本(ben)發(fa)明屬于獸(shou)醫生物制品技術領域，具體(ti)涉及(ji)一種免疫原性(xing)強的血清2型豬鏈球菌及(ji)其應用。

背景技術：

豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(streptococcussuis,ss)是(shi)一(yi)種(zhong)世界性的(de)(de)可引起豬(zhu)重(zhong)大疾(ji)病(bing)(bing)的(de)(de)重(zhong)要(yao)病(bing)(bing)原菌之(zhi)一(yi)，同時它也是(shi)一(yi)種(zhong)人(ren)獸共(gong)患病(bing)(bing)病(bing)(bing)原體。人(ren)感(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌的(de)(de)途徑主要(yao)是(shi)接(jie)觸病(bing)(bing)死豬(zhu)，致病(bing)(bing)菌經破損(sun)皮膚和(he)黏(nian)膜(mo)侵入(ru)，或(huo)食入(ru)未(wei)煮(zhu)熟的(de)(de)病(bing)(bing)死豬(zhu)肉而(er)感(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)。近年(nian)來，人(ren)感(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌的(de)(de)報(bao)道(dao)大量增加，而(er)這些病(bing)(bing)例主要(yao)來自亞洲國(guo)家。我(wo)國(guo)于2005年(nian)在四川省爆發的(de)(de)豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌疫情(qing)共(gong)感(gan)(gan)染(ran)(ran)(ran)215人(ren)，病(bing)(bing)死率將近20％。

目前(qian)公認的豬(zhu)鏈球(qiu)菌的血清型有(you)33種(zhong)(1-31，33，1/2)，經流(liu)行病學分(fen)析(xi)，臨床上豬(zhu)鏈球(qiu)菌主(zhu)要以(yi)2、7、9型是引(yin)起豬(zhu)感染的重要流(liu)行血清型，血清2型致病力(li)最強，極易(yi)引(yin)起人的感染和死亡。

由(you)于(yu)臨床中常大量不合(he)理(li)使用抗生素來(lai)控(kong)(kong)制細菌(jun)(jun)(jun)性疾病(bing)(bing)，致使豬(zhu)(zhu)場的(de)(de)(de)細菌(jun)(jun)(jun)在抗生素的(de)(de)(de)壓力下進化出(chu)耐藥菌(jun)(jun)(jun)群。因(yin)此(ci)，用藥物防(fang)控(kong)(kong)豬(zhu)(zhu)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)(de)難度越(yue)(yue)(yue)來(lai)越(yue)(yue)(yue)大，而(er)且(qie)隨著人們對食品安全問題的(de)(de)(de)重(zhong)視，抗生素在動物疫(yi)病(bing)(bing)防(fang)控(kong)(kong)中的(de)(de)(de)應用會越(yue)(yue)(yue)來(lai)越(yue)(yue)(yue)少，疫(yi)病(bing)(bing)的(de)(de)(de)防(fang)控(kong)(kong)更多的(de)(de)(de)會依賴(lai)疫(yi)苗。豬(zhu)(zhu)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)血(xue)清型(xing)眾多，且(qie)不同血(xue)清型(xing)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)毒力和致病(bing)(bing)力差異較大，各血(xue)清型(xing)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)交(jiao)叉(cha)保(bao)護很低，所以(yi)，目(mu)前已有的(de)(de)(de)商品化疫(yi)苗均(jun)不能對該病(bing)(bing)提供(gong)完(wan)全的(de)(de)(de)免疫(yi)保(bao)護。因(yin)此(ci)，篩選免疫(yi)原性強并具(ju)有交(jiao)叉(cha)保(bao)護力的(de)(de)(de)豬(zhu)(zhu)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)通用菌(jun)(jun)(jun)株，是制備(bei)高效的(de)(de)(de)豬(zhu)(zhu)鏈(lian)球(qiu)(qiu)菌(jun)(jun)(jun)疫(yi)苗的(de)(de)(de)關鍵所在。

