本發明屬于病原體檢測領域，特別涉及一種用于定量檢測灰霉菌的特異引物及其應用。

背景技術：

灰霉菌(botrytiscinerea)，又稱灰葡萄孢菌，是葡萄孢屬中的一類絲狀子囊真菌，其寄主范圍十分廣泛，能夠引起200多種雙子葉作物和一些觀賞花卉感染灰霉病。灰霉菌在空氣中廣泛存在，其具有多種感染模式，能以菌絲、分生孢子及菌核的形式感染，不僅能夠侵染田間作物，同樣會給植物的采后階段造成巨大損失。目前灰霉病防治仍然是一大難題，截止2013年，世界上尚未發現有任何一種植物對灰霉菌產生抗性。

傳統的對灰霉菌的檢測方法，如生理生化指標鑒定方法，細菌的分離培養鑒定方法等都是依靠表型來鑒定致病菌；這些方法耗時長，靈敏度很低，而且準確度差。

疊氮溴化丙錠(pma)是一種能與dna高度親和的熒光染料，它能穿過受損細胞膜，在可見光的照射下與dna共價交聯，從而達到阻礙受損細胞中的dna進行pcr擴增的作用。有研究報道過pma-qpcr方法結合檢測活的病原體含量，但僅限應用于水體中。普通的qpcr方法雖然能夠對致病菌進行定量，但不能區分致病菌的死活。有研究表明致病菌在死亡后數天甚至數周內dna都能夠保持完整，因此如何區分病原體的死活就成為分子檢測手段的巨大挑戰。

綜上所述，農業生產中迫切需要構建一種重復性好、耗時短、靈敏度高的灰霉菌的分子檢測方法，這對于農業生產中預防和控制疾病有著很重要的意義。

技術實現要素：

為了解決現有技術中存在的上述問題，本發明提供了一種用于定量檢測灰霉菌的引物及其應用。

本發明的發明人經過大量的研究發現，通過將pma染料與定量pcr結合，使用設計的特異性的引物，可以定量檢測作物(例如黃瓜)殘體中的活病原體的含量和全部的灰霉菌病原體含量，再經過計算可以得到同一單位質量組織內活的灰霉菌病所占的百分比。因此，該方法的建立可以成為判斷在農業生產中針對患病植株進行處理的有效性的一種手段。

本發明的第一個方面提供了一種用于定量檢測灰霉菌的引物對，所述引物對含有序列表中seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列：

seqidno.1：gcgtaagacggtccatccat

seqidno.2：gcactcggcgatccagataa。

本發明的第二個方面提供了根據本發明的第一個方面的用于定量檢測灰霉菌的引物對在定量檢測灰霉菌中的應用。

本發明的第三個方面提供了根據本發明的第一個方面的用于定量檢測灰霉菌的引物對在制備用于定量檢測灰霉菌的試劑盒中的應用。

本發明的第四個方面提供了一種用于定量檢測灰霉菌的試劑盒，所述試劑盒含有根據本發明的第一個方面的用于定量檢測灰霉菌的引物對。

本發明的第五個方面提供了一種定量檢測灰霉菌的方法，所述方法包括：

對待測樣品進行pma處理，然后進行提取dna的操作，再以提取的dna為模板，用根據本發明的第一個方面的用于定量檢測灰霉菌的引物對進行pma-qpcr擴增；以及，

直接對待測樣品進行提取dna的操作，再以待測樣品的dna為模板，用根據本發明的第一個方面的用于定量檢測灰霉菌的引物對進行qpcr擴增；

根據上述的qpcr擴增和pma-qpcr擴增的結果，計算活的灰霉菌的含量。

優選地，所述根據qpcr擴增和pma-qpcr擴增的結果，計算活的灰霉菌的含量的方法如下：

y1＝-3.209*lg(x1)+40.25

y2＝-3.209*lg(x2)+40.25

r＝x2/x1

其中，

“x1”為qpcr擴增測得的灰霉菌的起始拷貝數；“y1”為qpcr擴增的ct值；

“x2”為pma-qpcr擴增測得的活的灰霉菌的起始拷貝數；“y2”為pma-qpcr擴增的ct值；

“r”為活的灰霉菌占全部灰霉菌的比例。

優選地，所述對待測樣品進行pma處理的操作包括：

將pma工作液加入經過粉碎處理的待測樣品中，使得pma的終濃度達到5-20μg/ml，優選6-9μg/ml或8-12μg/ml或11-19μg/ml或12-18μg/ml或13-20μg/ml；然后光照處理3-8min，優選4-6min，進一步優選5min。

