一種復合光合細菌制劑的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于一種功能性微生物制劑技術范圍，具體的說是涉及到一種保存時間 長，快速降解養殖水體中氨態氮，硫化氫等有害物質的復合光合細菌制劑的制備方法。
【背景技術】
[0002] 許多水生和海生的環境，諸如魚場，水池，池塘，湖泊，河口灣以及海洋在水柱中含 有一個或者多處好氧區以及一個或多個厭氧區。在靠近水柱表面的有氧區，空氣和風引入 氧氣，而好氧細菌產生磷酸鹽，二氧化碳和氨氣等。在靠近水柱底部的厭氧區，厭氧微生物 傾向于產生硫化氫，氨氣和甲烷等。在厭氧區及其下沉積物中硫化氫與氨態氮的積聚是有 毒的和不受歡迎的，因為它們給水生和海生動物群體帶來壓力。在某些情況下，比如在商業 化的魚塘和蝦塘中，群體生活在水體底部或者靠近水體底部的地方，處于厭氧區之中或者 接近該區，硫化氫的積聚會減少應該群體的產量和/或其個體的質量。
[0003] 在本領域中對于與厭氧區相關的問題已知若干解決方法。例如，可將化學氧化劑， 諸如臭氧、二氧化氯、各過氧化氫、過氧化鈣或過氧化鎂，添加入水體中以緩解厭氧的狀況， 盡管這些方法可能有效，但是它們可能是昂貴的，迫使使用者盡可能減少添加入水體的氧 化劑的量。這種對節約的需要若導致劑量不足，則可能是有害的。劑量不足會帶來問題，因 為它會造成不充分氧化或部分氧化，產生氣味問題。當將二氧化氯添加至有機酸時，不充分 氧化會導致氯乙酸的生成，氯乙酸在非常低的濃度下有可察覺的惡臭。然而這些步驟是設 計有來消除氣味的，而可能對環境中的水生和海生動物(如魚或蝦）有害。
[0004] 其他已知的控制硫化氫的方法包括用硫氧化細菌來處理，如專利200880020095. 6 公開了一種降硫化氫的硫氧化學細菌，副球菌屬中泛養副球菌，能降解水體中的硫化氫，以 改善水生或海生動物的產量與質量，但沒有公開其具體的制備方法。而光合細菌中的紫色 硫細菌也是一類具有較強降解硫化氫與氨態氮能力的硫氧化細菌，但現如今光合細菌的研 究和應用大部分集中在紫色非硫細菌上，如專利201110077489.9 "一種高濃度光合細菌的 簡易培養方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌，專利號200810219265. 5 "一種光合細菌制 劑的制備工藝"，使用的菌種為沼澤紅假單胞菌進行通氣培養；專利號200910039525. 5 "一 種農用光合細菌制劑的生產方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌和球形紅細菌。專利號 201210255225. 2 "高活菌數光合細菌原代菌種的制種方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌。 專利號200410048678. 3"高濃度光合細菌制劑的制備方法"使用的菌種為沼澤紅假單胞菌， 莢膜紅假單胞菌和球形紅假單胞菌，而我們一般認為，沼澤紅假單胞菌，莢膜紅假單胞菌， 球形紅假單胞菌等紫色非硫光合細菌是具有較強降解氨態氮的能力，但不能直接利用硫化 氫，且有些對硫化氫比較敏感，盡管李秀珠分離到一株紫色非硫光合細菌在對蝦養殖中能 對抑制硫化物的產生一定效果，但其分析認為池塘底質中乳酸，醋酸等幾種短碳鏈揮發性 脂肪酸是有助于硫酸鹽還原菌生長的，由于光合細菌對這些脂肪酸的利用，可能對硫酸鹽 還原菌有抑制作用，從而可以抑制硫化氫的產生，并不能完全證明這些紫色非硫光合細菌 能直接利用，氧化硫化氫。
[0005] 國內對紫色硫細菌的研究僅見于少數幾篇文獻，對光合細菌在水處理的研究也主 要側重于氨氮和C0D，而對于硫化物處理方面的研究較少，紫色非硫細菌對硫化物利用的能 力很差，只有當硫化物的濃度保持在較低水平時，硫化物才能較好的抑制，而紫色硫細菌對 硫化物具有較高的耐受性，能在厭氧條件下以硫化氫等無機物作電子供體還原二氧化碳， 合成有機物從而起到去除硫化物的作用。
