抗人vegf的重組嵌合抗體及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫學領域，特別是抗體方面，更具體地涉及一種抗VEGF的重組嵌合 抗體及其用途。
【背景技術】
[0002] 在迄今發現的20多種多肽類血管生長因子中，血管內皮生長因子（vascular endothelialgrowthfactor,VEGF,也可寫作VEGF-A)是針對內皮細胞特異性最高，促 血管生長作用最強的關鍵調節因子，在多種原發性惡性腫瘤組織中均呈高表達，所述腫 瘤包括肺、乳房、胃腸道、腎、胰臟和卵巢腫瘤（BerkmanRA等，1993，/CZi/?TsmsA 91:153-159)。
[0003]VEGF家族除了原型成員VEGF-A外，還包括胎盤生長因子（placentagrowth factor,P1GF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。VEGF-A是高度保守的同源二聚體糖蛋白，由兩條 分子量各為24kDa的單鏈以二硫鍵組成二聚體。人VEGF-A基因由8個外顯子、7個內含子 組成，由于mRNA不同的剪切方式，分別產生出VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF2Q6等至 少5種蛋白形式，其中VEGF165是體內表達最多且生物活性最強的亞型。VEGF家族通過與受 體結合發揮作用。
[0004] 貝伐單抗（Avastin)是FDA批準的第一個抗腫瘤血管生成的人源化單克隆抗體 (美國專利No. 08/833504 ;中國專利CN1259962A)。它是一種抗VEGF的抗體（IgGl)，93%的 人源結構域和7%的鼠源結合區域（抗原決定簇，CDR)組成。貝伐單抗與VEGF的結合親和 力約為0. 5nM，可抑制VEGF與VEGFRl和VEGFR2的結合。貝伐單抗在人體內的消除半衰期 為17~21天。Avastin于2004年2月被美國FDA批準作為聯合化療治療轉移性結直腸癌 的一線藥物上市。隨后幾年，貝伐單抗又被FDA批準用于聯合化療或其他抗腫瘤藥物作為 晚期非小細胞肺癌、轉移性腎細胞癌以及腦膠質瘤的一線治療藥物。另外，Avastin用于治 療HER2陰性乳癌的申請已獲歐洲藥監局EMA的批準。目前針對卵巢癌、轉移性胃腺癌、復 發性肝癌的貝伐單抗聯合化療的II/III期臨床試驗正在進行中。
[0005] 除了癌癥外，抗VEGF抗體也是治療包括老年性黃斑變性（AMD)，糖尿病引起的眼 底病在內的多種眼科疾病的一線藥物。眼睛水狀液和玻璃狀液中VEGF的增加已與各種視 網膜病相關聯（AielloLP等，#份取1994，331:1480-1487)。為了治療這些 疾病，在Avastin的基礎上，基因泰克公司又將其全抗體分子結構進行簡化，保留能夠中 和VEGF的抗體片段，同時將給藥途徑由靜脈注射改為玻璃體直接注射，由此成就另一藥 物-Avastin的孿生姊妹蘭尼單抗（Lucentis)，即一種源自貝伐單抗的親和力成熟的 Fab片段。2006年，蘭尼單抗被美國藥監局批準用于治療AMD，很快就成為治療老年性黃斑 變性和糖尿病引起的眼底病的首選藥。
[0006] 雖然貝伐單抗已應用于臨床多年，對多種實體腫瘤的治療都取得了良好的療效， 但貝伐單抗對VEGF親和力不高，并且由獨家生產，病人需要花費高額的費用，目前一個病 人用藥一年的費用約在5萬至10萬美元。此外，有效性和不良反應也是不容忽視的問題。用 Avastin輔助治療癌癥會導致副作用，包括高血壓、蛋白尿、血栓栓塞事件（thromboembolic event)、出血和心臟毒性（BlowerE等，/M/rs，2009,18:351-6，358)。另外，VEGF抗 體針對同一靶點不同亞型的特異性會影響其治療效果，已證實貝伐單抗不僅結合VEGF還 可與VEGF165b結合,并不適用于治療體內高度表達VEGF1651^tJ患者（HarperSJ等，Caflcer, 2008， 8:880-887)。
[0007] 因而，研發新的抗VEGF單克隆抗體，從而減少病人負擔，降低治療費用是一個亟 待解決的問題。抗VEGF抗體藥物升級需要獲得和研究針對VEGF不同抗原表位或識別相同 表位而親和力不同的抗體CDR區。不同CDR免疫源性是不同的，這會造成抗體被耐受的速度 和毒性的差異，直接影響藥效。針對不同抗原表位或識別相同表位而親和力不同的抗體CDR 與抗原結合的親和力也會有差異，高親和力⑶R的抗體藥物每針劑用量預期可以下調。鑒 于VEGF和其受體的多樣性，針對VEGF不同抗原表位或識別相同表位而親和力不同的VEGF 抗體對腫瘤生長或其他與VEGF高表達相關疾病的抑制效果可能是不同的。此外，抗體的療 效還受抗體血漿半衰期和血管通透性等因素的影響。因此研究識別VEGF不同抗原表位或 相同表位而親和力更高的抗體，并進行人源化改造將有助于獲得療效更好的治療性抗體。

