一種檢測食樹脂新鞘氨醇菌的引物及定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的引物 及定量檢測方法，屬于生物檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 多環芳徑（Polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs)是指分子中含有兩個 或兩個以上苯環的烴類，具有普遍的細胞毒性、致畸性以及致癌性。由于其化學結構的穩定 性以及極強的疏水性，決定了這類化合物在環境中能夠長期穩定存在，難以用常規方法治 理。隨著工業科技的發展，大量的PAHs進入環境，這些PAHs極可能通過食物鏈的富集作用 危害人類的健康。而利用微生物降解多環芳烴（PAHs)等持久性有機污染物的研宄已成為 當今環境科學的一個發展方向。
[0003] 食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)屬于新鞘氨醇桿菌屬 (Novosphingobium sp.)，新鞘氨醇桿菌屬是環境中比較獨特的一類新型的微生物資源，具 有降解芳烴等污染物的特性，是優良的芳烴污染環境修復菌。該菌屬的降解范圍非常寬，從 單環、多環芳烴到其它有機污染物都可以作為它們生長的碳源。由于這類降解菌既具有廣 泛的底物范圍，又具有很高的降解率，所以應用到生物修復當中具有較大潛力。
[0004] 目前，對于環境中食樹脂新鞘氨醇菌的檢測方法主要是依賴分離培養加分子鑒 定，這種方法計數周期長、工作量大、檢測數量不準確等，因而限制了食樹脂新鞘氨醇菌在 修復環境問題中的進一步研宄應用。因此，迫切需要一種快速定量測定環境中食樹脂新鞘 氨醇菌檢測方法。以為該菌的在環境中應用提供理論依據及技術支撐。

【發明內容】

[0005] 本發明針對現有技術的不足，提供一種檢測食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的引物及定量檢測方法。
[0006] 本發明技術方案如下：
[0007] -種檢測食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的引物，所述引物 為一對，分別為正向引物SEQ ID NO. 1和反向引物SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0008]
[0009] 反向引物 NR 序列 NR:5' -CACCTGTGCACGGTCCAGCC-3' ；SEQ ID NO. 2
[0010] -種食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的定量檢測方法，其特 征在于，步驟如下：
[0011] (1)提取食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)的基因組DNA，得基 因組DNA溶液；
[0012] (2)以步驟（1)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物進行PCR擴增，經純化后， 與載體連接后轉化感受態細胞DH5 a，涂含氨芐抗生素的LB平板培養，挑取陽性克隆進行 擴大培養，提取質粒，經驗證后，制得標準檢測溶液原液，經紫外分光光度計測定濃度并換 算拷貝數，換算公式：
[0013] DNA 拷貝數（copies/y 1) = (6.02X 1023) X (DNA 濃度（ng/yL) X1(T9V(DNA 長 度 X660)
[0014] (3)將步驟⑵制得的標準檢測溶液原液按照10倍梯度稀釋，獲得不同濃度的稀 釋液，以獲得的稀釋液為擴增模板，通過定量PCR擴增，得到擴增標準曲線如下：
[0015] y = -3. 4591og (x)+43. 197 ；
[0016] 其中，y為Ct值，x為質粒DNA拷貝數濃度；
[0017] (4)取待檢測樣品，提取待測樣品基因組DNA，制得待檢測擴增模板，按照步驟（3) 中定量PCR擴增的條件，檢測樣品的Ct值（循環閾值），對照標準曲線，得出待檢測樣品中 食樹脂新鞘氨醇菌的DNA濃度。
[0018] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中PCR擴增體系（共50 UL)如下：
[0019] 10XPCR 緩沖液 5yL，2. 5mM Mg2+4yL，4yL dNTPs(各 2. 5mM)，上述正向引物 1 y L(10mM)，上述反向引物 1 y L(10mM)，模板 DNA 2 y L，Taq DNA 聚合酶（5U)0. 5 y L，ddH20 32. 5 y L ；
[0020] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中PCR擴增程序如下：
[0021] 94°C預變性 5min ;94°C變性 lmin，62°C退火 30s，72°C延伸 40s，共 30 個循環；72°C 延伸lOmin。
[0022] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中的純化為經質量百分比為1%的瓊脂糖凝 膠電泳后，進行切膠純化。切膠純化可采用本領域的市售凝膠回收試劑盒進行操作，如 TIANGEN凝膠回收試劑盒。
[0023] 根據本發明優選的，所述步驟（2)中的載體為PMD18T載體。該載體為普通市售產 品，如Takara公司有售。利用該載體進行連接的過程可以具體參見產品使用說明書。
[0024] 所述步驟（2)中的平板培養為采用含100 y g/mL氨芐抗生素的LB平板培養擴 大培養。LB培養基為本領域常用培養基，提取質粒可采用普通市售質粒提取試劑盒，如 TIANGEN的小量質粒提取試劑盒。
[0025] 根據本發明優選的，所述步驟（3)和步驟（4)中定量PCR擴增體系（共25 y L)如 下：
[0026] 2XSuperReal PreMix(含SYBR GreenI) 10 y L，上述正向引物0? 5 y L(10mM)，上述 反向引物 〇? 5 y L(10mM)，DNA 模板 2 y L，ddH20 12 y L ;
[0027] 根據本發明優選的，所述步驟（3)和步驟（4)中PCR擴增程序如下：
[0028] 95°C預變性 15min ;94°C變性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 40s，共 40 個循環。
[0029] 根據本發明優選的，所述步驟（3)和步驟（4)中的定量PCR擴增采用Bio-red定 量PCR儀。
[0030] 根據本發明優選的，所述步驟（3)中的定量PCR擴增的擴增模板體積與步驟（4) 中的定量PCR擴增的待檢測擴增模板體積相同；優選的，均為2 y L。
[0031] 有益效果