優選地，所述pma工作液為用20％的dmso配制成的1μg/μl的溶液。

優選地，所述對待測樣品進行pma處理的操作在避光和低溫的條件下進行，優選在避光和冰上進行。

優選地，所述qpcr擴增和pma-qpcr擴增的程序為：首先95℃3min，然后95℃1min、57℃45s、72℃1min的條件下進行35個循環。

本發明提供的用于定量檢測灰霉菌的方法，創造性地將pma染料與實時定量pcr結合，從而可以準確、快速的鑒定灰霉菌并準確對活菌數進行定量。

本發明提供的用于定量檢測灰霉菌的特異引物可以高效、準確地擴增出目的片段。

本發明的其他特征和優點將在如下的具體實施方式部分詳細描述。

附圖說明

圖1是本發明實施例1中的pcr反應產物的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；圖中，“m”代表marker，從上到下的條帶依次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp的條帶；s1和s2均為樣品條帶，均在500bp位置處；ck為不含dna的陰性對照。

圖2是本發明實施例1中的引物的測試結果。

圖3是本發明實施例1的qpcr擴增曲線圖；圖中，從左到右的六束曲線分別代表5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹和5×10⁰六個質粒稀釋梯度，每束曲線有三條，分別代表每個濃度梯度有三個重復。

圖4是本發明實施例1的qpcr擴增的標準曲線圖。

具體實施方式

為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的實施方式作進一步地詳細描述。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。

本發明中的灰霉菌(botrytiscinerea)又稱灰葡萄孢菌。

本發明的第一個方面提供了一種用于定量檢測灰霉菌的引物對，所述引物對含有序列表中seqidno.1和seqidno.2所示的核苷酸序列：

seqidno.1：phmfgcgtaagacggtccatccat

seqidno.2：phmrgcactcggcgatccagataa

本發明的第二個方面涉及本發明的第一個方面提供的用于定量檢測灰霉菌的引物對在定量檢測灰霉菌中的應用。

本發明的第三個方面涉及本發明的第一個方面提供的用于定量檢測灰霉菌的引物對在制備用于定量檢測灰霉菌的試劑盒中的應用。

本發明的第四個方面涉及一種用于定量檢測灰霉菌的試劑盒，所述試劑盒含有根據本發明的第一個方面提供的用于定量檢測灰霉菌的引物對。

本發明的第五個方面涉及一種定量檢測灰霉菌的方法，所述方法包括：

對待測樣品進行pma(propidiummonoazide，疊氮溴化丙錠)處理，然后進行提取dna的操作，再以提取的dna為模板，用本發明的第一個方面提供的用于定量檢測灰霉菌的引物對進行pma-qpcr擴增；以及，

直接對待測樣品進行提取dna的操作，再以待測樣品的dna為模板，用本發明的第一個方面提供的用于定量檢測灰霉菌的引物對進行qpcr擴增；

然后根據上述的qpcr擴增和pma-qpcr擴增的結果，計算活的灰霉菌的含量。

根據本發明的第五個方面，所述待測樣品優選為番茄，進一步優選為番茄葉片。

所述對待測樣品進行pma處理的操作可以包括：將pma工作液加入經過粉碎處理的待測樣品中，使得pma的終濃度達到5-20μg/ml，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20μg/ml之中的任意一個或者位于任意兩個之間的濃度，例如6-9μg/ml、8-12μg/ml、11-19μg/ml、12-18μg/ml和13-20μg/ml之中的任意一個范圍。然后光照處理3-8min，優選4-6min，進一步優選5min。對待測樣品進行粉碎處理的操作方式可以包括但不限于：將待測樣品(例如患病的番茄葉片)迅速放進研缽中用液氮研磨，然后將獲得的粉末轉移至ep管中，再向ep管內加入pbs緩沖液，渦旋振蕩使其混合均勻。所述對待測樣品進行pma處理的操作優選在避光和低溫的條件下進行，例如可以采用鋁箔或者錫箔將上述ep管包住，并在冰上進行操作。其中，所述pma工作液可以為用20％的dmso配制成的1μg/μl的pma工作液，所述pma工作液可以在-20℃避光保存備用。

在本發明的一種具體實施方式中，可以采用如下操作方式來對待測樣品進行pma處理：

將待測樣品(例如，患病葉片)迅速放進研缽中用液氮研磨，然后將獲得的粉末轉移至ep管中，按照每50mg粉末加入1ml的pbs的量向ep管內加入pbs緩沖液，渦旋振蕩；然后用鋁箔紙將ep管包住，再向管內加入20％的pma工作液，使pma的終濃度達到20μg/ml；將加入了pma的ep管放入搖床中，以150r/min的轉速震蕩5min，再將ep管置于冰上，使用500w氯素燈照射5min，每間隔30s轉動ep管，使其照射均勻。pma處理完畢后將ep管在10000rpm下離心5min，盡量去除液體后再對剩下的固體物質進行提取dna的操作。

所述提取dna的操作可以使用ctab法進行，也可以采用市售的dna提取試劑盒進行所述的提取dna的操作來提取待測樣品的總dna，例如采用天根生化科技(北京)有限公司的牌號為dp305基因組提取試劑盒提取待測樣品的總dna。

所述qpcr擴增和pma-qpcr擴增的程序均可以為：首先95℃3min，然后95℃1min、57℃45s、72℃1min的條件下進行35個循環(即，將95℃1min、57℃45s、72℃1min進行35個循環)。

所述qpcr擴增和pma-qpcr擴增的反應體系均可以為：實時pcr擴增預混緩沖液(不包括模板、引物的預混液，例如，購自天根生化科技(北京)有限公司的牌號為fp206的superrealpremixplus)12.5μl、seqidno.1和seqidno.2的引物各0.75μl(引物濃度均為80-120μmol/l，優選100μmol/l)、dna模板2μl(濃度可以為150-500μg/μl，優選200μg/μl)，加水補足至25μl。優選地，為了便于計算活的灰霉菌的含量，所述qpcr擴增和pma-qpcr擴增中使用的dna模板的濃度相同。可以通過測定dna模板的od值的方式來調整qpcr擴增和pma-qpcr擴增中使用的dna模板的濃度，并使二者相同。

根據上述的qpcr擴增和pma-qpcr擴增的結果，計算活的灰霉菌的含量的方法如下：

y1＝-3.209*lg(x1)+40.25

y2＝-3.209*lg(x2)+40.25

r＝x2/x1

其中，

“x1”為qpcr擴增(未經pma處理)測得的灰霉菌的起始拷貝數(即：全部的灰霉菌的數量，包括活的和死的)；“y1”為qpcr擴增的ct值；

“x2”為pma-qpcr擴增(經過pma處理)測得的活的灰霉菌的起始拷貝數(即：活的灰霉菌的數量)；“y2”為pma-qpcr擴增的ct值；

“r”為活的灰霉菌占全部灰霉菌的比例。

其中，ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，因此，可以通過ct值計算得到模板的起始拷貝數。

例如，提取基因組時用50mg患病葉片，所以獲得的拷貝數為50mg患病葉片中獲得的拷貝數，加pma處理的為活的灰霉菌的數量，不加pma處理的為全部灰霉菌的拷貝數，pma處理組與非pma處理組為活的灰霉菌所占的比例。使用這種方法可以用來測定、比較農業上不同殺菌方法的殺菌效率。

以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細描述。

其中，pma為購自上海開放生物有限公司銷售的biotium品牌商品。

實施例1

本實施例用來說明用于定量檢測灰霉菌的特異引物對的獲得和驗證。

取患上灰霉菌病的黃瓜葉片，放入研缽中，加入液氮充分研磨，使用購自天根生化科技(北京)有限公司的牌號為dp305的dna提取試劑盒提取dna，調整dna溶液的濃度至200μg/μl。

使用p729+/p729-引物對，以上述提取的dna為模板，按照如下pcr擴增體系和程序進行pcr擴增：

pcr反應體系：(總體積50μl)