技術實現要素：

本發明的目的在(zai)于一種免疫原性強的血清2型豬鏈球(qiu)菌及(ji)其應用。

本發明所采取的技術方案是：

一種(zhong)豬鏈球菌，該豬鏈球菌的(de)保藏編號為(wei)gdmccno：60188，記名(ming)為(wei)豬鏈球菌gdzq株(zhu)。

本發明提供的(de)豬(zhu)鏈球菌(jun)gdzq株(zhu)(zhu)，于(yu)2017年(nian)05月17日保(bao)(bao)藏(zang)(zang)于(yu)廣(guang)東省微(wei)生(sheng)物(wu)菌(jun)種保(bao)(bao)藏(zang)(zang)中(zhong)心(xin)(廣(guang)州(zhou)市先烈中(zhong)路100號大院59號樓5樓，廣(guang)東省微(wei)生(sheng)物(wu)研究(jiu)所)，保(bao)(bao)藏(zang)(zang)號為(wei)：gdmccno：60188，保(bao)(bao)藏(zang)(zang)中(zhong)心(xin)建議的(de)分(fen)類(lei)命名為(wei)streptococcusporcinus。保(bao)(bao)藏(zang)(zang)中(zhong)心(xin)于(yu)2017年(nian)05月18日鑒(jian)定菌(jun)株(zhu)(zhu)是存活的(de)。

上述豬(zhu)鏈球菌(jun)在制備防控豬(zhu)鏈球菌(jun)病的藥物中的應用。

優選的(de)(de)，所述的(de)(de)藥物為疫苗。

一種疫(yi)苗(miao)，是用上述所述的豬鏈球菌作為抗原(yuan)制(zhi)備(bei)的。

優選的(de)，所述的(de)疫苗(miao)為(wei)滅活疫苗(miao)。

優選的(de)，所述疫苗(miao)中的(de)佐劑(ji)為鋁膠。

優選的(de)，所述的(de)疫苗(miao)為單價疫苗(miao)。

優選的，所述的豬鏈球菌的含量為1×10⁸～3×10¹²cfu/ml。

本發(fa)明(ming)的(de)有益效果是：

本發明申請人從160多株菌株中篩選出一株血清2型豬鏈球菌，記名為豬鏈球菌gdzq株，其毒力較強，5×10⁸cfu即可引起全部試驗仔豬死亡；免疫原性強，疫苗抗原含量僅需1×10⁸cfu即可(ke)對(dui)試(shi)驗(yan)仔豬產生100％的(de)免疫保(bao)護(hu)，優于(yu)目前市面上的(de)同類產品(pin)。此外豬鏈球(qiu)(qiu)菌gdzq具有較好的(de)交叉保(bao)護(hu)力(li)，能保(bao)護(hu)豬免受目前國(guo)內主要的(de)流(liu)行血清(qing)2、7、9型豬鏈球(qiu)(qiu)菌的(de)侵害。

利(li)用(yong)本發(fa)明篩選出的豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)gdzq制備(bei)(bei)豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)疫(yi)苗(miao)，工藝(yi)簡單，僅需(xu)單獨培(pei)養豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)gdzq，經常規處理即可制備(bei)(bei)得到豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)疫(yi)苗(miao)。本發(fa)明技(ji)術工藝(yi)簡單，成本低廉，可以克服目前市場上(shang)多價豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)疫(yi)苗(miao)生產中工藝(yi)繁瑣的缺陷。

本發明克服現(xian)有技術的不(bu)足(zu)，提供了預(yu)防豬(zhu)豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)病的單價疫(yi)苗(miao)，可(ke)以(yi)彌補(bu)市場的空白(bai)。所述單價疫(yi)苗(miao)具有較好(hao)的交叉保(bao)護(hu)力(li)，利用其對豬(zhu)進行(xing)免疫(yi)接(jie)種，可(ke)以(yi)抵御國內主要的豬(zhu)鏈(lian)球(qiu)菌(jun)流行(xing)血清型(xing)2、7、9型(xing)菌(jun)株(zhu)的侵(qin)害，市場前景廣闊。

附圖說明

圖1為血平(ping)板培養結果；

圖(tu)2為革(ge)蘭(lan)氏染色(se)結果；

圖3為豬(zhu)鏈球菌pcr鑒定結(jie)果(guo)；

圖4為豬鏈(lian)球(qiu)菌(jun)血清型分型結果(guo)。

具體實施方式

實施例1豬鏈球菌gdzq株的分離、鑒定和毒(du)力試(shi)驗(yan)

