當歸的檢測試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種當歸的檢測試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 當歸，是傘形科植物當歸Angelica Sinensis (Oliv. )Diels的干燥根，原主產地 在我國甘肅東南部，其中以岷縣產量多，質量好，其次為云南、四川、陜西、湖北等省，均為栽 培。國內其它省區也已有引種栽培。其根可入藥，是最常用的中藥之一。具有補血和血、調 經止痛、潤燥滑腸之功效。
[0003] 歐當歸和日本當歸是常見的當歸偽品。歐當歸（Levisticum officinalis Koch) 根莖可入藥，有興奮、發汗、利尿、解熱等功效，在河北、山東、河南、陜西、山西、江蘇等省區 均有種植栽培，民間用以代當歸用，但是其有當歸不具有的不良反應，不能混充當歸藥用。 日本當歸（Angelica acutiloba(Sieb.et Zucc.)Kitagawa)在我國吉林省的延吉、揮春、和 龍等縣栽培作"當歸"使用已有長久的歷史。國內有些省區也已有引種栽培。模式標本產 于日本中部橫須賀近郊，日本和朝鮮以本種稱當歸，栽培入藥。功效與我國原產當歸類似， 主治月經不調，經來腹痛，腰痛、崩漏，大便干燥，痢疾腹痛等癥。日本當歸化學成分、有效含 量均有較大的差異，而且在藥理作用上也有較大的不同之處。
[0004] 總之，歐當歸和日本當歸本的藥效和當歸雖有相似之處，但是在很多功效上有區 另IJ，且存在用藥安全性問題，不能作為當歸使用，然而，由于歐當歸、日本當歸與當歸的性狀 特征較為相似，通過觀察外觀形狀和顯微特性進行鑒別的難度較大，而且歐當歸和日本當 歸易于栽培，產量較高，導致市面上存在許多用歐當歸和日本當歸以次充好的情況，急需改 善。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的缺陷，本發明提供了一種新的、方便、快速、準確地檢測當歸 的試劑盒和方法。
[0006] 本發明提供了 SEQ ID NO. 1所示的種核苷酸序列。
[0007] 本發明還提供了檢測SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備當歸檢測試劑中 的用途。
[0008] 所述檢測SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所示核苷酸 序列的試劑。
[0009] 所述當歸是傘形科植物當歸Angelica Sinensis (Oliv. )Diels的干燥根。
[0010] 所述當歸是甘肅岷縣當歸、甘肅平涼當歸、四川九寨當歸、云南麗江當歸或四川綿 陽當歸。
[0011] 所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物對。
[0012] 本發明檢測當歸的試劑盒，包括檢測SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相關試劑。
[0013] 所述試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑。
[0014] 所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3所示的引物對。
[0015] 本發明一種當歸的檢測方法，包括如下步驟：
[0016] a，DNA提取：提取待檢樣本中的DNA ;
[0017] b，檢測：用前述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
[0018] 本發明SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列為當歸特異性序列，通過檢測這些序列可以 有效區分當歸與當歸偽品，鑒定待檢樣本是否為當歸，保證用藥安全，本發明方法操作簡 便，具有良好的應用前景。
[0019] 下面通過【具體實施方式】對本發明做進一步詳細說明，但是并不是對本發明的限 制，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述 基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，都是本發明保護的內 容。
【附圖說明】
[0020] 圖1.各種當歸的改良RAPD擴增。引物SBS-A1的RAPD擴增。箭頭為A1-0的RPAD 片段，用于膠回收和克隆。
[0021] 圖2陽性克隆的菌落PCR鑒定。藍色所指通道的陽性克隆用于Sanger測序。通 道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標記。泳道1-7分別代表不同陽性克隆的菌落。
[0022] 圖3不同物種及當歸品種的鑒定。通道1-18號分別為甘肅岷縣當歸，日本當歸， 四川阿壩當歸，甘肅平涼當歸，湖北當歸，四川九寨當歸，歐當歸，云南麗江當歸，四川綿陽 當歸，銀杏，荔枝，龍眼，青果，金銀花，梔子花，靈芝，龍荔，趕黃草。藍色所指的通道7為日 本當歸，通道2為歐當歸。通道"M"顯示有分子重量（bp)的DL2000DNA標記。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1 RAPD技術擴增當歸特異SCAR標記