【發明內容】

[0008] 因此，本發明的目的是提供一種比現有技術中的小鼠抗體更加安全可靠的、功能 更顯著的抗VEGF的嵌合抗體。所述嵌合抗體與人VEGF的結合Kd值約0.OlnM，能夠高特異 性地拮抗VEGF與VEGFR的結合，其結合VEGF能力是人源化抗體Avastin的10倍以上。因 此，本發明所提供的人VEGF嵌合抗體具有更高的特異性，在臨床應用中，有望提高安全性， 且臨床使用劑量僅需Avastin的1/10即可達到等同藥效，大大降低患者的治療成本。
[0009] 在本發明的一個方面，公開了一種與人血管內皮生長因子結合的抗體，其特征在 于，該抗體的重鏈可變區的⑶R-Hl為SEQIDNO:3所示的氨基酸序列，⑶R-H2為SEQID NO:4所示氨基酸序列，和CDR-H3具有SEQIDNO:5所示氨基酸序列；以及該抗體的輕鏈可 變區的CDR-Ll為SEQIDNO:8所示氨基酸序列，CDR-L2為SEQIDNO:9所示氨基酸序列， 和CDR-L3為SEQIDNO:10所示氨基酸序列。
[0010] 在該方面的一個優選例中，該抗體的重鏈可變區為SEQIDNO:2所示的氨基酸序 列，相應地，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
[0011] 在該方面的另一個優選例中，該抗體的輕鏈可變區為SEQIDNO:7所示的氨基酸 序列，相應地，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。
[0012] 在該方面的還有一個優選例中，其重鏈恒定區序列是人IgGl的重鏈恒定區序列。
[0013] 在該方面的還有一個優選例中，該抗體的輕鏈恒定區序列是人K抗體輕鏈恒定 區序列。
[0014] 在該發明的一個優選例中，該抗體與1^￡6?165結合的1(1)值為彡0.11^，優選為 0.OlnM。
[0015] 在第二個方面，本發明提供了編碼上述嵌合抗體的分離核酸。
[0016] 在第三個方面，本發明提供了含有上述核酸的表達載體。
[0017] 在第四個方面，本發明提供了用上述表達載體轉染的宿主細胞。優選地，所述宿主 細胞為哺乳動物細胞。
[0018] 在本發明的第五個方面，提供了一種藥物組合物，含有上述抗體和藥物學上可接 受的載體。
[0019] 在本發明的第六個方面提供了所述藥物組合物的用途，優選該藥物組合物用于治 療任何與血管生成異常相關的疾病，特別是與VEGF信號通路相關聯的血管生長增加，而導 致、加劇、或以其他形式相關聯的狀態。這些疾病，通常與VEGF表達水平升高相關，包括 與血管生成增加相關的眼部疾病，如濕性AMD或增殖性視網膜病變如糖尿病性視網膜病 變，糖尿病腎病和其他糖尿病血管增生疾病，囊性纖維化病、多種依賴于新生血管生成的 腫瘤（AmorosoA等，Eur Rev Med Pharmacol Sci,1997, 1:17-25;McColleySA等， Am J Respir Crit Care Med,2000, 161:1877-1880;KhamaisiM等， 2003,18:1427-1430)以及炎癥。所述癌癥包括但不限于結腸轉移癌、直腸轉 移癌、非鱗狀非小細胞肺癌、J1ER2陰性乳癌、腎細胞癌、卵巢癌、胃腸道癌、骨腫瘤、前列腺癌 或肝癌等。所述炎癥包括但不限于類風濕性關節炎、牛皮癬、硬皮病、慢性阻塞性肺部疾病 或哮喘。
【附圖說明】
[0020] 圖1競爭法ELISA篩選各孔內抗人VEGF鼠單克隆抗體對經HRP標記的抗VEGF人 源化抗體Avastin與hVEGF的競爭結合能力。
[0021] 圖2間接法ELISA測定抗人VEGF鼠單克隆抗體結合VEGF的效價。其中，鼠單克 隆抗體TM12-15-1的效價最高。
[0022] 圖3抗人VEGF鼠單克隆抗體對經HRP標記的抗VEGF人源化抗體Avastin與VEGF 的競爭結合測定。其中，抗hVEGF鼠單克隆抗體TM12-15-1競爭Avastin結合抗原的能力 最強。
[0023] 圖4BLI分析鼠單克隆抗體TM12-15-1親和力的動力學擬合曲線。
[0024] 圖5鼠單克隆抗體TM12-15-1與人VEGF結合平衡解離常數Kd值測定圖。
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