[0006] 桃紅莢硫菌：細胞球形，直徑1. 2-3微米，一般為1. 5微米，單個細胞通常被一層 粘的莢膜包住，常見有雙球形聚合體，四聯體和不規則的堆，它們通常被粘液層所包圍。厭 氧的光能自養菌：有果糖、甘油或有機酸時所有菌株都能在微好氧到好氧的黑暗條件下生 長。光合電子供體：硫化物，硫代硫酸鹽，硫和分子氫。可光合同化醋酸鹽、果糖、延胡索酸 鹽、甘油、蘋果酸鹽、丙酮酸和琥珀酸鹽。大多數菌株具有同化型硫酸鹽還原作用。桃紅莢 硫菌生活在光線能及的滯水和污泥中，尤其是在含硫化物豐富的環境中。環境條件對桃紅 莢硫菌的影響較大，25-30°C、1000-30001ux或更強的光照，PH值7. 0-7. 5的厭氧環境最適 合該菌的生長和氧化作用，在偏離最適條件下，桃紅莢硫菌也有較大的適應范圍，10-40°C、 500-60001ux和PH5-9,均能適應生長，在微好氧黑暗狀態下也能生存，條件不適時，該菌的 生長處于抑制狀態，一旦條件允許，又能繼續生長。四川大學的馮甦對紫硫細菌中的桃紅莢 硫菌進行了研究，認為桃紅莢硫菌適于應用到制作菌肥和處理含硫污染物方面。但要投入 實際運用，還需注意以下幾點：第一，桃紅莢硫菌的生長速度緩慢，一般要培養兩周以后才 會有明顯的生長趨勢，較長的生長周期不利于大規模的應用；第二，桃紅莢硫菌在純培養情 況下生長不如與其它菌株混合培養好。當培養物中同時存在其它種類的光合細菌，如紫色 非硫細菌、綠硫細菌或其它菌種時，桃紅莢硫菌生長要快得多，所以在生產上使用時，可考 慮多種菌類混合培養與處理。而到目前為止，還未見有關桃紅莢硫菌具體制備方法技術方 案公開。
[0007] 而且從現有文獻上來看，大部份復合光合細菌只是對紅螺菌科內的菌進行混合培 養，還未有報道紅螺菌科與著色菌科的菌之間進行混合培養。
[0008] 另外，一般的光合細菌是營養態細胞，不易保存，一般常溫下，最長保存時間為3-6 個月，超過保存時間，存活率很少，這也是光合細菌在水產應用上一個大缺點。

【發明內容】

[0009] 針對現有技術的不足，本發明提供一種紫硫光合細菌中的桃紅莢硫菌與紫色非硫 細菌中的萬尼氏紅微菌混合培養，菌體生長速度快，菌體含量高，培養時間短，而且保存時 間長，能快速降解水體硫化氫與氨態氮的復合光合細菌制劑的制備方法。
[0010] 本發明所采用的技術方案是：采用紫硫光合細菌中的桃紅莢硫菌菌種與紫色非硫 光合細菌中的萬尼氏紅微菌按以下步驟進行培養： 0)、桃紅莢硫菌半固體種子活化培養：將桃紅莢硫菌種穿刺在半固體桃紅莢硫菌培養 基中，25-30°C光照培養7-10天，待穿刺的菌線變紅并長出菌苔，即可為活化的桃紅莢硫菌 種； ⑵、萬尼氏紅微菌平板活化：將萬尼氏紅微菌菌種在平板上劃線活化，溫度25-35°C活 化培養3-5天，挑取大個菌落作為活化種子； ?、桃紅莢硫菌種子培養：將活化的菌種接種至桃紅莢硫菌種子液體培養基中，溫度 25-35°C，光照強度為：1000-30001ux，光照厭氧培養7-10天，檢測種子的0D650彡1.2,活 菌數> 6億cfu/ml即為種子培養液； (4)、萬尼氏紅微菌種子培養：將挑取大個萬尼氏紅微菌菌落作為活化種子接種到萬尼 氏紅微菌種子培養基中，溫度25-35°C，光照強度為：1000-30001UX，光照靜置培養3-5天， 檢測種子的OD660彡1. 2,活菌數彡8億cfu/ml即為種子培養液； (5) 、發酵培養：將桃紅莢硫菌種子培養液與發酵培養基以1 :3-1 :5的接種量接種，同 時將萬尼氏紅微菌種子培養液與發酵培養基按1 :6-1 :10的接種量接入，在光照培養罐中 厭氧培養，培養溫度25-35°C，光照強度為：1000-40001ux，攪拌速度為120轉/分鐘，待培 養