[0024] 一、CTAB法提取植物DNA
[0025] 取當歸0. 2g置于1. 5mL EP管中，加入液氮約半分鐘后用研缽棒碾碎成細粉，立 即加入 500 y 1 的 CTAB 提取緩沖液[CTAB2%，Tris-HCl (pH8. 0) lOOmmol. L」，EDTA20mmol mmo 1. L」，NaCL 1. 4mo 1. L」，0. 4 %的0 -巰基乙醇]，60 °C水浴保溫1小時后，加入等體積的 氯仿-異戊醇（24 :1)抽提，輕顛倒混勻，10000轉每分鐘離心10分鐘，吸取上清液，取上清 加入2/3體積的預冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻；12000轉每分鐘離心10分鐘，棄上清， 小心傾去上清液，沉淀用70%乙醇和無水乙醇各輕洗一次，棄洗液，留沉淀，空氣干燥。用 100 y 1的1XTE溶液溶解備用。將樣品用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質量，用 分光光度計測定濃度，稀釋至濃度l〇ng/yl，-20°C保存備用。詳見《精編醫學分子生物學 實驗指導》（中國醫藥科技出版社，主編：傅俊江）。
[0026] 二、RAPD 技術 PCR 擴增
[0027] 利用 RAPD 技術進行擴增（參照 Fu J, Yang L, Khan MA, Mei Z (2013) Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD analysis. Mol Biol Rep, 40(10):5993-9)：
[0028] 以步驟一提取的核酸作為模板，用RAH)引物SBA-A1和SBS-A2進行擴增（序列見 表2,北京賽百盛公司合成），PCR擴增采用10yl反應體系包括：lyl的引物（2. 5ymol/ 1)，1.5 1^1(15叩）模板0嫩，5 1^1的2\?〇?139]\&^61'11^(天根生物公司，北京）和 2. 5 y 1的滅菌雙蒸水。充分混勾后，于離心機12000rpm離心15s，置于PCR儀（Applied BiosystemsVeriti?96-Well Thermal Cycler，Life Technology, USA)。PCR 反應條件是： 95°C 1分30秒，94°C 40秒，36度60秒，72°C 1分30秒，40個循環，最后72°C 5分鐘，其中 RAMP為5%。然后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，曝光顯色。
[0029]表 1
【主權項】
1. SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2. 檢測SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的試劑在制備當歸檢測試劑中的用途。
3. 根據權利要求2所述的用途，其特征在于：所述檢測試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所 示核苷酸序列的試劑。
4. 根據權利要求3所述的用途，其特征在于：所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3所 示的引物對。
5. 根據權利要求2所述的用途，其特征在于：所述當歸是傘形科植物當歸Angelica Sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根。
6. 根據權利要求5所述的用途，其特征在于：所述當歸是甘肅岷縣當歸、甘肅平涼當 歸、四川九寨當歸、云南麗江當歸或四川綿陽當歸。
7. -種檢測當歸的試劑盒，其特征在于：包括檢測SEQ ID NO. 1所述核苷酸序列的相 關試劑。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑包括擴增SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列的試劑。
9. 根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述擴增的試劑包括SEQ ID NO. 2~3 所示的引物對。
10. -種檢測當歸的檢測方法，其特征在于：包括如下步驟： a，DNA提取：提取待檢樣本中的DNA ; b，檢測：用權利要求7~9任意一項所述的試劑盒檢測待檢樣本，即可。
【專利摘要】本發明公開了當歸的核苷酸序列，還公開了檢測前述序列的試劑在制備當歸檢測試劑中的用途，以及當歸的檢測試劑盒和檢測方法。本發明檢測試劑盒和檢測方法可以準確、有效的鑒別當歸，特異性強，耗時短，應用前景良好。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104745699
【申請號】CN201510142132
【發明人】傅俊江, 梅志強, 張春, 成競梁
【申請人】瀘州醫學院
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月27日