本發明屬(shu)于(yu)生物合(he)成，涉及(ji)一種低(di)產(chan)泡能力的(de)解脂耶氏酵(jiao)(jiao)母菌株及(ji)其應用，具體(ti)涉及(ji)發酵(jiao)(jiao)產(chan)泡沫能力顯著降低(di)的(de)解脂耶氏酵(jiao)(jiao)母菌的(de)獲取與(yu)篩選方法及(ji)用于(yu)合(he)成赤蘚糖醇(chun)的(de)方法。

背景技術：

1、隨著合成(cheng)(cheng)生(sheng)物(wu)技(ji)術的(de)(de)發(fa)(fa)展(zhan)，對(dui)底(di)盤(pan)菌(jun)株(zhu)的(de)(de)要求越(yue)來越(yue)高(gao)(gao)，這些要求包括：耐受性(xing)(xing)(如耐受高(gao)(gao)滲透壓以及耐受高(gao)(gao)溫、耐受酸(suan)性(xing)(xing)環(huan)境等(deng))、抗污染性(xing)(xing)、低(di)泡(pao)性(xing)(xing)等(deng)。但是目前人們普遍(bian)更關注對(dui)環(huan)境的(de)(de)耐受性(xing)(xing)，而對(dui)是否低(di)泡(pao)性(xing)(xing)并沒有(you)太多(duo)的(de)(de)關注，認為通過(guo)添加消(xiao)泡(pao)劑(ji)即(ji)能(neng)有(you)效解決(jue)(jue)。但是，即(ji)使通過(guo)添加消(xiao)泡(pao)劑(ji)能(neng)抑(yi)制(zhi)(zhi)泡(pao)沫(mo)的(de)(de)產(chan)生(sheng)，但是仍(reng)然存在以下問(wen)題：消(xiao)泡(pao)劑(ji)會抑(yi)制(zhi)(zhi)底(di)盤(pan)菌(jun)生(sheng)長；消(xiao)泡(pao)劑(ji)會增加發(fa)(fa)酵(jiao)成(cheng)(cheng)本(ben)；消(xiao)泡(pao)劑(ji)會增加分離(li)成(cheng)(cheng)本(ben)；消(xiao)泡(pao)劑(ji)還增加污染機會。而且，合成(cheng)(cheng)生(sheng)物(wu)底(di)盤(pan)發(fa)(fa)酵(jiao)產(chan)泡(pao)沫(mo)是發(fa)(fa)酵(jiao)領(ling)域遇到的(de)(de)共性(xing)(xing)問(wen)題，該問(wen)題的(de)(de)解決(jue)(jue)對(dui)提高(gao)(gao)發(fa)(fa)酵(jiao)性(xing)(xing)能(neng)，降低(di)發(fa)(fa)酵(jiao)成(cheng)(cheng)本(ben)具(ju)有(you)重要的(de)(de)意義(yi)。

2、解脂耶(ye)氏酵(jiao)母菌(jun)(jun)是(shi)一(yi)種常用的(de)合(he)(he)成(cheng)(cheng)生物(wu)(wu)學底盤菌(jun)(jun)株，也是(shi)合(he)(he)成(cheng)(cheng)功能糖(tang)(tang)醇如(ru)赤蘚糖(tang)(tang)醇、甘露醇、阿(a)拉伯糖(tang)(tang)醇等(deng)糖(tang)(tang)醇的(de)天然菌(jun)(jun)株(cheng?et?al.,2018,microbial?cellfactories,17:133；bilal?et?al.,2020,critical?reviews?in?food?science?andnutrition,61(4):535-552)，也是(shi)合(he)(he)成(cheng)(cheng)其它(ta)產物(wu)(wu)如(ru)萜類化合(he)(he)物(wu)(wu)的(de)工程(cheng)菌(jun)(jun)株(ma?et?al,2019.advances?in?the?metabolic?engineering?of?yarrowia?lipolytica?for?theproduction?of?terpenoids.bioresource?technology,281,449–456.//doi.org/10.1016/j.biortech.2019.02.116)，但在(zai)發酵(jiao)合(he)(he)成(cheng)(cheng)產物(wu)(wu)的(de)過(guo)程(cheng)中會產生大(da)量(liang)(liang)的(de)泡(pao)(pao)(pao)沫(mo)，需要添加消泡(pao)(pao)(pao)劑以(yi)消除泡(pao)(pao)(pao)沫(mo)。發酵(jiao)過(guo)程(cheng)中產生泡(pao)(pao)(pao)沫(mo)具有(you)以(yi)下缺點：(1)大(da)量(liang)(liang)的(de)泡(pao)(pao)(pao)沫(mo)降低發酵(jiao)罐的(de)有(you)效(xiao)使用體積；(2)大(da)量(liang)(liang)的(de)泡(pao)(pao)(pao)沫(mo)可能導致(zhi)發酵(jiao)液(ye)溢罐與(yu)染菌(jun)(jun)；(3)產生的(de)泡(pao)(pao)(pao)沫(mo)降低發酵(jiao)液(ye)的(de)溶(rong)氧，降低發酵(jiao)產量(liang)(liang)以(yi)及產物(wu)(wu)合(he)(he)成(cheng)(cheng)效(xiao)率(lv)。