加ddh2o至50μl，混勻，短暫離心。

pcr反應程序：

首先，95℃3min，然后(95℃1min、57℃45s、72℃1min)進行35個循環。

其中，

pcr反應體系中的p729+/p729-引物對如下：

p729+引物：5'-agctcgagagagatctctga-3'

p729-引物：5'-ctgcaatgttctgcgtggaa-3'

對獲得的pcr反應產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現可以獲得729bp大小的dna條帶(結果如圖1所示。圖1中，“m”代表marker，從上到下的條帶依次為600bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp的條帶；s1和s2均為樣品條帶，均在500bp位置處；ck為不含dna的陰性對照)。

從瓊脂糖凝膠中回收純化s1和s2的729bp位置處的dna片段，經過測序后發現具有序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列組成，再經過blast驗證發現，其與灰霉菌具有百分之百的同源性。

將從瓊脂糖凝膠中回收的729bp大小的dna片段，使用天根生化科技(北京)有限公司的pgm-tfast克隆試劑盒-vt307的載體連接試劑盒連接到puc19載體上，并將載體轉化大腸桿菌感受態細胞，經篩選培養后提取大腸桿菌質粒，將質粒測序后證實上述729bp大小的dna片段已經連接到載體上。

根據上述的729bp大小的dna片段的核苷酸序列組成，設計引物，引物的設計除了遵循一般原則外，還要控制pcr擴增的產物介于70bp-120bp，經測試發現上述seqidno.1和seqidno.2所示的引物對的峰值單一，無引物二聚體和非特異性擴增(結果見圖2)。

提取培養后的上述轉化的大腸桿菌感受態細胞的質粒，并將質粒稀釋5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹和5×10⁰六個梯度后為分別作為模板，使用上述seqidno.1和seqidno.2所示的引物對進行qpcr擴增，qpcr反應體系和反應程序如下所示：

qpcr反應體系：

qpcr反應程序：首先95℃3min，然后95℃1min、57℃45s、72℃1min的條件下進行35個循環。

上述qpcr反應體系中，seqidno.1引物和seqidno.2引物的濃度均為100μmol/l。

上述qpcr反應體系中，實時pcr擴增預混緩沖液為購自天根生化科技(北京)有限公司的貨號為fp206的superrealpremixplus。

qpcr擴增曲線如圖3所示，圖3中，從左到右的六束曲線分別代表5×10⁵、5×10⁴、5×10³、5×10²、5×10¹和5×10⁰六個質粒稀釋梯度，每束曲線有三條，分別代表每個濃度梯度有三個重復。由圖3可以看出，擴增曲線重復性很好(六個濃度梯度的擴增曲線走勢基本一致)，說明上述引物和反應體系以及反應程序可以很好地用于灰霉菌的qpcr檢測。

標準曲線如圖4所示，由圖4可以看出，標準曲線的相關性很好，并且上述引物的擴增效率也很好。

綜上可見，seqidno.1和seqidno.2所示的引物對可以高效、穩定地用于灰霉菌的dna片段的qpcr擴增，從而可以用于定量檢測灰霉菌。

實施例2

本實施例用以說明本發明提供的定量檢測灰霉菌的方法。

將感染灰霉菌的番茄葉片用臭氧按照在殘體處理機中熏蒸滅菌的方法(這種處理方法可以殺死灰霉菌，隨著處理時間的變化，殺死的灰霉菌也會增多)，分別處理0分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘和50分鐘，收獲處理后的葉片后，每個處理均按照如下方式進行處理，以定量檢測灰霉菌的含量。

將番茄葉片置于研缽中，加入液氮后充分研磨；取番茄葉片粉末各50mg分別置于ep管中，其中一管按照如下方法進行pma處理，以用于pma-qpcr擴增：

向ep管中加入1ml的pbs，渦旋振蕩；然后用鋁箔紙將ep管包住，再向管內加入20％的pma工作液(用20％的dmso配制成的1μg/μl的pma溶液)，使pma的終濃度達到20μg/ml。將加入了pma的ep管放入搖床中，以150r/min的轉速震蕩5分鐘，再將ep管置于冰上，使用500w氯素燈照射5分鐘，每間隔30s轉動ep管，使其照射均勻。pma處理完畢后將ep管在10000rpm下離心5分鐘，盡量去除液體后再對剩下的固體物質，按照如下方法進行提取dna的操作。

