一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明研究了一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增殖、懸浮細胞培養等步驟。本發明方法利用細胞懸浮培養方法可以快速獲得遺傳性狀穩定的黃葛細胞，繁殖率高，在短期內提供大量的制藥原料，并能有效降低生產成本。
【專利說明】一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組培條件下黃葛懸浮細胞的培養，屬于植物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]黃葛樹,拉丁^iFicus rire/75.,別名黃桷樹、大葉格樹、馬尾格、雀樹,桑科格屬落葉大喬木。重慶、四川、湖北等地栽培最佳，宅旁、橋畔、路側隨處可見，新葉展放后鮮紅色的托葉紛紛落地，甚為美觀。是常用的庭蔭樹、行道樹之一。現為中國重慶的市樹。黃葛樹喜光，耐旱，耐瘠薄，有氣生根，適應能力特別強。生態環境:生于疏林中或溪邊濕地，耐寒性較榕樹稍強。黃葛樹其根、葉入藥。根:祛風除濕，清熱解毒。用于風濕骨痛，感冒，扁桃體炎，眼結膜炎。葉:消腫止痛。外用治跌打腫痛。目前主要的繁殖方式是扦插繁殖和播種繁殖。組培快繁方法尚無人研究，利用組培懸浮細胞培養可以縮短培養周期，保持遺傳穩定性，短期內獲得大量的制藥原料。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供黃葛細胞懸浮培養的快速繁殖方法，快速獲得遺傳性狀穩定的黃葛細胞，繁殖率高，在短期內提供大量的制藥原料，并能有效降低生產成本。
[0004]為解決上述技術問題，本發明采用下列技術方案:
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺上次氯酸鈉處理1min,無菌水沖洗5_7遍,消毒處理過的黃葛葉片接入培養基MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導出來的愈傷組織放入培養基MS+2，4-D 0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸100mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x,增殖后的愈傷組織放入液體培養基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.3mg/L+ABA2mg/L+硝酸鑭2mg/L進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x，培養條件為培養溫度25°C，光照 11 ?13 h/d，轉速 100 ?120 r/min。
[0005]采用本發明制備的黃葛懸浮細胞，生長速度快，增殖率高，利于大生產操作，能耗小，污染少。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。
【具體實施方式】
[0007]實施例1
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺上次氯酸鈉處理1min,無菌水沖洗5_7遍，消毒處理過的黃葛葉片接入培養基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導出來的愈傷組織放入培養基MS+2，4-D 0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸100mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈傷組織放入液體培養基MS+NAA 0.05mg/L+ZT0.2mg/L+ABAlmg/L+硝酸鑭lmg/L進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0008]實施例2
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺上次氯酸鈉處理1min,無菌水沖洗5_7遍，消毒處理過的黃葛葉片接入培養基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導出來的愈傷組織放入培養基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸lOOmg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001X，增殖后的愈傷組織放入液體培養基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.4 mg/L+ABA3mg/L+硝酸鑭3 mg/L進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0009]實施例3
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺上次氯酸鈉處理1min,無菌水沖洗5_7遍，消毒處理過的黃葛葉片接入培養基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導出來的愈傷組織放入培養基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸lOOmg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈傷組織放入液體培養基MS+NAA 0.lmg/L+ZT0.4 mg/L+ABA3mg/L+硝酸鑭2mg/L進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
[0010]實施例4
取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min，超凈工作臺上次氯酸鈉處理1min,無菌水沖洗5_7遍，消毒處理過的黃葛葉片接入培養基配方為MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期8 h，誘導出來的愈傷組織放入培養基MS+2，4_D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸lOOmg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x，增殖后的愈傷組織放入液體培養基MS+NAA0.05mg/L+ZT0.3 mg/L+ABA2mg/L+硝酸鑭2mg/L進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x。
【權利要求】
1.一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，包括無菌外植體的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增殖、懸浮細胞培養等，主要步驟如下: (1)取黃葛幼嫩葉片，按照常規的消毒方法對其進行消毒處理； (2)將步驟(I)消毒處理過的黃葛葉片接入培養基MS+IAA0.2mg/L+2iplmg/l+15mg/L廣大霉素誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，暗期16h，光期 8h ； (3)取步驟(2)誘導出來的愈傷組織放入培養基MS+2，4-D0.2mg/L+TDZ0.lmg/L+檸檬酸100mg/L進行愈傷組織增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，PH5.8，光照30001x ； (4)取步驟(3)增殖后的愈傷組織放入液體培養基MS+NAA0.05-0.lmg/L+ZT0.2-0.4mg/L +ABAl-3mg/L+硝酸鑭1-3 mg/L進行懸浮細胞培養，附加蔗糖30g/L，PH5.8，光照40001x ； 按照權利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(I)中所述黃葛無菌葉片的獲得為，取黃葛的葉片，先在漂白粉中浸泡3min，流水沖洗為25min,超凈工作臺上次氯酸鈉處理1min,無菌水沖洗5_7遍。
2.按照權利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(2)中所述愈傷組織的誘導在培養基中附加了 15mg/L廣大霉素，可以消除內生菌。
3.按照權利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(3)中所述愈傷組織的增殖中附加了檸檬酸，可以有效防止愈傷組織的褐化現象。
4.按照權利要求1所述的一種黃葛愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)所述的黃瑞木懸浮細胞按照按照下述方法得到:挑選松散性好，健康的愈傷組織，繼代3次以后，在無菌條件下分別放入裝有25 mL液體培養基的錐形瓶內，加入已消毒滅菌的玻璃珠振搖后，置于振蕩培養箱中進行水平振蕩培養，培養條件為培養溫度25°C,光照 11 ?13 h/d，轉速 100 ?120 r/min。
5.按照權利要求1所述的一種黃瑞木愈傷組織和懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征在于:步驟(4)中加入了稀土硝酸鑭，對細胞懸浮培養的生長有促進作用。
【文檔編號】C12N5/02GK104263690SQ201410446370
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月4日 優先權日:2014年9月4日
【發明者】張金芳, 楊存 申請人:南京標科生物科技有限公司