3、為(wei)(wei)了(le)消(xiao)(xiao)除泡(pao)(pao)沫(mo)，就需要(yao)向發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)中添加(jia)(jia)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)或(huo)(huo)者(zhe)對發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)罐(guan)進行改造，使得其(qi)具(ju)備一定的(de)(de)(de)(de)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)機械裝(zhuang)置。發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)添加(jia)(jia)的(de)(de)(de)(de)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)包(bao)括聚醚型(xing)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)與(yu)聚硅氧(yang)烷型(xing)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)，均為(wei)(wei)化學(xue)合成(cheng)(cheng)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)。化學(xue)合成(cheng)(cheng)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)的(de)(de)(de)(de)加(jia)(jia)入雖(sui)然(ran)能(neng)消(xiao)(xiao)除一定的(de)(de)(de)(de)泡(pao)(pao)沫(mo)，但是(shi)帶來的(de)(de)(de)(de)有害之(zhi)處包(bao)括：(1)增加(jia)(jia)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)成(cheng)(cheng)本、(2)抑制微生物的(de)(de)(de)(de)生長、(3)增加(jia)(jia)發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)液(ye)的(de)(de)(de)(de)粘度、(4)降低溶氧(yang)、(5)增加(jia)(jia)分(fen)離難度、(6)產(chan)品(pin)粘附(fu)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)劑(ji)降低產(chan)品(pin)品(pin)質(zhi)。通過增加(jia)(jia)機械消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)的(de)(de)(de)(de)裝(zhuang)置會增加(jia)(jia)設備投資(zi)成(cheng)(cheng)本，而且(qie)消(xiao)(xiao)泡(pao)(pao)能(neng)力也是(shi)很有限的(de)(de)(de)(de)。因此，對菌株進行改良(liang)，從本質(zhi)上(shang)減少或(huo)(huo)消(xiao)(xiao)除泡(pao)(pao)沫(mo)的(de)(de)(de)(de)產(chan)生，才(cai)是(shi)最主要(yao)的(de)(de)(de)(de)，這對于發(fa)(fa)酵(jiao)(jiao)(jiao)領域具(ju)有重要(yao)的(de)(de)(de)(de)意義。

技術實現思路

1、本發(fa)明的(de)目的(de)是(shi)解(jie)決現有的(de)解(jie)脂耶(ye)氏(shi)酵母菌(jun)發(fa)酵合成(cheng)赤(chi)蘚糖(tang)醇(chun)(chun)的(de)不足之處，即在發(fa)酵過(guo)程中會產(chan)生大量(liang)的(de)泡沫這一嚴重的(de)缺點，提供一種低(di)產(chan)泡能力的(de)解(jie)脂耶(ye)氏(shi)酵母菌(jun)株(zhu)及其應(ying)用。通(tong)過(guo)對現有的(de)菌(jun)株(zhu)進行多種協同(tong)誘(you)變(bian)改造，對大量(liang)的(de)突變(bian)菌(jun)株(zhu)進行篩選，獲得了(le)一株(zhu)低(di)產(chan)泡能力的(de)解(jie)脂耶(ye)氏(shi)酵母菌(jun)突變(bian)株(zhu)；并采用該(gai)工程突變(bian)菌(jun)株(zhu)直接發(fa)酵葡萄糖(tang)合成(cheng)與純化赤(chi)蘚糖(tang)醇(chun)(chun)。