[0032] 1、本發明所述的引物根據食樹脂新鞘氨醇菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異和 Real Time-PCR的引物要求設計的，可以應用于Real Time-PCR快速檢測環境中的食樹脂新 鞘氨醇菌，為研宄生物修復芳烴污染提供了新的途徑；
[0033] 2、本發明所述方法不僅可以定性檢測分析食樹脂新鞘氨醇菌，而且可以定量檢測 食樹脂新鞘氨醇菌的濃度。
【附圖說明】
[0034] 圖1是實施例中NF/NR引物對14種細菌DNA擴增產物的凝膠電泳圖；
[0035] 圖中：M泳道為標準D2000DNA Marker，1號泳道為食樹脂新鞘氨醇菌 (Novosphingobium resinovorum， CGMCC1.3745)DNA 擴增產物，2-14 泳道分別為 地下新鞘氨醇菌（Novosphingobium subterraneum，CGMCC1. 3516)、胞外多聚物鞘 氨醇單胞菌（Sphingomonas sanxanigenens，CGMCC1. 6417)、蘋果鞘氨醇單胞菌 (Sphingomonas mali，CGMCCl. 7044)、黑森新鞘氨醇菌（Novosphingobium hassiacum， CGMCC1. 3770)、刺狀鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas echinoides，CGMCC1. 7036)、紅色鞘 氨醇單胞菌（Sphingomonas rubra，CGMCC1.9113)、寡酷鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas oligophenolica，CGMCC1. 10181)、凱斯特鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas kaistensis， CGMCC1. 10197)、印度洋新鞘氨醇菌（Novosphingobium indicum，CGMCC1. 6784)、太湖新鞘 氨醇菌（Novosphingobium taihuense，CGMCC1. 3432)、冥河新鞘氨醇菌（Novosphingobium stygium，CGMCCl. 3767)、枯草芽抱桿菌（Bacillus atrophaeus Nakamura，ATCC9372)和多 粘類芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa，ATCC 842)菌株DNA的擴增產物，15號泳道為不 含DNA空白對照的擴增結果。
[0036] 圖2是本發明熒光定量PCR檢測食樹脂新鞘氨醇菌重組質粒DNA的擴增曲線；
[0037] 圖3是本發明熒光定量PCR檢測食樹脂新鞘氨醇菌重組質粒DNA的溶解曲線；
[0038] 圖4是本發明熒光定量PCR檢測食樹脂新鞘氨醇菌重組質粒DNA的溶標準曲線；
[0039] 圖5是利用本發明熒光定量PCR檢測添加與未添加食樹脂新鞘氨醇菌的土壤熒光 定量PCR擴增曲線。
【具體實施方式】
[0040] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0041] 培養基說明：
[0042] LB培養基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000mL， PH7. 0 ；
[0043] 生物材料來源：
[0044] 食樹脂新鞘氨醇菌（Novosphingobium resinovorum)來源于中國普通微生物菌種 保藏管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 3745 ;
[0045] 地下新鞘氨醇菌（Novosphingobium subterraneum)來源于中國普通微生物菌種 保藏管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 3516 ;
[0046] 胞外多聚物鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sanxanigenens)來源于中國普通微生 物菌種保藏管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 6417 ;
[0047] 蘋果鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas mali)來源于中國普通微生物菌種保藏管理中 心，菌種保藏號CGMCC 1. 7044 ;
[0048] 黑森新鞘氨醇菌（Novosphingobium hassiacum)來源于中國普通微生物菌種保藏 管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 3770 ;
[0049] 刺狀鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas echinoides)來源于中國普通微生物菌種保藏 管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 7036 ;
[0050] 紅色鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas rubra)來源于中國普通微生物菌種保藏管理 中心，菌種保藏號CGMCC 1. 9113 ;
[0051] 寡酷鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas oligophenolica)來源于中國普通微生物菌種 保藏管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 10181 ;
[0052] 凱斯特鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas kaistensis)來源于中國普通微生物菌種保 藏管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 10197 ;
[0053] 印度洋新鞘氨醇菌（Novosphingobium indicum)來源于中國普通微生物菌種保藏 管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 6784 ;
[0054] 太湖新鞘氨醇菌（Novosphingobium taihuense)來源于中國普通微生物菌種保藏 管理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 3432 ;
[0055] 冥河新鞘氨醇菌（Novosphingobium stygium)來源于中國普通微生物菌種保藏管 理中心，菌種保藏號CGMCC 1. 3767 ;
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