專利名稱：適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞培養基領域，尤其涉及一種適用于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基。
背景技術：
狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或動物源性人畜共患急性傳染病，流行性廣，病死率極高，對犬進行嚴格管理、犬免疫或滅犬，是控制人狂犬病的積極有效方法。目前對該病尚無特殊有效的治療方法，病死率幾乎100%。口蹄疫是偶蹄動物的一種急性、熱性、 高度接觸性傳染病，其病毒變異和流行傳播速度都極快，可感染70多種家養和野生的偶蹄動物，在世界范圍內對畜牧業及相關產業造成相當大的影響，世界動物衛生組織將其列為必須申報的傳染病，我國將其列在一類動物傳染病的首位。疫苗接種是成功預防、控制乃至最終消滅口蹄疫的最有效手段。偽狂犬病對國內畜牧養殖業的發展帶來了不利影響。除各種年齡的豬、牛都易感外，在自然條件下使羊、犬、貓、兔、鼠、水貂、狐等動物感染發病。實驗動物中家兔、豚鼠、小鼠都易感。其中以家兔最敏感。中國現在用幼倉鼠腎細胞(BHK細胞) 制造的狂犬疫苗系、口蹄疫疫苗系和偽狂犬疫苗系全部或者部分采用BHK細胞生產，現在國內的生產工藝多采用MEM添加10%血清滾瓶貼壁培養，較國外無血清生物反應器高密度懸浮培養工藝落后甚多。除了上述動物疫苗產品外，許多生物技術方面的新近進展，如重組蛋白、抗體、經由BHK細胞生產的，都需要大規模的體外細胞培養，這就需要相當多的細胞培養基。然而，常規的細胞培養基中的血清和血清蛋白是有問題的，并且對大規模生物反應器培養而言成本上是不允許的，現有技術中描述的其他血清替代方法在大量使用時也是很昂貴。大多數商業上可獲得的培養基的主要問題是需要向培養基提供大量的血清成分(一般為5% 20%)，由于血清的高價格和有限的可獲得性，造成了一個顯著的限制因子。此外， 從生產的角度來說，在培養基中添加動物血清和/或血清白蛋白會使下游產品純化更加復雜，并且其中可能污染的病毒也是嚴重的安全問題。更進一步地，血清存在批次穩定性問題。因此，對于大規模生物反應器發酵所需要的是一種以相當低的成本提供細胞生長所需基本營養的、生物和生物物理必需品的細胞培養基，可提供極好的細胞生長和最大細胞密度的性能，并且也易于從相對較少數量的低成本成分制備得來。優選地，該培養基應該不含血清。國內外均缺少專門針對BHK細胞培養的無血清培養基，如文獻[1]報道使用國際上主流的商業化培養基Hyclone的HyQ PF CH0,HyQ PF CHO MPS培養基，JRH的ExCe 11302， ExCell520培養基以及默克的Rencyte BHK培養基來懸浮培養BHK細胞，最大細胞密度僅僅達到了 2. 2 X IO6細胞數/毫升，不及已開發的BHK低血清培養基懸浮培養最大細胞密度 8. OX IO6細胞數/毫升的30%。另外一些文獻報道的BHK-21無血清培養的最大細胞密度也均在2.0X106細胞數/毫升左右[2’3]。國內的培養基龍頭企業清大天一的產品MD611培養基可以有效的作為BHK細胞貼壁培養的低血清培養基，此外，清大天一開發出可以懸浮培養BHK細胞的低血清培養基，并未申請專利，同時尚未公開銷售。即使清大天一的低血清培養基，懸浮培養BHK細胞的密度也僅僅達到了 4X IO6細胞數/毫升M。綜上所述，開發低成本的可以用于規模化生產中并且不含血清的BHK細胞成本有效性無血清培養基對國內動物疫苗行業的發展的具有重要意義。參考文獻
1.H Kallel, Jouini, S Majoul, S Rourou. Evaluation of various serum and animal protein free media for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK-21 cells. Biotechnol. 95(2002)195-204.
2.The new medium MDSS2N, free of any animal protein supports cell growth and production of various viruses. Off Merten, H Kallel, JC Manuguerra, M Tardy-Panit, R Crainic, F Delpeyroux, S Van der Werf， P Perrin. Celltechnol. 30(1999) 191-201.
3.H Kallel, S Rourou, S Majoul, H Louki1. A novel process for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK—21 cells grown on microcarriers in a 20-1 bioreactor. App 1 Microbiol Biotechnol. 61(2003)441-446.