2、具(ju)體而言，本(ben)發明(ming)通過多(duo)(duo)種誘變(bian)(bian)的(de)方(fang)法對(dui)基因組進(jin)(jin)行突變(bian)(bian)，將原(yuan)有的(de)合(he)(he)成(cheng)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)的(de)解(jie)(jie)脂(zhi)耶氏(shi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)進(jin)(jin)行改良，使得(de)該酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)能(neng)夠利用葡萄糖(tang)等(deng)(deng)碳(tan)源高效合(he)(he)成(cheng)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)，而且不產生泡(pao)(pao)沫(mo)或者(zhe)(zhe)產泡(pao)(pao)沫(mo)的(de)能(neng)力顯著減(jian)低；對(dui)獲(huo)(huo)得(de)的(de)工程菌(jun)(jun)株(zhu)進(jin)(jin)行多(duo)(duo)種篩選，獲(huo)(huo)得(de)產泡(pao)(pao)性能(neng)大幅降(jiang)低的(de)菌(jun)(jun)株(zhu)。更(geng)具(ju)體來說，是以合(he)(he)成(cheng)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)的(de)解(jie)(jie)脂(zhi)耶氏(shi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)為(wei)(wei)出發菌(jun)(jun)株(zhu)，該酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)底盤英文(wen)(wen)(wen)名為(wei)(wei)yarrowia?lipolytica，之(zhi)前也稱為(wei)(wei)candida?lipolytica(如參考文(wen)(wen)(wen)獻bankaretal.2009.environmental?and?industrial?applications?ofyarrowialipolytica.appl?microbiol?biotechnol,84:847–865)，根據翻譯(yi)不同(tong)，中文(wen)(wen)(wen)翻譯(yi)名可以為(wei)(wei)：解(jie)(jie)脂(zhi)耶氏(shi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)、解(jie)(jie)脂(zhi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)、解(jie)(jie)脂(zhi)亞羅(luo)威酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)、亞羅(luo)威解(jie)(jie)脂(zhi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)、解(jie)(jie)脂(zhi)耶羅(luo)維亞酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)、解(jie)(jie)脂(zhi)假絲酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)、假絲解(jie)(jie)脂(zhi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)等(deng)(deng)。對(dui)此酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)底盤進(jin)(jin)行誘變(bian)(bian)操作，改變(bian)(bian)其基因組，獲(huo)(huo)得(de)不產生泡(pao)(pao)沫(mo)或者(zhe)(zhe)產泡(pao)(pao)沫(mo)的(de)能(neng)力顯著減(jian)低的(de)工程菌(jun)(jun)株(zhu)，并進(jin)(jin)行優選，獲(huo)(huo)得(de)一系列產泡(pao)(pao)性能(neng)降(jiang)低或者(zhe)(zhe)不再(zai)產生泡(pao)(pao)沫(mo)的(de)解(jie)(jie)脂(zhi)耶氏(shi)酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)母(mu)(mu)(mu)(mu)菌(jun)(jun)株(zhu)。本(ben)發明(ming)還提供采用獲(huo)(huo)得(de)的(de)菌(jun)(jun)株(zhu)由葡萄糖(tang)等(deng)(deng)碳(tan)源發酵(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)合(he)(he)成(cheng)與純化赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)的(de)方(fang)法。

3、本發明的目的可以通過以下方(fang)案來實現：

4、第(di)一方面，本發明提供一種低產泡能(neng)力的解(jie)脂(zhi)耶(ye)氏(shi)酵母(mu)菌株(zhu)，所述菌株(zhu)為解(jie)脂(zhi)耶(ye)羅維亞(ya)酵母(mu)yarrowia?lipolytica，保藏編號為cgmcc?no.31031。

