基于DNA Barcoding的六種鱸形目魚類及其生肉制品的鑒別方法及鑒別試劑盒的制作方法
【專利說明】基于DNABarcoding的六種鱸形目魚類及其生肉制品的鑒 別方法及鑒別試劑盒
【背景技術】
[0001] DNA條形碼（DNA Barcoding)是通過對一個標準目的基因的DNA序列進行分析從 而進行物種鑒定的技術。這個概念的原理與零售業中對商品進行辨認的商品條形碼是一 樣的。簡單地說，DNA條形碼技術的關鍵就是對一個或一些相關基因進行大范圍的掃描，進 而來鑒定某個未知的物種或者發現新種（Hebert et al.，2003a ;Hebert et al.，2003b; Hebert et al.，2004)。
[0002] 自從提出DNA條形碼的概念以來，這種新興分類學技術已經引起了越來越多的生 物學家的關注。DNA條形碼技術是分類學中輔助物種鑒定的新技術，它代表了生物分類學研 宄的一個新方向（肖金花等，2004)，因此它在生態、環境、食品等諸多領域都將會有廣泛的 應用（Janzen，2004)。
[0003] DNA條形碼技術的主要優勢有很多，其中包括：（1)鑒定不依賴形態特征，只需提 供物種的DNA即可鑒定，一旦某一生物DNA條碼數據庫建立起來，條形碼技術能夠快速的從 部分零散組織中鑒定到種的水平。（2)對實驗的操作技能要求不高，鑒定過程標準化、快速、 準確。一個標準DNA條形碼數據庫的建立，可使各種物種的辨認成為可能，如瀕危物種或常 見種、土著物種或入侵種等，也使更多的無分類學專業知識的人能夠準確的辨認出某個物 種。
[0004] DNA條形碼技術的主要流程包括：提取待檢測物種DNA、設計引物PCR擴增、克隆、 測序及序列比對，結果分析。其中最關鍵的是DNA條形碼理想序列的確定和標準DNA條形 碼數據庫的建立。
[0005] 已有研宄表明，編碼線粒體細胞色素C氧化酶I(C0 I)基因是許多魚類 (Savolainen et al.，2005 ;Ward et al.，2005)、昆蟲（Smith et al.，2005 ;Ahrenset al.，2007 ;Elias et al.，2007 ;張娛等，2011)和鳥類（Hebert et al.，2004 ;Tavares and Baker，2008)等動物分類與鑒別的理想DNA條形碼。
[0006] 鱸形目是輻鰭魚綱中的一個目，是世界上魚類中種類最多的一個目，鱸形目魚類 廣泛分布在溫熱帶海區，該目中有很多是經濟魚類。其中，鱸魚是一種重要的、營養價值很 高的經濟魚類，而鱸形目中大黃魚、小黃魚、帶魚占據我國四大海產中的三席，在我國海洋 漁業產量中占有很大比重。金鯧、鱖魚、生魚也都是常見的經濟魚類。
[0007] 隨著人們生活水平的提高，越來越多的海產品進入了家庭的餐桌，其中鱸形目魚 類因種類繁多，經濟和營養價值差異顯著，導致市場上出現一些不法商販"以次充好"謀取 不當利益，為此需要研發一種操作簡單、準確性高、價格相對低廉的鱸形目常見魚類及其生 肉制品的鑒別方法。
[0008] 另外，近年來，隨著我國經濟的高速發展，生態問題日益突出，為外來物種的入侵 提供了便利條件，比如鱸形目魚類中的生魚生性兇猛，繁殖力強，胃口奇大，常能吃掉某個 湖泊或池塘里的其他所有魚類，給當地魚類開發和保護帶來隱憂。而鱸形目魚類作為我國 近海及淡水湖水生環境的指標生物，不僅可作為水體凈化指標，還可以作為外來物種入侵 檢驗指標，同時其多樣性指標也可以反映其生境狀態。
[0009] 如何快速有效的識別魚類，特別是鱸形目魚類，成為迫切需要解決的問題。但是， 由于傳統的形態分類學目前得不到足夠的重視，形態分類的專業人員逐步減少，影響了魚 類資源保護以及生境研宄等工作。
[0010] 近年來廣泛發展的一種由四川大學研發出的魚類分子生物學快速鑒別方法 CN200510022323. 1，是通過編碼魚類RNA的核DNA序列的保守性及其轉錄間隔子的種問差 異結合傳統的電泳技術鑒別魚類，這種方法耗時較長，成本較高，更關鍵的是這種方法無法 用于篩選和鑒定特定的魚類。國內外尚未有基于DNA條形碼技術鑒別上述鱸形目魚類的專 利申請和報道。

【發明內容】

[0011] 針對現有技術的缺陷，本發明公開了一種六種鱸形目魚類（金鯧、鱖魚、大黃魚、 鱸魚、生魚、帶魚）及其生肉制品的鑒別方法，通過對編輯好的堿基序列長度進行比較來鑒 別多種魚類中是否有這六種鱸形目魚類中的某種，該方法是基于DNA Barcoding建立的， 不受被鑒定材料的形態限制，即便是個體的組織碎片，也能得出準確的結論，因此可用于上 述六種鱸形目魚類及其生肉制品的準確鑒定，并為物種和生態環境保護提供有力的技術支 持。