一、豬鏈球菌菌株的分離和篩選

1、豬鏈球菌菌株(zhu)的分離

2015年于(yu)廣東肇(zhao)慶(qing)某豬(zhu)(zhu)(zhu)鏈球(qiu)菌(jun)發(fa)病(bing)豬(zhu)(zhu)(zhu)場采(cai)集病(bing)料，無菌(jun)取發(fa)病(bing)豬(zhu)(zhu)(zhu)的(de)腦組(zu)織，接(jie)種到tha瓊脂培(pei)(pei)養(yang)基上，置37℃培(pei)(pei)養(yang)24～36h后(hou)挑選典(dian)型的(de)單(dan)個菌(jun)落(luo)(luo)進行純化培(pei)(pei)養(yang)。挑選純化好的(de)單(dan)菌(jun)落(luo)(luo)接(jie)種于(yu)thb液體培(pei)(pei)養(yang)液中(zhong)，37℃搖床(220r/min)培(pei)(pei)養(yang)過夜。純培(pei)(pei)養(yang)物接(jie)種含綿羊血的(de)瓊脂平板，37℃培(pei)(pei)養(yang)24h后(hou)，可(ke)見(jian)(jian)形成直徑1～2mm透(tou)明，圓(yuan)潤的(de)菌(jun)落(luo)(luo)，在血平板中(zhong)呈β溶血(圖1)。挑取上述(shu)單(dan)菌(jun)落(luo)(luo)進行革(ge)蘭(lan)氏染(ran)色(se)，顯(xian)微鏡下(xia)觀(guan)察，可(ke)見(jian)(jian)藍紫色(se)，卵圓(yuan)形或(huo)圓(yuan)形，成雙或(huo)成鏈狀的(de)菌(jun)落(luo)(luo)分布于(yu)視野中(zhong)(圖2)，初(chu)步判斷為鏈球(qiu)菌(jun)。

2、豬(zhu)鏈球(qiu)菌菌株的篩選(xuan)

對初步證實是豬鏈球(qiu)菌菌株(zhu)的160多株(zhu)菌株(zhu)進行篩選(xuan)。經(jing)毒(du)力、生長特性(xing)等的比(bi)對驗(yan)證，最終篩選(xuan)出易于培養(yang)、毒(du)力較強(qiang)的豬鏈球(qiu)菌1株(zhu)，進行如下研(yan)究。

二、豬鏈球菌菌株的16srrna鑒定

對毒力最強的(de)豬鏈球菌(jun)菌(jun)株進(jin)行16srrnapcr鑒定，引(yin)物(wu)序列如下：

p1：5’-cagtatttaccgcatggtagatat-3’(seqidno:1)；

p2：5’-gtaagataccgtcaagtgagaa-3’(seqidno:2)。

經pcr檢測可疑菌落擴(kuo)增出大小約為(wei)294bp的(de)特(te)異性條帶(dai)(圖3)，pcr產物送上海(hai)生工生物公(gong)司(si)進行序列(lie)(lie)測定，測序結(jie)果與ncbigenbank中(zhong)已有序列(lie)(lie)比對，比對結(jie)果顯示(shi)，分離(li)到的(de)菌株為(wei)豬鏈(lian)球(qiu)菌。將菌株命名為(wei)gdzq株。

三、豬鏈球菌gdzq株的血清型鑒定

1凝集試驗

將上述鑒定為(wei)豬(zhu)鏈球菌(jun)(jun)的(de)菌(jun)(jun)株(zhu)gdzq進行血(xue)清(qing)凝(ning)集試驗，取(qu)10l標準陽(yang)性(xing)(xing)血(xue)清(qing)于玻片上，取(qu)10l純化的(de)豬(zhu)鏈球菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)液充分混(hun)(hun)勻，輕(qing)輕(qing)搖動3分鐘，日光燈下觀察結(jie)果(guo)，若有顆粒狀(zhuang)物質出(chu)現，則為(wei)陽(yang)性(xing)(xing)；若為(wei)均勻混(hun)(hun)懸液，則為(wei)陰性(xing)(xing)。經(jing)鑒定豬(zhu)鏈球菌(jun)(jun)gdzq株(zhu)為(wei)血(xue)清(qing)型(xing)2型(xing)。

2pcr定型

用pcr方法對菌(jun)株(zhu)gdzq株(zhu)進行血清型(xing)定(ding)型(xing)。定(ding)型(xing)引(yin)物(wu)為(wei)：

cps2i-f：ttcgtattaacttacttggcgt(seqidno:3)；

cps2i-r：taaatccccatatgccaaatcc(seqidno:4)。

pcr的結果顯示(shi)gdzq株為血(xue)清(qing)型2型，見(jian)圖4。

四、.豬鏈(lian)球菌gdzq株的致病力研(yan)究

取(qu)20頭15日齡仔豬(zhu)隨機分(fen)成a、b、c、d四組(zu)，每組(zu)5頭，進行豬(zhu)鏈球菌攻(gong)毒，劑(ji)量(liang)及分(fen)組(zu)如表1。

