人巨細胞病毒交聯抗體及其在免疫檢測試劑盒中的應用
【專利說明】
[0001] 本申請是申請號為201310267573. 6、申請日2013年6月28日的中國專利申請的 分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及一種異源交聯物，具體而言就是一種由兩種異源的抗體通過交聯反應 而獲得的含有四聚體形式的異源交聯抗體的異源交聯物，及其在病人陽性血液中病原體抗 體替代物上的應用，屬于免疫學技術領域。
【背景技術】
[0003] 如今，諸如病毒、細菌、真菌和寄生蟲之類的病原體給人類帶來的威脅越來越大。 基于抗原和抗體之間特異性和高靈敏性反應的免疫分析方法，如膠體金免疫層析檢測、乳 膠免疫層析檢測、放射免疫檢測（RIA)、酶聯免疫吸附檢測（ELISA)、時間分辨熒光免疫檢 測（TRFIA)或化學發光免疫檢測（CLIA)，已經被廣泛地用于臨床免疫測試之中。這些免疫 分析方法通常被用來定性或定量地檢測人血液中的病原體抗原或抗體，從而快速和準確地 確定感染是否發生和/或感染所處的階段。
[0004] 臨床免疫檢測試劑盒一般都包括陰性質控品和陽性質控品。這些質控品往往來 自抗體效價較高的病人陽性血液的系列稀釋品，或者直接使用不同抗體效價的病人陽性血 液，包括血清、血漿或全血。但是利用病人陽性血液制備陽性質控品有很多缺點：1)很難獲 得同時具有高效價和高特異性的病人陽性血液；2)個體之間的抗體效價和特異性差異較 大，難以標準化；3)成本比較高，4)有些病原體感染病例稀缺，在短時間內很難獲得足夠的 陽性血液；5)病原體陽性血液具有潛在的傳染性，即便經過滅活處理，但仍然難以保證徹 底滅活，同時在收集和滅活病人陽性血液時，操作人員也有潛在被感染的風險。為此，人們 經常使用替代病人陽性血液的質控品。
[0005] 歐洲專利申請EP 0 330 902A2揭示出在檢測人血液特異性抗體時，使用一種或 多種人單克隆抗體（如人抗風瘆病毒單克隆抗體和人抗水痘帶狀皰瘆病毒單克隆抗體）作 為測試對照，但是每次構建的人單克隆抗體只包括一種抗體的恒定區，檢測其他抗體類型 需要重新構建，而且由于在倫理上不允許利用人體進行抗體制備，因而不得不利用噬菌體 展示技術和轉基因動物等方法來制造人單克隆抗體，這就使得抗體制備比較困難。美國專 利US 6, 015, 662揭示出人鼠嵌合抗體可以用于人血液抗體檢測的陽性對照，但是每次構 建的人鼠嵌合單克隆抗體只包括一種抗體的恒定區，檢測其他抗體類型需要重新構建，而 且工藝非常復雜，這是因為除了利用雜交瘤技術獲得小鼠單克隆抗體之外，還要進行抗體 基因克隆以及人鼠嵌合基因的構建和表達。
[0006] 目前除上述方法制備抗體外，還出現了利用交聯劑制備抗體。已有很多種利用 交聯劑制備交聯抗體的方法。如交聯劑琥泊酰亞胺吡啶二疏基丙醋[N-Suc c i n imi dy 1 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP]可被用來將兩種不同的蛋白（包括抗體和酶） 交聯在一起而形成交聯物（Carlsson J, Drevin H, and Ax6n R. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio) propionate, a new heterobifunctional reagent. Biochem. J.,1978, 173:723-737)〇交 聯劑苯二馬來酰亞胺（〇-phenylenedi-maleimide,〇-PDM)也被用來將兩種抗體的片段 交聯在一起（Glennie M, McBride H, Worth A, et al. . Preparation and performance of bispecific F (ab'gamma) 2antibody containing thioether-1inked Fab'gamma fragments. J. Immunol. , 1987, 139:2367-2375)。歐洲專利 EP 0062227A1 揭示出利用 交聯劑戊二醛或高碘酸鈉將兩種不同物種來源的抗體偶聯在一起。此外，美國專利US 4, 507, 234 揭不了交聯劑二硫代雙硝基苯甲酸[5, 5' -dithiobis-(2-nitrobenzoicacid)， DTNB]可被用來制備交聯抗體。美國專利US 4, 929, 543揭示了交聯劑S-乙酰巰基丁二酸 酐（S-acetylmercaptosuccinic anhydride, AMSA)和馬來酰亞胺己酰基-N-羥基瑭泊酰亞 胺醋（Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimide ester，MHS)可被用來制備交聯抗體。美 國專利US 5, 478, 753揭示了交聯劑4-馬來酰亞胺基丁酸-N-琥珀酰亞胺酯（N-y -malei midobutyryloxysuccinimide ester, GMBS)可被用來制備交聯抗體。
[0007] 交聯抗體也常被用于制備替代病人陽性血液的質控品。美國專利US4, 929, 543揭 示了非人的抗體或其Fab或F(ab'）2片段和人免疫球蛋白或其Fc片段的異源交聯物，用于 人血清抗體診斷。美國專利US 5, 478, 753揭示了非人的非IgM和人IgM的異源交聯物，用 于血清IgM診斷試劑盒，異源交聯物中的非人的非IgM可特異性地識別和結合病原體抗原， 人IgM可以和標記抗體結合。美國專利US 5, 491，218揭示了非人的抗體或其片段和另一 種抗體的異源交聯物，如人IgM和抗單純皰瘆病毒抗體F (ab'）2片段的異源交聯物，異源交 聯物中非人的抗體特異性地結合一種特定的病原體，另一種抗體特異性地結合一種特定的 抗體類型。中國專利ZL97109106. 4揭示了非人的抗艾滋病病毒抗體或經處理后具有抗體 活性的片段和人免疫球蛋白的異源交聯物，可用作病人陽性血液中艾滋病病毒抗體的替代 物。但是以上這些專利中并沒有揭示制備出的異源交聯物的具體組成，這就造成了異源交 聯物不同批次之間質量不穩定，容易產生檢測誤差，替代性較差。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供一種由兩種異源的抗體通過交聯反應而獲得的異源交聯 物，所述異源交聯物包括由所述兩種異源的抗體形成的四聚體形式的異源交聯抗體。優選 地，所述兩種異源的抗體為非人的病原體抗體和健康的未感染病原體的人抗體；優選地，所 述四聚體形式的異源交聯抗體在所述異源交聯物中所占的質量比不小于50%。
[0009] 本發明的目的在于一種異源交聯物在病人陽性血液中病原體抗體替代物上的