瓜類蔓枯病菌的環介導等溫擴增引物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及檢測瓜類蔓枯病菌的環介導等溫擴增引物組合物，屬于生物技術領 域，適用于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。基于該引物組合物建立的LAMP 檢測體系可用于從瓜種子檢測瓜類蔓枯病菌，檢測方法易于操作，檢測結果可靠，且可用肉 眼直接觀察結果，方便可視。該發明提供了一組用于檢測瓜蔓枯病菌靈敏、可靠的引物組。 (二）
【背景技術】
[0002]瓜蔓枯病（Gummy Stem Blight，GSB)由瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae)引起， 是萌蘆科作物毀滅性的真菌病害（Zitter，et al.，1996)。1986年，GSB首次報道于歐洲的 萌蘆蔓（野生啤酒花）（Keinath，2010)，目前已廣泛分布在美國、加拿大、荷蘭、瑞典、日本、 印度及中國等地（Li，et al.，2008)。在我國，大多數西、甜瓜產區均有GSB發生的報道， 包括新疆、青海、甘肅、江蘇、浙江、四川以及寧夏等地，嚴重威脅著我國西、甜瓜產業的發展 (賈菊生，1993 ;馬子林，2013 ;陸致平等，2000 ;趙海棠等，2001 ;胡鳳云等，2011)。
[0003] GSB侵染植物主后主要病癥有：葉片和莖干出現水漬狀壞死斑，后期會被分 生孢子器和假囊殼覆蓋，侵染莖干皮質組織潰瘍，并產生一種棕褐色外泌物結晶（Van Steekelenburg，1986)，病部龜裂，呈淡綠色橢圓形凹陷，后呈灰白色，表面散生黑色小點。 在與植株的互作敏感期（Koch et al.，2002)，壞死斑繼續擴大最后產生環狀莖干割束帶 (Grube et al.，2011)，導致整個植株的萎蔫和死亡。瓜蔓枯病菌通產在花期侵染植株，導 致隨后收獲的果實空心或腐爛，其病原菌還可以以分生孢子器、索狀菌絲和子囊殼的形式 伴隨記住殘體埋藏于土壤中越冬（Furukawa，et al.，2007)，更可以使得其余健康種子帶菌 (Kubota，et al.，2011)。相較于溫暖潮濕的環境更易生長傳播，更可隨風雨等外接因素擴 散傳染，會導致作物大面積死亡減產（Frantz and Jahn，2004)。因此，種子帶菌是GSB遠距 離傳播的主要方式（Caf6 Filho, et al.，2010)。
[0004] 目前，針對瓜蔓枯病菌0). bryoniae)的檢測技術較少。例如，2006年，戴富明等 以瓜蔓枯病菌（D. bryoniae) ITS為靶標設計了檢測引物，建立了常規的PCR檢測體系，該方 法主要適于植株樣品的檢測（戴富明等，2006)。2009年，Ha等報道了基于Real-Time PCR 的瓜蔓枯病菌0. bryoniae)的檢測技術（Ha，et al.，2009)，但是由于常規的PCR等檢測 方法易受種子樣品中雜質干擾（Walcott and Gitaitis，2000)，而焚光定量PCR技術需要昂 貴的PCR儀器和試劑，所以該方法不適用于病害的現場診斷和基層部門使用。雖然，GSB田 間發病癥狀易于識別，但由于其是種傳病害，種子帶菌檢測是有效防止病害發生最有效地 手段之一，因此，目前急需一種針對瓜蔓枯病菌0). bryoniae)快速、靈敏、簡便、可用于種 子帶菌檢測的現代檢測技術。
[0005] 環介導等溫擴增技術（LAMP)是一種新型的檢測技術，該技術由Notomi等于2000 年首先報道（Notomi et al.，2000)，該方法在等溫條件下（60-65°C)，加入熒光染料， 45min-60min可實現可視化檢測，具有簡便、敏感、特異、快速的特點。環介導等溫擴增引物 主要由兩條外引物（F3、B3)以及兩條內引物（FIP、BIP)組成。檢測原理是利用具有鏈置 換活性的Bst DNA聚合酶和根據不同靶序列設計的兩對特殊的內、外引物，即正向內側引物(FIP)、正向外側引物（F3)、反向內側引物（BIP)、反向外側引物（B3)，特異性識別靶序列上 的6個獨立區域，在恒溫條件下啟動循環鏈置換反應。在LAMP反應中，內引物雜交在目標 DNA區，啟動互補鏈合成，導致啞鈴狀DNA產生。這種結構很快以自身為板，進行DNA合成延 伸，形成莖-環DNA結構，然后以此結構作為的LAMP循環的起始結構。由于內引物雜交在 莖-環的環上，引物鏈置換合成的DNA產生一個有缺口的莖-環DNA中間媒介，在莖上附有 目標序列。再通過外引物，在莖的末端形成環狀結構，結果在同一鏈上互補序列周而復始形 成有很多環的花椰菜結構的莖-環DNA混合物。
[0006] 迄今，LAMP已廣泛的應用于各種微生物檢測（Song et al.，2005 ;Mekata et al.， 2006 ;Endo et al.，2004 ;Lwamoto et al.，2003 ;Lu et al.，2014 ;Fukuta et al.，2013)。 但目前尚未見LAMP技術用于瓜蔓枯病菌（D.bryoniae)檢測的報道。因此，急需一種針對 瓜蔓枯病菌（D.bryoniae)快速、靈敏、簡便、且可用于種子帶菌檢測的現代檢測技術。此項 發明滿足了這些需求。
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