4.細胞培養手冊2011版，清大天一，2011。

發明內容
鑒于上述現有技術存在的缺陷，本發明的目的是提出一種適用于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，既可避免有血清培養基的種種不利因素，又可以消除滾瓶貼壁培養難以規模放大的問題。本發明的目的將通過以下技術方案得以實現
一種適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其特征在于包括氨基酸，無機鹽，維生素，蛋白水解物，脂類，緩沖成分和添加物；所述氨基酸為L-色氨酸， L-半胱氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，L-精氨酸鹽酸鹽，L-組氨酸鹽酸鹽，L-賴氨酸，L-蛋氨酸，L-谷氨酸，L-苯丙氨酸，L-天冬酰，甘氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-谷氨酰胺，L-胱氨酸鹽酸鹽以及L-酪氨酸二鈉鹽；所述無機鹽為六水氯化鎂，無水硫酸鎂，無水氯化鈣，氯化鉀，氯化鈉，一水磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，七水合硫酸鋅，九水合硝酸鐵，亞硒酸鈉以及五水硫酸銅；所述維生素為肌醇，維生素 C，磷酸吡哆醇，磷酸吡哆醛，鈷銨素，煙酰胺，核黃素，鹽酸硫胺素，D-泛酸鈣，葉酸，生物素 (Biotin)以及氯化膽堿；所述蛋白水解物為大米水解物；所述脂類為亞油酸和嵌段式聚醚 F-68 (Pluronic F-68)；所述緩沖成分為碳酸氫鈉和羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)；所述添加物為D-葡萄糖，丙酮酸鈉，還原型谷胱甘肽，次黃嘌呤鈉鹽，腐胺和硫辛酸。優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中 所述氨基酸的含量以毫克/升計為
L-色氨酸15 750
L-半胱氨酸5 204
L-異亮氨酸27 480L-亮氨酸 L-纈氨酸 L-精氨酸鹽酸鹽 L-組氨酸鹽酸鹽 L-賴氨酸 L-蛋氨酸 L-谷氨酸 L-苯丙氨酸 L-天冬酰胺甘氨酸 L-脯氨酸 L-丙氨酸 L-天冬氨酸 L-絲氨酸 L-蘇氨酸 L-谷氨酰胺 L-胱氨酸鹽酸鹽 L-酪氨酸二鈉鹽
30 20
48 30 30 22
4 -25 47 3
-840 -620 -698 -780 -480 -190 30 -96 -600 24
17. 25 500 3 25 3 20. 5 27 670 50 500 365 584 32 64
56 100。 優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中所述維生素的含量以毫克/升計為
維生素C0.1 15磷酸吡哆醇0.2 2磷酸吡哆醛0.001 0. 1鈷銨素0.03 -一 3煙酰胺0.1 5核黃素0.1 0. 8鹽酸硫胺素0.2 5氯化膽堿1 8D-泛酸鈣0.1 -4葉酸0.1 4生物素0.003 0. 1肌醇2 10。 優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中所述無機鹽的含量以毫克/升計為 六水氯化鎂1 60
無水硫酸鎂1 60
無水氯化鈣5 160
氯化鉀50 400
氯化鈉3000 7000一水磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉七水合硫酸鋅九水合硝酸鐵亞硒酸鈉五水硫酸銅
40 200 10 180 0. 1 0. 5 0. 01 0. 5 0. 001 0. 02 0. 0001 0. 002。優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中所述脂類的含量以毫克/升計為
亞油酸0.01 0.1
嵌段式聚醚F-68 500 1000。優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中所述緩沖劑的含量以毫克/升計為
碳酸氫鈉MOO 觀00