5、本(ben)發明通過多(duo)種誘變(bian)與篩選，最終獲得一株(zhu)產泡能力(li)相對(dui)于(yu)出發菌株(zhu)cgmccno.7326顯著降低，在同等發酵條件下(xia)，消(xiao)泡劑的(de)添加量為對(dui)照菌株(zhu)的(de)三分之一及以(yi)下(xia)；同時合成(cheng)產物(wu)(wu)赤蘚糖醇有所提高(gao)的(de)突(tu)變(bian)株(zhu)cgmcc?no.31031，該菌株(zhu)保(bao)(bao)(bao)存于(yu)中國微生物(wu)(wu)菌種保(bao)(bao)(bao)藏管理委員會(hui)普通微生物(wu)(wu)中心(xin)，保(bao)(bao)(bao)藏名稱為解脂耶羅(luo)維亞酵母yarrowialipolytica，保(bao)(bao)(bao)藏地址為北(bei)(bei)京市朝陽區北(bei)(bei)辰西路1號院3號，保(bao)(bao)(bao)藏時間為2024年06月21日，保(bao)(bao)(bao)存編號為cgmcc?no.31031。

6、第二方(fang)面(mian)，本發(fa)明提供一種低產(chan)泡能力的解脂耶氏酵母菌株(zhu)，是(shi)通過包括以(yi)下步驟的協同誘變方(fang)法獲得：

7、s1、將如seq?id?no.1所示的dna轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座子序列轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)化感受態解脂耶(ye)氏酵母，篩選(xuan)獲(huo)得轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座子誘變(bian)菌株(zhu)；

8、s2、將(jiang)轉座子誘(you)變菌株進行artp誘(you)變，篩(shai)選獲得artp誘(you)變菌株；

9、s3、將(jiang)artp誘變菌(jun)株進行化(hua)學誘變，篩選獲得低(di)產泡能力的解(jie)脂耶氏酵母菌(jun)株。

10、本發明(ming)對合(he)成赤蘚糖醇的(de)(de)野生(sheng)解脂耶氏(shi)酵母菌(jun)(jun)(jun)cgmcc?no.7326進行(xing)多種誘變(bian)(bian)，改變(bian)(bian)基(ji)因組中(zhong)(zhong)的(de)(de)dna，即(ji)突變(bian)(bian)基(ji)因組，經篩選以獲(huo)得不產泡(pao)或者產泡(pao)能力(li)降低(di)的(de)(de)解脂耶氏(shi)酵母菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)。由(you)于(yu)微(wei)生(sheng)物底盤菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)細胞數(shu)(shu)目巨大(da)(如一(yi)(yi)次性對10億左右的(de)(de)細胞進行(xing)誘變(bian)(bian))，雖然多數(shu)(shu)誘變(bian)(bian)為不利(li)突變(bian)(bian)，有利(li)突變(bian)(bian)僅(jin)占很(hen)少(shao)的(de)(de)比例，但由(you)于(yu)受(shou)到誘變(bian)(bian)的(de)(de)細胞數(shu)(shu)目巨大(da)，即(ji)使只有百萬分(fen)之(zhi)一(yi)(yi)的(de)(de)有利(li)突變(bian)(bian)，其有利(li)突變(bian)(bian)株(zhu)(zhu)(zhu)的(de)(de)數(shu)(shu)目仍然很(hen)多(10億個細胞，假設(she)一(yi)(yi)百萬分(fen)之(zhi)一(yi)(yi)的(de)(de)有利(li)突變(bian)(bian)，即(ji)產生(sheng)約1000個有利(li)突變(bian)(bian)株(zhu)(zhu)(zhu))。采用該方法誘變(bian)(bian)獲(huo)得的(de)(de)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)在發酵過程中(zhong)(zhong)產泡(pao)沫性能顯(xian)著降低(di)，且(qie)該菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)(zhu)仍能合(he)成赤蘚糖醇。