另一管直接進行提取dna的操作，以提取dna用于qpcr反應。

提取dna的操作方法如下：

將80mg的葉片粉末或者經上述pma處理后獲得的固體物質使用天根生化科技(北京)有限公司的牌號為dp305的基因組提取試劑盒提取待測樣品的總dna。

獲得dna后，使用北京科爾德科貿有限公司的牌號為nanodrop2000的超微量分光光度計測量dna溶液的od值，并使用pbs調整使得dna的濃度均為200μg/μl(即od值相同)。

分別以上述提取的dna為模板，以如下qpcr反應程序和體系進行擴增：

qpcr擴增和pma-qpcr擴增的反應體系均為：

qpcr反應程序：首先95℃3min，然后95℃1min、57℃45s、72℃1min的條件下進行35個循環。

上述qpcr反應體系中，seqidno.1引物和seqidno.2引物的濃度均為100μmol/l。

上述qpcr反應體系中，實時pcr擴增預混緩沖液為購自天根生化科技(北京)有限公司的貨號為fp206的superrealpremixplus。

根據上述的qpcr擴增和pma-qpcr擴增的結果，按照如下計算公式計算得到活的灰霉菌所占的比例：

y1＝-3.209*lg(x1)+40.25

y2＝-3.209*lg(x2)+40.25

r＝x2/x1

其中，

“x1”為qpcr擴增(未經pma處理)測得的灰霉菌的起始拷貝數(即：全部的灰霉菌的數量，包括活的和死的)；“y1”為qpcr擴增的ct值；

“x2”為pma-qpcr擴增(經過pma處理)測得的活的灰霉菌的起始拷貝數(即：活的灰霉菌的數量)；“y2”為pma-qpcr擴增的ct值；

“r”為活的灰霉菌占全部灰霉菌的比例。

參數和計算結果見表1。

表1

從表1中可以看出，本實施例提供的方法可以準確、快速的測定活的灰霉菌和全部灰霉菌的起始拷貝數，進而計算得到活的灰霉菌所占的比例，并且隨著處理時間的延長，活的灰霉菌所占的比例逐漸降低。

綜上所述，本發明的方法可以準確、快速的測定作物中的活的灰霉菌和全部灰霉菌的起始拷貝數，進而計算出活的灰霉菌在作物上的比例。

由技術常識可知，本發明可以通過其它的不脫離其精神實質或必要特征的實施方案來實現。因此，上述公開的實施方案，就各方面而言，都只是舉例說明，并不是僅有的。所有在本發明范圍內或在等同于本發明的范圍內的改變均被本發明包含。

序列表

<110>北京市植物保護站

<120>用于定量檢測灰霉菌的特異引物及其應用

<160>3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<400>1

gcgtaagacggtccatccat20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<400>2

gcactcggcgatccagataa20

<210>3

<211>718

<212>dna

<213>灰葡萄孢菌

<220>

<400>3

atctctgaaatcaacgtctcgaaatccatcttgaatatttgtggacttgggtatggatac60

aaaaatgcgactgggatcacccgcacctaattcgtcaacgacattagggaggagccttct120

cccttggttactcagcgaccctatatcttcaatcatattgcacaatagcctcgggtcttt180

gattgttttggatataagctgtggtcatcgatggttcacattcaatatacgtttatctcg240

tatttatgttagcccaaaagaattcttctaaagttgtctcgctgttttcgtgattatcac300

ctgggttgttgctatcctttatcagtttagcgttgtggtcgtacgttctaggagctcagc360

ttataatggtgtgcacccattgtatgcaaaggtcggacctgctcacatcgcaatccatgc420

gttattgtacccccatgcccccactcaccaacgacgccaccatgcattatcgaccactac480

ttcaccctcgcacaagcgtaagacggtccatccataccccgtttctcgcaagtttctccc540

gtatcgaagacccctagatttgattttacccttcgcgtggaagatgacctggccgttcgc600

gttgttcaaaacaaggaatcgagtgtgatgtatgcaaagcgctcttatctggatcgccga660

gtgcaacggcatatcacagcaaccgtctgataggtttttccacgcagaacattgcaga718