羥乙基哌嗪乙磺酸2000 3800。優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中所述添加物的含量以毫克/升計為
D-葡萄糖丙酮酸鈉還原型谷胱甘肽次黃嘌呤鈉鹽腐胺硫辛酸
1000 5000 30 165 0. 01 0. 9 0. 1 5 0. 08 0. 4 0. 1 0. 4。優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中所述的蛋白水解物的含量以毫克/升計為
大米水解物500 6000。優選的，上述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其中
組分的含量以·■克/升計為L-色氨酸15 ‘ 750L-半胱氨酸5 ‘204L-異亮氨酸27 ‘ 480L-亮氨酸30 ‘ 840L-纈氨酸20 ‘ 620L-精氨酸鹽酸j鹽 48 ‘ 698L-組氨酸鹽酸j鹽 30 ‘ 780L-賴氨酸30 ‘ 480L-蛋氨酸22 ‘ 190L-谷氨酸4 ‘30L-苯丙氨酸25 ‘ 96L-天冬酰胺47 ‘ 600甘氨酸 L-脯氨酸 L-丙氨酸 L-天冬氨酸 L-絲氨酸 L-蘇氨酸 L-谷氨酰胺 L-胱氨酸鹽酸鹽 L-酪氨酸二鈉鹽維生素C 肌醇
磷酸吡哆醇磷酸吡哆醛鈷銨素煙酰胺核黃素鹽酸硫胺素氯化膽堿 D-泛酸鈣葉酸生物素大米水解物六水氯化鎂無水硫酸鎂無水氯化鈣氯化鉀氯化鈉
一水磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉七水合硫酸鋅九水合硝酸鐵亞硒酸鈉五水硫酸銅亞油酸
嵌段式聚醚F-68 碳酸氫鈉
羥乙基哌嗪乙磺酸 D-葡萄糖丙酮酸鈉
3 24 17. 25 500 3 25 3 20. 5 27 670 500 -584 64 100 15
50 -365 32 -56彳 0. 1 -2 10 0. 2 2 0. 001 0. 1 0. 03 3 0. 1 5 0. 1 0. 8 0. 2 5 1 8 0. 1 4 0. 1 4 0. 003 0. 1 500 6000 1 60 1 60 5 160 50 400 3000 7000 40 200 10 180 0. 1 0. 5 0. 01 0. 5 0. 001 0. 02 0. 0001 0. 002 0. 01 0. 1
500 -2400 2000 1000
30
-1000 2800 3800 5000 165還原型谷胱甘肽 0. 01 0. 9 次黃嘌呤鈉鹽 0. 1 5 腐胺0. 08 0. 4
硫辛酸0. 1 0. 4。大多數常規細胞培養基的起點是一種基本的基礎培養基，一般包含氨基酸、糖類、 維生素、無機鹽、微量元素、緩沖液。對大多數常規的培養基而言，將適當的動物血清或者血清白蛋白以及脂質成分加入到該基本的基礎培養基中而制得用于支持細胞生長和繁殖、重組蛋白表達以及病毒復制或病毒產物表達所必需的完全培養基。考慮到與血清或血清白蛋白的使用相關聯的成本和問題，在現有技術中在用其他蛋白替換物替換血清成分方面已經做了一些嘗試。例如，中國專利02110644. 4公布了一種無血清培養基，它由1)常規的基礎培養基，2)脂類混合物，3)蛋白胨組成，其中蛋白胨成分中水解的蛋白質產物目的是要替代一般發現于血清或白蛋白中的蛋白質。盡管可以支持重組BHK細胞生長到與含血清培養基同等的密度，但是該培養基中含有較多的昂貴成分，并且不能支持細胞的生長至足夠高的水平以用于經濟的生產。因此，在培養基的性能和總成本兩方面仍需要改進。在本發明中通過調整某些氨基酸的含量，去除了培養基中的蛋白含量，并且不影響培養基的性能。在本發明的無血清培養基上培養BHK細胞得到了 4倍于中國專利02110644. 4所報道的最大細胞密度，并且不僅可以支持重組細胞株表達蛋白或者抗體，也可以支持病毒的感染和增殖。 因此本發明的無血清完全培養基提供了與現有技術中描述的無血清組合物相比較而言額外成本的節省，同時提供了極好的效果。本發明中的無血清培養基的優選方案包括氨基酸、無機鹽、維生素、糖類等，其中加入了蛋白水解物成分、脂質成分和保護成分。這些物質一起提供了支持細胞生命、生長和繁殖所必需的基本營養成分。本發明的無血清完全培養基進一步包含蛋白水解物成分，該蛋白水解物不僅補償了培養基中氨基酸的含量，還提供了對血清或白蛋白的替代物。