11、作為(wei)本發明的一個(ge)實施方案，步驟s1中，所述解脂耶氏(shi)酵母的保藏編號為(wei)cgmccno.7326。

12、本發明中(zhong)，菌株cgmcc?no.7326，保(bao)存(cun)于中(zhong)國微(wei)生(sheng)物菌種(zhong)保(bao)藏(zang)管理委(wei)員(yuan)會普(pu)通微(wei)生(sheng)物中(zhong)心，保(bao)藏(zang)名稱為解脂亞(ya)羅酵母yarrowialipolytica?blc13，保(bao)藏(zang)地(di)址(zhi)為北京(jing)市朝陽(yang)區北辰西路1號院3號，保(bao)藏(zang)時間為2013年3月19日，保(bao)存(cun)編號為cgmcc?no.7326。

13、作為本發明的一個實施(shi)方案，步(bu)驟s1中(zhong)，所述轉化的方法采用醋酸(suan)鋰熱激的方法。

14、作為(wei)(wei)本發明的一個實施(shi)方案，步驟(zou)s1中，dna轉(zhuan)座(zuo)子序(xu)列(lie)中，1-360bp序(xu)列(lie)為(wei)(wei)轉(zhuan)座(zuo)子上(shang)游序(xu)列(lie)；361-2660bp為(wei)(wei)霉酚酸篩選標記基因元件；2661-3614bp為(wei)(wei)轉(zhuan)座(zuo)子上(shang)游序(xu)列(lie)。

15、作為本(ben)發明(ming)的一個實施方案，步驟s1中，所述篩選(xuan)的方法(fa)包括：將轉化后的感(gan)受態解脂耶(ye)氏(shi)酵母在含霉酚酸的固體基(ji)本(ben)培(pei)養基(ji)中培(pei)養，選(xuan)取產泡最低的菌株，即轉座子誘變菌株。

16、作為本(ben)發(fa)明的一(yi)個實(shi)施(shi)方案，步(bu)驟s1或s2或s3中，篩選出(chu)產泡最(zui)低的菌株。

17、本發明(ming)(ming)所采用(yong)轉座(zuo)子(zi)誘變的(de)(de)(de)方(fang)法，利(li)用(yong)解脂(zhi)耶氏酵(jiao)母(mu)菌非同源重組占優勢的(de)(de)(de)特點(dian)，以長(chang)末端(duan)重復(fu)序列(lie)作(zuo)為(wei)同源臂(long?terminal?repeat,ltr)，上下游(you)同源臂之間插(cha)入篩選(xuan)標記(霉酚酸(suan)篩選(xuan)標記基(ji)(ji)因(yin))，構建成一段(duan)轉座(zuo)子(zi)序列(lie)，序列(lie)為(wei)seq?no.1。以該序列(lie)轉化(hua)合成赤蘚糖醇(chun)的(de)(de)(de)酵(jiao)母(mu)菌株cgmcc?no.7326，轉化(hua)后在含霉酚酸(suan)的(de)(de)(de)固體基(ji)(ji)本培(pei)(pei)養基(ji)(ji)中(zhong)培(pei)(pei)養3-5天(tian)，得到的(de)(de)(de)轉化(hua)子(zi)逐(zhu)一在豐富培(pei)(pei)養基(ji)(ji)中(zhong)培(pei)(pei)養，從(cong)眾多轉化(hua)子(zi)中(zhong)選(xuan)擇產泡明(ming)(ming)顯降低的(de)(de)(de)轉化(hua)子(zi)，再(zai)進(jin)一步(bu)進(jin)行其它方(fang)式的(de)(de)(de)誘變。詳細的(de)(de)(de)說(shuo)明(ming)(ming)請見(jian)實施例1。

18、作(zuo)為本發明(ming)的一個(ge)實施方案(an)，步驟s2中，所述(shu)artp誘(you)變為常(chang)壓常(chang)溫(wen)等離子體誘(you)變。

19、進一(yi)(yi)步(bu)地，所述(shu)artp誘(you)變采用artp誘(you)變儀(yi)，artp誘(you)變儀(yi)內腔用紫外線(xian)殺菌(jun)10-30分鐘，在同一(yi)(yi)功率下(xia)設(she)置8種誘(you)變時(shi)間，第一(yi)(yi)個設(she)置成(cheng)10秒(miao)，每5秒(miao)增加(jia)梯度。

20、作為(wei)(wei)本(ben)發明的一個實(shi)施方案(an)，步驟s2中，篩選產(chan)泡最低的菌株作為(wei)(wei)artp誘變菌株。