表1豬鏈球菌(jun)gdzq株攻毒(du)結果

每(mei)頭豬(zhu)(zhu)(zhu)分別(bie)頸部肌肉注(zhu)射，每(mei)天(tian)觀(guan)察仔豬(zhu)(zhu)(zhu)發病情況，連續觀(guan)察10天(tian)。試(shi)驗結果顯示，a、b、c所有試(shi)驗仔豬(zhu)(zhu)(zhu)于攻毒后(hou)48h均開始表現(xian)(xian)出(chu)臥(wo)地不起(qi)，食欲廢絕，呼吸困難，呼吸羅音，并出(chu)現(xian)(xian)抽搐，四肢劃水狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)等(deng)一(yi)系(xi)列神(shen)經癥狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)，d組(zu)有3頭仔豬(zhu)(zhu)(zhu)于攻毒后(hou)4天(tian)出(chu)現(xian)(xian)上述(shu)癥狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)，對照組(zu)仔豬(zhu)(zhu)(zhu)正常。試(shi)驗證實(shi)，豬(zhu)(zhu)(zhu)鏈(lian)球菌gdzq株對仔豬(zhu)(zhu)(zhu)有較(jiao)強的致(zhi)病力。

實施(shi)例2豬鏈球(qiu)菌疫苗(miao)的制(zhi)備以及(ji)免(mian)疫效力檢測

一、豬鏈球(qiu)菌疫苗的制備

通過以下(xia)步(bu)驟制備疫苗：

1)一級種子液制(zhi)備(bei)：取(qu)凍干保存的(de)豬鏈球(qiu)菌gdzq株接種于(yu)tsa固體平板，在(zai)溫度為37℃的(de)條(tiao)(tiao)件下(xia)培養(yang)(yang)18h；然后(hou)挑取(qu)單菌落于(yu)tsb培養(yang)(yang)基(含(han)5％新(xin)生牛血清)中，在(zai)溫度為37℃的(de)條(tiao)(tiao)件下(xia)，以轉速120rpm振蕩培養(yang)(yang)18h，進行純粹(cui)檢驗合(he)格后(hou)，作為一級種子液，置2～8℃保存備(bei)用(yong)，保存時間均(jun)不超過3天。

2)二級種(zhong)子(zi)液(ye)制(zhi)備(bei)：取步驟1)得到的一級種(zhong)子(zi)液(ye)，按(an)種(zhong)子(zi)液(ye)與培養基的體積比1:20接種(zhong)于tsb培養基中，在溫(wen)度為(wei)37℃的條件(jian)下，以(yi)轉速120rpm振蕩培養16h，進行(xing)純粹(cui)檢驗(yan)合(he)格(ge)后，作為(wei)二級種(zhong)子(zi)液(ye)，置2～8℃保(bao)(bao)存(cun)(cun)備(bei)用(yong)，保(bao)(bao)存(cun)(cun)時間均不超過(guo)3天。

3)原菌(jun)液制備：取步驟(zou)2)得到(dao)的(de)二級種子培養液，按種子液與培養基的(de)體積比1:100接種于tsb培養基中，在(zai)溫度為37℃的(de)條(tiao)件下(xia)，以(yi)轉速(su)120rpm振蕩(dang)培養24h后，得到(dao)原菌(jun)液。

4)活菌計(ji)數：將步驟3)中獲得的菌液進行活菌計(ji)數，步驟如下(xia)：

取豬鏈球(qiu)菌gdzq株菌液(ye)(ye)1ml，用ph7.4pbs做10倍系列稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)，每(mei)個(ge)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)度換1支(zhi)(zhi)吸(xi)(xi)管(guan)。具體方法是：準確吸(xi)(xi)取菌液(ye)(ye)100μl，放(fang)(fang)入盛有(you)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)(ye)900μl的(de)(de)第一(yi)支(zhi)(zhi)1.5ml離(li)心管(guan)中(不接觸液(ye)(ye)面(mian))，另取1支(zhi)(zhi)1ml槍頭將第一(yi)管(guan)液(ye)(ye)體混合均勻后(hou)，吸(xi)(xi)取100μl放(fang)(fang)入盛有(you)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)液(ye)(ye)900μl的(de)(de)第2支(zhi)(zhi)1.5ml離(li)心管(guan)中，依次稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)至(zhi)最(zui)后(hou)1管(guan)。根(gen)據(ju)對(dui)樣品含(han)菌數的(de)(de)估計，選擇適(shi)宜(yi)稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)度，吸(xi)(xi)取最(zui)終稀(xi)(xi)釋(shi)(shi)度的(de)(de)菌液(ye)(ye)接種(zhong)適(shi)宜(yi)的(de)(de)培(pei)養基平(ping)(ping)板3個(ge)，每(mei)個(ge)滴100μl，使菌液(ye)(ye)散開，置(zhi)37℃涼干后(hou)，翻轉平(ping)(ping)板，培(pei)養48～72h，按(an)照(zhao)下列方法數出每(mei)個(ge)平(ping)(ping)皿中的(de)(de)菌落個(ge)數，計算(suan)每(mei)ml菌液(ye)(ye)中的(de)(de)活(huo)菌數(cfu/ml)。