術語“蛋白水解物”是指水解的蛋白產物，一般指天然蛋白質經酸或酶部分水解所得的平均分子量在約5到30 KD 的蛋白質裂解產物混合物。可選擇地，用來聯合制備蛋白水解物成分的單獨蛋白胨組份部分將經超濾或類似步驟預先純化，去除任何殘留的蛋白酶、內毒素或其他的可潛在的干涉培養基中生長的BHK細胞表達的重組蛋白產物或病毒和使用的高分量的產物。因此，預期用于本發明的蛋白胨可以很容易的與血清、血清白蛋白等提供的高分子量的蛋白質區分開來，后者已經從本發明的培養基中去除了。培養基中蛋白水解物的濃度依賴很多因素，例如所使用的特定的蛋白水解物、要培養的細胞系的特征、給定的蛋白胨對細胞生長產生毒性或抑制作用的濃度等，蛋白水解物的最佳濃度都以經驗來確定。一般的，在本發明無血清完全培養基中蛋白水解物的總量為0.1克/升到約15克/升的范圍內，更通暢地為0.5克 /升到10克/升。適用于本發明的蛋白水解物是商業上可獲得的，主要為大米水解物，也可以為水解乳白蛋白，酪蛋白水解物，胰蛋白胨磷酸肉湯和其它植物水解物。本發明的培養基也可含有其他水溶性成分，例如胰島素(可以加強糖類的吸收)， 運鐵蛋白(可轉運鐵)，痕量元素如硒，過氧化氫酶(作為過氧化反應保護劑)，乙醇胺(可作為脂質前體)，類固醇激素如睪丸素，甲狀腺激素如三碘甲腺原氨酸，核酸前體如次黃嘌呤、 胸腺嘧啶脫氧核苷、脫氧腺苷和脫氧胞苷，以及在常規的用于細胞培養的補充了血清的培養基或無血清培養基中含有的其他營養成分。 制備培養基的方法并不是關鍵性的。例如，培養基可以通過如下所述方法制得，即將所有組分及附加物先以各自的合適濃度溶解于水，然后加壓使溶液通過一個薄膜濾器過濾得到無菌的培養基。如上文提到的，當為了表達重組蛋白、抗體或者病毒而培養BHK細胞時，培養基中的蛋白胨成分將優先地預純化以使以后的純化更容易，例如通過過濾，隨后用具有比需收集的任何蛋白或病毒產物小的分子量界限的膜進行超濾。用本發明的培養基培養細胞的方法也不是關鍵性的。以與常規培養基大約相同的條件用本發明的培養基培養細胞。通常，在本發明無血清培養基中生長的細胞是在一定溫度范圍并對所選擇的特定細胞系合適的條件下培養的。例如，BHK-21細胞，是在約36 37. 5°C溫度范圍內培養的，其中培養基的PH值優選地保持在約7. 0 7. 5的范圍內，更優選的在7. 0 7. 2范圍內。細胞培養在通氣良好的環境中是有利的。通常，如果BHK細胞可以成功地在其中使用了血清、白蛋白或其他蛋白質脂質載體的培養基中生長，那么該細胞可在本發明的培養基中生長，其中的血清或蛋白質脂質載體均被取代，并可選擇性的加入其他必需的激素和生長因子。例如，有許多種商業上可獲得的用于BHK細胞培養的培養基，它們包含下列商業上可獲得的基礎培養基，例如 Glasgow MEM (BHK-21)[ Macpherson et al. Virology. 16:47(1962)]，Eagle 的Minimum Essential Media (kience，1959，30:43 等。本發明的培養基不僅適用于細胞的生長， 而且也適用于生產有用的生理活性的物質如重組蛋白、因子或者抗體，還可以用于生產病毒疫苗。美國第7，465，447號專利中使用冊1(-21細胞表達？^ 0。Kallel等報道使用 BHK-21 細胞擴增狂犬病毒(Kallel et al. Jour Biotechnol. 95 (2002) 195-204)。然而，受益于本公開內容的本領域的技術人員將會認識到依照本發明許多其他的重組蛋白或者病毒可以由該細胞株制得。可以的重組蛋白包括但不限于組織纖溶酶原激活物(TPA)， Fc-EPO，凝血ΥΠ因子等。還可以的病毒包括但不限于狂犬病毒，偽狂犬病毒等。進一步，可以在本發明的培養基中生長的BHK細胞可以是不同亞克隆細胞株，但是優選的是ΒΗΚ-21細胞。在本發明的培養基中培養的優選ΒΗΚ-21細胞系適合于許多重組蛋白、抗體表達，并且適于偽狂犬和狂犬、口蹄疫等多種病毒擴增。本發明的突出效果為本發明可采用常規的制備方法進行制取，其使用方法也為常規方法；本發明的BHK細胞無血清懸浮培養基單細胞懸浮培養生產生物制品，不含血清， 組分明確，有利于產物的分離純化，提高產品品質，既可避免有血清培養的種種不利因素， 又可以消除滾瓶貼壁培養難以規模放大的問題；支持BHK細胞長期傳代培養，無需長期而復雜的適應過程；能良好的支持BHK細胞單細胞懸浮生長，配制使用容易，且成本低廉，適于粉末培養基制備，并用于生物制品的規模化生產利用，提高BHK細胞培養的生產效率，具有良好的應用價值和巨大的市場前景。以下便結合實施例附圖，對本發明的具體實施方式