21、本發(fa)明所采(cai)用(yong)的(de)(de)artp誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)方(fang)法。artp(atmospheric?and?room?temperatureplasma)為常(chang)壓常(chang)溫等(deng)離(li)(li)子體誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)的(de)(de)方(fang)法。能(neng)(neng)夠在(zai)(zai)常(chang)壓常(chang)溫下激(ji)發(fa)產(chan)(chan)生(sheng)(sheng)具有高(gao)活(huo)性(xing)(xing)粒(li)子(包(bao)括(kuo)處(chu)于激(ji)發(fa)態(tai)的(de)(de)氦原子、氧原子、氮(dan)原子、oh自由基(ji)等(deng))濃度的(de)(de)等(deng)離(li)(li)子體射流(liu)，作(zuo)(zuo)用(yong)于酵母菌細(xi)(xi)胞(bao)核dna，以產(chan)(chan)生(sheng)(sheng)dna變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)異。由于artp上(shang)述(shu)特性(xing)(xing)，其在(zai)(zai)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)育種及(ji)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)醫學領域中(zhong)已經引(yin)起人們越(yue)來越(yue)多(duo)的(de)(de)重視。等(deng)離(li)(li)子體中(zhong)的(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)粒(li)子作(zuo)(zuo)用(yong)于微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)，能(neng)(neng)夠使(shi)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)壁或細(xi)(xi)胞(bao)膜的(de)(de)結構及(ji)通透(tou)性(xing)(xing)改變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，并引(yin)起dna結構變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)化(hua)，進而使(shi)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)基(ji)因(yin)序(xu)列及(ji)其代謝(xie)網絡(luo)發(fa)生(sheng)(sheng)多(duo)種變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)化(hua)，導致微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)基(ji)因(yin)組產(chan)(chan)生(sheng)(sheng)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)。與傳(chuan)統(tong)誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)方(fang)法相比(bi)，采(cai)用(yong)artp能(neng)(neng)夠有效造成(cheng)dna多(duo)樣(yang)性(xing)(xing)的(de)(de)損傷，突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)率高(gao)，并易獲得遺傳(chuan)穩定性(xing)(xing)良好的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)株；與分子操(cao)作(zuo)(zuo)手段相比(bi)，artp進行(xing)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)育種具有操(cao)作(zuo)(zuo)簡便、成(cheng)本低(di)、無有毒有害物(wu)(wu)(wu)質參與誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)過程等(deng)優點。因(yin)此，該(gai)方(fang)法的(de)(de)使(shi)用(yong)在(zai)(zai)微(wei)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)品種改良選育上(shang)非常(chang)普遍。本發(fa)明在(zai)(zai)上(shang)述(shu)(1)獲得的(de)(de)產(chan)(chan)泡(pao)降(jiang)低(di)的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)株的(de)(de)基(ji)礎上(shang)，再采(cai)用(yong)artp的(de)(de)誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)方(fang)法進一步誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，再篩選，以獲得產(chan)(chan)泡(pao)沫(mo)(mo)能(neng)(neng)力(li)進一步降(jiang)低(di)的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)株。也(ye)可以進行(xing)多(duo)輪artp誘(you)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)，以選擇得到產(chan)(chan)泡(pao)沫(mo)(mo)能(neng)(neng)力(li)更低(di)的(de)(de)突(tu)(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)(bian)株。詳細(xi)(xi)的(de)(de)說明請見實施例2。

22、作為本發明的一(yi)個實施方案，步驟(zou)s3中(zhong)，所述化學誘變包(bao)括(kuo)：使用化學誘變劑處(chu)理artp誘變菌株。

23、進一(yi)步地，所述化(hua)學誘變(bian)(bian)采用的化(hua)學誘變(bian)(bian)劑包括堿基(ji)類似物、烷化(hua)劑、移碼(ma)誘變(bian)(bian)劑如硫(liu)酸二乙酯(dfs)、甲基(ji)磺酸乙酯(ems)、5-溴尿嘧啶(5-bu)、氮(dan)芥(nm)、n'廣甲基(ji)n'亞(ya)硝基(ji)胍(gua)(ntg)中的一(yi)種或多種。