5)滅活：在上(shang)述步驟3)制備的(de)菌液中加入終濃度為0.2～0.4％的(de)甲醛溶液，37℃振蕩滅活24h。

6)乳化：在步驟5)得到的滅活菌液中取樣，按照《中華人民共和國獸藥典》附錄進行純粹檢驗；將原菌液在轉速為8000rpm的條件下無菌離心10min取沉淀的菌體，用無菌生理鹽水重懸菌體后洗滌，經洗滌的菌體用無菌生理鹽水稀釋成濃度為2×10⁸cfu/ml的制苗(miao)菌(jun)液，將制苗(miao)菌(jun)液與鋁膠佐劑以體積比4：1～9:1混合(he)，轉速8000rpm的條件下(xia)乳化20min，得到治療豬(zhu)鏈(lian)球菌(jun)病的疫苗(miao)，2～8℃保存(cun)備用。

二、豬鏈球菌疫苗的免疫效力(li)檢測

1.最小免疫(yi)效力試驗

取25頭15日齡仔豬，隨機分成a、b、c、d、e共5組，每組5頭，其中a組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，0.5ml/頭，14天后二免，0.5ml/頭；b組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，1ml/頭，14天后二免，1ml/頭；c組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭；d組頸部肌肉注射市售豬鏈球菌商品疫苗，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭；e組仔豬分別注射生理鹽水，2ml/頭。所有實驗組在二免14天后分別用豬鏈球菌血清2型菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭，連續(xu)觀察(cha)10天，觀察(cha)記錄仔豬發病(bing)和死亡情況(kuang)，計算每(mei)組保護(hu)率，如表2所示(shi)。

表2豬(zhu)鏈球菌gdzq株(zhu)滅(mie)活疫(yi)苗對仔豬(zhu)的免疫(yi)保護結果

表2結果顯示，豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗對仔豬能產生較好的免疫保護效力，免疫0.5ml，1ml、2ml組的保護率均為100％，即疫苗的抗原含量為1×10⁸cfu可對仔(zi)豬(zhu)形成較好的免疫保護，商(shang)品疫苗免疫組有40％仔(zi)豬(zhu)發(fa)病，攻毒對照組仔(zi)豬(zhu)100％發(fa)病。

2.交叉保護試驗

取30頭15日齡仔豬，隨機分成a、b、c、d、e、f6組，每組5頭，其中a、b、c組仔豬頸部肌肉注射豬鏈球菌gdzq株滅活疫苗，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭；d、e、f組仔豬頸部肌肉注射生理鹽水，2ml/頭，14天后二免，2ml/頭。a、d組在二免14天后分別用2型標準菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭；b、e組在二免14天后分別用7型菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭；c、f組在二免14天后分別用9型菌株進行攻毒，3×10⁹cfu/頭，連續(xu)觀察(cha)10天(tian)，觀察(cha)記錄仔豬發病和死亡情況，計算每組保護(hu)率，如表3所示。

表3豬鏈球菌(jun)gdzq株滅活疫苗(miao)對仔豬的交叉保(bao)護結果

表3結果顯示，豬鏈(lian)球菌gdzq株滅活疫苗可對2、7、9型菌株的攻毒(du)分(fen)別(bie)產生100％的交叉免疫保護。

上述實(shi)施(shi)(shi)例為本(ben)(ben)發明較佳的(de)(de)實(shi)施(shi)(shi)方式，但本(ben)(ben)發明的(de)(de)實(shi)施(shi)(shi)方式并不受上述實(shi)施(shi)(shi)例的(de)(de)限制(zhi)，其他的(de)(de)任何未背離本(ben)(ben)發明的(de)(de)精(jing)神(shen)實(shi)質與原理(li)下所作的(de)(de)改變、修飾(shi)、替(ti)代、組合、簡化，均應為等效的(de)(de)置換(huan)方式，都包含(han)在(zai)本(ben)(ben)發明的(de)(de)保護范圍(wei)之內。

sequencelisting

<110>廣東海大畜牧獸醫研究院有限(xian)公司，四川海林格生物制藥有限(xian)公司

<120>一(yi)種(zhong)免疫原性強的血清2型豬鏈(lian)球(qiu)菌(jun)及其應用

<130>

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<170>patentinversion3.5

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<213>人工序(xu)列(lie)

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