作進一步的詳述，以使本發明技術方案更易于理解、掌握。


圖1是ΒΗΚ-21細胞分別在本發明的無血清培養基(BS-SFM)和現有技術的BHK細胞無血清培養基(hyclone CHO-PF和EX 302)中的生長曲線；cells/ml 細胞數/毫升；
12圖2是BHK-21細胞分別在本發明的無血清培養基(BS-SFM)和現有技術的在添加10% 小牛血清(CS)的MEM培養基以及商業化無血清培養基(CHO-PF和EX 302)中培養生產狂犬疫苗的產量，其中，種毒滴度為105_°LD5Q/0.03毫升。感染比例均為1% (v/v);LD50/0. 03ml LD50/0. 03 毫升；Time (h)時間(小時)。
具體實施例方式實施例1
本實施例的一種適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，它包括21 種氨基酸、11種無機鹽、12種維生素、1種蛋白水解物、2種脂類、2種緩沖成分、6種添加物； 下面描述的材料均購自Sigma。利用在表1中所列的成分和量制備了本實施例無血清培養基的特定實施方案，標記為 BS-SFM。表1
權利要求
1.一種適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，其特征在于包括氨基酸，無機鹽，維生素，蛋白水解物，脂類，緩沖成分和添加物；所述氨基酸為L-色氨酸，L-半胱氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，L-精氨酸鹽酸鹽，L-組氨酸鹽酸鹽，L-賴氨酸，L-蛋氨酸，L-谷氨酸，L-苯丙氨酸，L-天冬酰，甘氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-天冬氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-谷氨酰胺，L-胱氨酸鹽酸鹽以及L-酪氨酸二鈉鹽；所述無機鹽為六水氯化鎂，無水硫酸鎂，無水氯化鈣，氯化鉀，氯化鈉，一水磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，七水合硫酸鋅，九水合硝酸鐵，亞硒酸鈉以及五水硫酸銅；所述維生素為肌醇，維生素C，磷酸吡哆醇，磷酸吡哆醛，鈷銨素，煙酰胺，核黃素，鹽酸硫胺素，D-泛酸鈣，葉酸，生物素以及氯化膽堿； 所述蛋白水解物為大米水解物； 所述脂類為亞油酸和嵌段式聚醚F-68 ； 所述緩沖成分為碳酸氫鈉和羥乙基哌嗪乙磺酸；所述添加物為D-葡萄糖，丙酮酸鈉，還原型谷胱甘肽，次黃嘌呤鈉鹽，腐胺和硫辛酸。
2.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述氨基酸的含量以毫克/升計為L-色氨酸15 ‘ 750L-半胱氨酸5 ‘204L-異亮氨酸27 ‘ 480L-亮氨酸30 ‘ 840L-纈氨酸20 ‘ 620L-精氨酸鹽酸鹽48 ‘ 698L-組氨酸鹽酸鹽30 ‘ 780L-賴氨酸30 ‘ 480L-蛋氨酸22 ‘ 190L-谷氨酸4 ‘30L-苯丙氨酸25 ‘ 96L-天冬酰胺47 ‘ 600甘氨酸3 24L-脯氨酸17.25 5(L-丙氨酸3 ‘25L-天冬氨酸3 ‘20. 5L-絲氨酸27 ‘ 670L-蘇氨酸50 ‘ 500L-谷氨酰胺365 584L-胱氨酸鹽酸鹽32 ‘ 64L-酪氨酸二鈉鹽56 ‘ 100。
3.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述維生素的含量以毫克/升計為維生素C0.1 15磷酸吡哆醇0.2 2磷酸吡哆醛0.001 0. 1鈷銨素0.03 -一 3煙酰胺0.1 5核黃素0.1 0. 8鹽酸硫胺素0.2 5氯化膽堿1 8D-泛酸鈣0.1 -4葉酸0.1 4生物素0.003 0. 1肌醇2 10。