24、進一步地，所述處理的(de)方法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)包括浸漬法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、涂抹法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、滴液法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、注射法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、施入法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)、熏蒸法(fa)(fa)(fa)(fa)(fa)中的(de)一種。

25、作為本(ben)發(fa)明的(de)一個實施方案，步驟s3中(zhong)，篩選產泡(pao)最低的(de)菌(jun)株作為低產泡(pao)能力的(de)解脂耶(ye)氏酵母菌(jun)株。

26、本發明(ming)所采用的(de)(de)(de)化學(xue)誘(you)(you)變(bian)(bian)(bian)的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)(fa)。使用化學(xue)誘(you)(you)變(bian)(bian)(bian)劑(ji)，如堿基(ji)(ji)(ji)類似物、烷化劑(ji)、移碼誘(you)(you)變(bian)(bian)(bian)劑(ji)、硫酸(suan)二乙酯(zhi)(zhi)(dfs)、甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)磺(huang)酸(suan)乙酯(zhi)(zhi)(ems)、5-溴(xiu)尿嘧啶(5-bu)、氮芥(nm)、n'廣甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)n'亞硝基(ji)(ji)(ji)胍(ntg)等，通過浸漬法(fa)(fa)(fa)、涂抹法(fa)(fa)(fa)、滴(di)液(ye)法(fa)(fa)(fa)、注射法(fa)(fa)(fa)、施(shi)入(ru)法(fa)(fa)(fa)和(he)熏蒸法(fa)(fa)(fa)等方式(shi)處理生物體，以誘(you)(you)導基(ji)(ji)(ji)因突變(bian)(bian)(bian)。本發明(ming)使用具有移碼功能(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)化學(xue)誘(you)(you)變(bian)(bian)(bian)劑(ji)甲(jia)(jia)基(ji)(ji)(ji)磺(huang)酸(suan)乙酯(zhi)(zhi)(ems)來進(jin)一步處理上述(2)獲(huo)得的(de)(de)(de)突變(bian)(bian)(bian)體，對(dui)獲(huo)得的(de)(de)(de)可能(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)突變(bian)(bian)(bian)體在(zai)豐富培養基(ji)(ji)(ji)中培養，篩選產泡能(neng)(neng)(neng)力進(jin)一步降低的(de)(de)(de)突變(bian)(bian)(bian)株。也可以進(jin)行多輪化學(xue)誘(you)(you)變(bian)(bian)(bian)，以選擇得到(dao)產泡沫能(neng)(neng)(neng)力更低的(de)(de)(de)突變(bian)(bian)(bian)株。詳細的(de)(de)(de)說明(ming)請(qing)見實(shi)施(shi)例3。

27、采(cai)用上(shang)述三(san)種協同(tong)誘變(bian)方(fang)法得到的(de)菌(jun)株，除了進行發(fa)酵產(chan)泡沫性(xing)能(neng)的(de)測試，同(tong)時還需(xu)要對合成(cheng)(cheng)產(chan)物(wu)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)的(de)能(neng)力進行測定。選取產(chan)泡顯(xian)著(zhu)降(jiang)低，同(tong)時合成(cheng)(cheng)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)能(neng)力有所提高的(de)突變(bian)株。對于產(chan)泡沫雖然有顯(xian)著(zhu)降(jiang)低，但是合成(cheng)(cheng)產(chan)物(wu)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)降(jiang)低的(de)突變(bian)株，則舍棄不(bu)用。目的(de)是通(tong)過(guo)多種突變(bian)，以得到產(chan)泡沫顯(xian)著(zhu)降(jiang)低，同(tong)時合成(cheng)(cheng)產(chan)物(wu)赤(chi)蘚(xian)糖(tang)醇(chun)有提高的(de)突變(bian)株。具(ju)體的(de)發(fa)酵數據詳見實施例(li)1-3。