[0012] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
[0013] 1、根據已知魚類的DNA條形碼數據庫，設計和合成多組引物。
[0014] 2、從包含這六種魚的多種魚類中提取DNA，利用引物對每個待測對象的DNA進行 擴增，根據擴增的結果，選出最佳引物和反應條件。
[0015] 3、利用步驟2篩選出的引物對每個待測對象的DNA進行擴增，擴增后的序列進行 測序，然后進行數據分析，從而得到針對鱸形目魚類DNA Barcoding數據庫。
[0016] 4、在建立DNA Barcoding數據庫后，對新的待測對象采用步驟（2)篩選出的引物 進行檢測，將其與步驟3的DNA Barcoding數據庫中的序列長度進行比對，從而確定其是否 為6種鱸形目魚類中的某種。
[0017] 通過上述方法，先建立對應特定引物的準確的含有魚類C 01序列長度的D NA Barcoding數據庫，在后續檢測新的待測樣品是否為上述六種鱸形目魚類時只需進行序列 長度比對即可進行鑒定得到準確結果。
[0018] 其中，在上述方法中，采用酚氯仿抽提法提取DNA。
[0019] 具體的說，通過上述方法篩選得到了兩對具有良好PCR擴增性能的引物，分別為
[0020] 引物 1(F-BaL1023/F-BaH1377 :CAAGTCGTAACATGGTAAG/ATCATGATGCAAAAGGTAC)， 引物 2(F-BaL1475/F-BaH1752 :CCCGTCTCTGTGGCAAAAGAG/TGGCTGCTTTTAGGCCCAC)。
[0021] 通過上述引物，得到的6種鱸形目魚類DNA Barcoding數據庫如下表1所示：
[0022] 表 1 :DNA Barcoding 數據庫
[0023]
【主權項】
1. 基于DNA Barcoding的六種鱸形目魚類及其生肉制品的鑒別方法，所述六種鱸形目 魚類為金鯧、鱖魚、大黃魚、鱸魚、生魚、帶魚；所述鑒別方法包括下述步驟： 1) 根據已知魚類的DNA條形碼數據庫，設計和合成多組引物； 2) 從包含這六種魚的多種魚類中提取DNA，利用引物對每個待測對象的DNA進行擴增， 根據擴增的結果，選出最佳引物和反應條件； 3) 利用步驟2)篩選出的引物對每個待測對象的DNA進行擴增，對獲得的目的片段測 序，然后進行校正、比對，從而得到針對常見魚類DNA Barcoding數據庫； 4) 在建立DNA Barcoding數據庫后，對新的待測對象采用步驟2)篩選出的引物進行檢 測，將其與步驟3)的DNA Barcoding數據庫中的序列長度進行比對，從而確定待測樣品是 否為前述該六種鱸形目魚類中的一種。
2. 根據權利要求1的鑒定方法，其特征在于采用酚氯仿抽提法提取DNA。
3. 根據權利要求1的鑒定方法，其特征在于篩選出兩組特異引物，引物1為： F-BaL1023/F-BaH1377 :CAAGTCGTAACATGGTAAG/ATCATGATGCAAAAGGTAC ;引物 2 為： F-BaL1475/F-BaH1752 ：CCCGTCTCTGTGGCAAAAGAG/TGGCTGCTTTTAGGCCCAC〇
4. 根據權利要求3的鑒定方法，其特征在于基于這兩組引物建立的DNA Barcoding數 據庫如下所示：
〇
5. -種基于DNA Barcoding的六種鱸形目魚類鑒別試劑盒，其特征在于包含權利要求 3中的引物1和/或引物2。
【專利摘要】本發明公開了基于DNA Barcoding的六種鱸形目魚類及其生肉制品的鑒別方法，步驟為：1)根據已知魚類DNA Barcoding數據庫，設計合成引物；2)提取含上述六種魚類的多種魚類DNA，利用引物對其進行PCR擴增，根據擴增結果，選出最佳引物和反應條件；3)利用步驟2)篩選出的引物對每個待測樣品DNA進行擴增，對擴增片段測序、校正、比對，得到上述多種魚類的DNA Barcoding數據庫；4)對新的待測樣品采用步驟2)篩選出的引物進行檢測，將其與步驟3)的DNA Barcoding數據庫中的序列長度進行比對，確定待測樣品是否為六種鱸形目魚類中的一種。本發明方法成本低、操作簡便、準確性高，解決了上述六種鱸形目魚類及其生肉制品的鑒別難題，為食品安全監管、物種和環境保護等工作的開展提供了技術支持。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104745705
【申請號】CN201510159470
【發明人】蔡原, 趙生國, 權金強, 李永青, 汪文強, 郭永博, 鄭王山, 邊琳鶴
【申請人】甘肅農業大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月7日