一種鼠類攜帶病原體的TaqMan低密度檢測芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及鼠類攜帶的病原體檢測，具體涉及一種鼠類攜帶病原體的TaqMan低密度檢測芯片。
【背景技術】
[0002]鼠類屬嚙齒動物，是重要的醫學媒介生物，可以以儲存宿主或中間宿主的形式在全球范圍內傳播各類疾病，成為造成人類嚴重的眾多衛生問題之一，已知全球可由鼠類傳播的疾病中病毒性疾病有30余種。如拉沙熱病毒等能引起嚴重的人類病毒性出血熱，病死率最高可達30%;淋巴脈絡叢腦炎病毒等則會引起腦炎癥狀。隨著國際間交流日益頻繁，鼠類攜帶強致病性病原體的傳入及赴流行地區感染鼠類的危險日益加大。目前，鼠類攜帶病原體中病毒的培養分離為其診斷的金標準，但細胞培養需要較高的實驗室條件，同時大多數病毒感染性強，需在4級生物安全實驗室內操作，很大程度上限制了該方法的應用。血清學檢測方法和病毒核酸檢測方法使得在較低生物安全條件下能夠進行病毒檢測得到更廣泛應用個，尤其是以PCR技術為代表的核酸檢測技術。熒光定量PCR術是據普通PCR技術發展起來的基因檢測新技術，它具有快速、特異性強、靈敏度高等特點，被廣泛應用于生命科學研宄的各個領域。TaqMan低密度芯片本質是基于微流控技術的實時熒光定量PCR檢測系統，將TaqMan技術的專一性、靈敏性及便捷性與實時定量PCR技術結合起來的一種技術，TaqMan低密度芯片科研根據用戶在反應板中固話不同的探針和引物，可以同時檢測I個標本的384個不同檢測項目或8個標本的48個檢測項目，節省試劑，操作簡便。與普通芯片相比較，不僅方便與高通量性，同時可以提供熒光定量PCR的特性，具有高特異性、高靈敏度以及寬幅的檢測范圍。目前，尚未有報道基于TaqMan低密度芯片技術建立同時對鼠類攜帶拉沙熱病毒、淋巴脈絡叢腦膜炎病毒等24種病毒檢測技術的專利及文獻。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種鼠類攜帶病原體的TaqMan低密度檢測芯片，可以同時檢測拉沙熱病毒、淋巴脈絡叢腦膜炎病毒、薩累瑪病毒等24種強致病性病毒，能夠高通量、靈敏、準確的檢測鼠類攜帶上述24種強致病性病毒。
[0004]本發明的技術方案是一種鼠類攜帶病原體的TaqMan低密度檢測芯片，包括384孔TaqMan低密度芯片，固定于TaqMan低密度芯片上檢測各類病毒的引物和探針，該TaqMan低密度芯片上固定有:檢測拉沙熱病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQID N0.1至SEQ ID N0.3 ;檢測多不拉伐病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.4至SEQ ID N0.6 ;檢測辛諾柏病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.7至SEQ ID N0.9 ;檢測淋巴脈絡叢腦膜炎病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.10至SEQ ID N0.12 ;檢測通托河病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.13至SEQ ID N0.15 ;檢測薩累瑪病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.16至SEQ ID N0.18 ;檢測貝尤病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.19至SEQ ID N0.21 ;檢測貝爾梅霍病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.22至SEQ ID N0.24 ;檢測莫佩亞病毒病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.25至SEQ ID N0.27 ;檢測黑山病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.28至SEQ ID N0.30 ;檢測藍河病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.31至SEQ ID N0.33 ;檢測卡塔琳娜病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.34至SEQ ID N0.36 ；檢測格伯格洛伯病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.37至SEQ IDN0.39 ;檢測島景病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.40至SEQ IDN0.42 ;檢測萊奇瓜納斯病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.43至SEQ ID N0.45 ;檢測馬西埃爾病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ IDN0.46至SEQ ID N0.48 ;檢測美利奴病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQID N0.49至SEQ ID N0.51 ;檢測莫羅戈羅病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.52至SEQ ID N0.54 ;檢測奧科索科奧特拉-德埃斯皮諾薩病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.55至SEQ ID N0.57 ;檢測奧洛格蘭德病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.58至SEQ ID N0.60 ;檢測斯金納坦克病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.61至SEQ ID N0.63 ；檢測瓜納瑞托病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.64至SEQ IDN0.66 ;檢測查帕雷病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.67至SEQID N0.69 ;檢測盧約病毒的引物和探針，其核苷酸序列分別為序列表中SEQ ID N0.70至SEQID N0.72。
[0005]本發明所述的TaqMan低密度檢測芯片，還包括陰性對照和陽性對照，陰性對照為正常組織細胞RNA，陽性對照可以為人工合成上述24種病毒的陽性質粒擴增目的片段轉錄RNA:pGEM-T-拉沙熱病毒、pGEM_T_多不拉伐病毒、pGEM_T_辛諾柏病毒、pGEM_T_淋巴脈絡叢腦膜炎病毒、pGEM-T-通托河病毒、pGEM-T-薩累瑪病毒、pGEM-T-貝尤病毒、pGEM-T-貝爾梅霍病毒、pGEM_T_牛輒湖病毒、pGEM_T_黑山病毒、pGEM_T_藍河病毒、pGEM_T_卡塔琳娜病毒、pGEM-T-格伯格洛伯病毒、pGEM-T-島景病毒、pGEM-T-萊奇瓜納斯病毒、pGEM-T-馬西埃爾病毒、pGEM-T-美利奴病毒、pGEM-T-莫羅戈羅病毒、pGEM_T_奧科索科奧特拉_德埃斯皮諾薩病毒、pGEM-T-奧洛格蘭德病毒、pGEM-T-斯金納坦克病毒、pGEM-T-瓜納瑞托病毒、PGEM-T-查帕雷病毒、pGEM-T-盧約病毒，其建立方法為將引物擴增區域前后延長進行基因合成為陽性質粒基因序列(序列分別如SEQ ID NO:73-96),然后將其克隆至pGEM-T-easy載體中，通過轉錄為RNA后為陽性RNA樣品。
[0006]本發明具有下列優點:一種鼠類攜帶病原體的TaqMan低密度檢測芯片，可以同時檢測拉沙熱病毒、淋巴脈絡叢腦膜炎病毒、薩累瑪病毒等24種強致病性病毒，能夠高通量、靈敏、準確的檢測鼠類攜帶的24種強致病性病毒。降低交叉污染機會，避免了不同病毒引物和探針之間交叉反應，提高反應的特異性和靈敏性，同時節約試劑盒模板使用量，在一塊384孔TaqMan低密度檢測芯片上同時可以對8個樣品192個項目同時檢測，大大縮短了檢測時間，操作簡便。
【具體實施方式】
[0007]實施例1、鼠類攜帶病原體的TaqMan低密度檢測芯片的制備
特異性引物探針制備:根據Genbank下載已公布鼠類攜帶病原體中需要的24種病毒基因序列，使用Beacon designer 7.0、Primer Express 3.0等軟件進行特異性引物和探針設計，選擇引物長度在18-24bp之間，Tm值在58-62°C之間，GC含量在40%_60%之間。探針長度在18-25bp，TM值在65-67°C之間。得到特異性引物和探針24組，檢測引物和探針的核苷酸序列分別為為SEQ ID N0.1至SEQ ID N0.72所示。陽性模板制備:將設計的24種病毒的特異性引物擴增區域前后延長進行基因合成為陽性質粒基因序列(序列分別如SEQ IDNO:73-96),然后將其克隆至pGEM-T-easy載體中，人工合成拉沙熱病毒、淋巴脈絡叢腦膜炎病毒等24種核酸片段(上海生工生物工程有限公司合成)，連接至pGEM-T easy載體，轉化至DH5a大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽性克隆和陰性克隆增菌培養，使用質粒提取試劑盒(寶生物工程公司)提取陽性質粒。使用T7啟動子引物和Oligod (T)15擴增目的片段，反應體系:而 11.8μ?、10 X PCR Buffer 2μ?、dNTP (2.5mM each) 1.6μ?、rTaq (5U/μ?)0.4μ?,Mgcl2L 2μ?、T7 (20 μ Μ) lPL、oligod (T) 15 ?μ?、質粒模板 ?μ?，共 20μ?。反應條件 94°C 5min,9