAAAAAGCCGAGACGC incr/^R ：GCGAACATCCCACCATTTGC 0c-F ：TGTTTGAAGCCTTGATTGAT Inkar^R：CTGATTCAGGTGAAAATATTG 0c-R ：GTCATTTCACCTGAATAAGC Inkarr-V：CAATATTTTCACCTGAATCAG〇
[0016] 所述構建方法中，用于擴增或克隆cr/7基因片段的上同源臂的引物為： F:CGCATCTGGTGAACCTGTGT R:TACCTGCAGGATGCGGCCGCGGAAGACCTCCATAAACTAAT 用于擴增或克隆cr/7基因片段的下同源臂的引物為： F：CGCGGCCGCATCCTGCAGGTAATCCCCGGTTCTCTGCTA R ：GGCACGTTGCACATGAATC 用于擴增或克隆卡那霉素基因片段的引物為： F ：ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGGAACGAAAACTC R：CCTGCAGGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC 〇
[0017] 所述步驟6)的接合轉移的步驟為：用LB液體培養基培養供體菌和腦心浸液培養 基培養受體菌過夜，各取200 y L混合均勻后收集菌體，用10mM 1%504清洗兩遍，用0. 45 y m 濾膜過濾菌液，取下濾膜貼于含50y g/mL的DAP的腦心浸液瓊脂平板，37°C培養lOh ;用 5mL 10mM MgS04洗下濾膜上的菌體。
[0018] 本發明的第三個目的是提供禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株在疫苗上的應用。
[0019] 本發明的有益效果： 1、 目前，禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株的構建方法十分有限，本發明成功構建了缺失C/7? 基因的禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株，該菌株毒力很弱，本發明為構建該菌減毒菌株提供了 一個新途徑； 2、 本發明構建的禽多殺性巴氏桿菌減毒菌株可用于疫苗的制備。
【附圖說明】
[0020] 圖1克隆禽多殺性巴氏桿菌cr/7基因的電泳圖譜，其中M代表DNA Marker ; 圖2是本發明中利用到的質粒圖譜，其中（A)為pYA332質粒圖譜，（B)為pYA3337質 粒圖譜，（C)為pRE112質粒圖譜，圖（D)為pMC-Express質粒圖譜； 圖3是異源互補實驗鑒定禽多殺