4.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述無機鹽的含量以毫克/升計為六水氯化鎂1 60無水硫酸鎂1 60無水氯化鈣5 160氯化鉀50 400氯化鈉3000 7000一水磷酸二氫鈉40 200磷酸氫二鈉10 180七水合硫酸鋅0. 1 0. 5九水合硝酸鐵0. 01 0. 5亞硒酸鈉0. 001 0. 02五水硫酸銅0. 0001 0. 002。
5.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述脂類的含量以毫克/升計為亞油酸0.01 0.1嵌段式聚醚F-68 500 1000。
6.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述緩沖劑的含量以毫克/升計為碳酸氫鈉MOO 觀00羥乙基哌嗪乙磺酸2000 3800。
7.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述添加物的含量以毫克/升計為D-葡萄糖1000 5000丙酮酸鈉30 165還原型谷胱甘肽 0. 01 0. 9 次黃嘌呤鈉鹽0. 1 5腐胺0. 08 0. 4硫辛酸0. 1 0. 4。
8.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 其特征在于所述的蛋白水解物的含量以毫克/升計為大米水解物500 6000。
9.根據權利要求1所述的適于幼倉鼠腎細胞大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基， 包括氨基酸，無機鹽，維生素，蛋白水解物，脂類，緩沖成分和添加物，其特征在于，其各組分的含量以毫克/升計為L-色氨酸 L-半胱氨酸 L-異亮氨酸 L-亮氨酸 L-纈氨酸 L-精氨酸鹽酸鹽 L-組氨酸鹽酸鹽 L-賴氨酸 L-蛋氨酸 L-谷氨酸 L-苯丙氨酸 L-天冬酰胺甘氨酸 L-脯氨酸 L-丙氨酸 L-天冬氨酸 L-絲氨酸 L-蘇氨酸 L-谷氨酰胺 L-胱氨酸鹽酸鹽 L-酪氨酸二鈉鹽維生素C 肌醇磷酸吡哆醇磷酸吡哆醛鈷銨素煙酰胺核黃素鹽酸硫胺素氯化膽堿 D-泛酸鈣15 750 5 204 27 480 30 840 20 620 48 698 30 780 30 480 22 190 4 30 25 96 47 600 3 24 17. 25 500 3 25 3 20. 5 27 670 500 ^ 584 64 100 1550 ‘ 365 32 ‘ 56 ‘ 0. 1 ‘ 2 10 0. 2 2 0. 001 0. 1 0. 03 3 0. 1 5 0. 1 0. 8 0. 2 5 1 8 0. 1 4葉酸生物素大米水解物六水氯化鎂無水硫酸鎂無水氯化鈣氯化鉀氯化鈉一水磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉七水合硫酸鋅九水合硝酸鐵亞硒酸鈉五水硫酸銅亞油酸嵌段式聚醚F-68 500 1000 碳酸氫鈉MOO 觀00羥乙基哌嗪乙磺酸2000 3800D-葡萄糖丙酮酸鈉還原型谷胱甘肽次黃嘌呤鈉鹽腐胺硫辛酸`0. 1 4 0. 003 0. 1 500 6000 1 60 1 60 5 160 50 400 3000 7000 40 200 10 180 0. 1 0. 5 0. 01 0. 5 0. 001 `0. 02 0. 0001 0. 002 0. 01 0. 1`1000 5000 30 165 0. 01 0. 9 0. 1 5 0. 08 0. 4 0. 1 0. 4。
全文摘要
本發明揭示了一種適于幼倉鼠腎細胞(BHK細胞)大規模單細胞懸浮培養的無血清培養基，包括21種氨基酸、11種無機鹽、12種維生素、1種蛋白水解物、2種脂類、2種緩沖成分和6種添加物。本發明的BHK細胞無血清培養基單細胞懸浮培養生產生物制品，既可避免有血清培養的種種不利因素，又可以消除滾瓶貼壁培養難以規模放大的問題，從而提高BHK細胞培養的生產效率并降低生產成本，同時確保產品的質量，具有良好的應用價值和巨大的市場前景。
文檔編號C12N5/02GK102268403SQ201110217948
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月1日 優先權日2011年8月1日
發明者張大鶴, 滕小锘, 龔迪 申請人:上海米迪生物技術有限公司