28、上述篩(shai)選是(shi)(shi)在(zai)(zai)250毫升搖瓶中(zhong)(zhong)進行(xing)發(fa)酵培(pei)養，以驗(yan)證突變株(zhu)的(de)產(chan)泡(pao)性能(neng)是(shi)(shi)否降(jiang)低(di)(di)，合成(cheng)產(chan)物能(neng)力(li)是(shi)(shi)否提(ti)高。為了進一步(bu)(bu)驗(yan)證是(shi)(shi)否具備應用價值，在(zai)(zai)中(zhong)(zhong)試(shi)(shi)(shi)發(fa)酵罐中(zhong)(zhong)進一步(bu)(bu)發(fa)酵測試(shi)(shi)(shi)，驗(yan)證是(shi)(shi)否在(zai)(zai)中(zhong)(zhong)試(shi)(shi)(shi)發(fa)酵罐中(zhong)(zhong)仍然產(chan)泡(pao)性能(neng)降(jiang)低(di)(di)或者不產(chan)泡(pao)。中(zhong)(zhong)試(shi)(shi)(shi)發(fa)酵罐可以是(shi)(shi)3-50升容(rong)量的(de)發(fa)酵罐，也(ye)可以是(shi)(shi)其(qi)它容(rong)量更大的(de)發(fa)酵罐如200升體積，50立方(fang)體積發(fa)酵罐。

29、第三方面，本發明提(ti)供一種所述解脂耶氏(shi)酵母菌株在合成赤蘚糖醇中的應用。

30、第(di)四(si)方面，本發明提(ti)供一(yi)種利(li)用(yong)所述低產泡能(neng)力的(de)解(jie)脂耶氏酵母菌株發酵合成赤(chi)蘚(xian)糖醇的(de)方法，包(bao)括以下步(bu)驟(zou)：

31、步驟(zou)一、將低產泡能(neng)力的(de)解(jie)脂(zhi)耶氏酵母菌株在培養(yang)基中進行通風發(fa)酵培養(yang)，發(fa)酵結束后菌液(ye)分離得到富含赤蘚(xian)糖(tang)醇的(de)發(fa)酵液(ye)；

32、步驟二、從富含赤(chi)蘚(xian)糖醇(chun)的發酵液中分離純(chun)化得到赤(chi)蘚(xian)糖醇(chun)。

33、作為(wei)本發明的一個(ge)實(shi)施方(fang)案，步驟一中，所述(shu)培養基(ji)中的碳源(yuan)包(bao)括葡萄糖、果糖、甘油中的一種(zhong)或幾種(zhong)，所述(shu)碳源(yuan)含量為(wei)220～355克(ke)(ke)/升。優(you)選280-330克(ke)(ke)/升。最優(you)選300克(ke)(ke)/升。

34、作為本發明的(de)(de)一(yi)個(ge)實(shi)施方案，步驟一(yi)中(zhong)，所述培養基(ji)中(zhong)的(de)(de)氮(dan)源(yuan)包括酵(jiao)母(mu)浸粉(fen)、酵(jiao)母(mu)浸膏、蛋白胨(dong)、玉米(mi)漿(jiang)干粉(fen)、磷酸氫二銨、檸檬酸銨、氨基(ji)酸中(zhong)的(de)(de)一(yi)種或幾種的(de)(de)混(hun)合，所述培養基(ji)中(zhong)氮(dan)源(yuan)含(han)量為10～25克/升(sheng)(sheng)(sheng)。優選(xuan)10-18克/升(sheng)(sheng)(sheng)。最優選(xuan)14克/升(sheng)(sheng)(sheng)。

35、作為本發(fa)明的一個實(shi)施方(fang)案(an)，步驟一中，所述培養基還包括水(shui)。

36、作為(wei)本發(fa)明的(de)一個實(shi)施方案，步驟一中，所述發(fa)酵(jiao)培(pei)養的(de)ph值為(wei)3.0～7.5，溫度(du)為(wei)3033℃。發(fa)酵(jiao)培(pei)養通過(guo)振蕩或者攪拌進(jin)行。

37、作為本發(fa)明的(de)一個實施方案(an)，步驟一中(zhong)，培養過程中(zhong)根據需要，添加(jia)少量(liang)的(de)消泡(pao)劑(ji)或者不添加(jia)消泡(pao)劑(ji)。發(fa)酵培養過程中(zhong)，每隔一段(duan)時(shi)間取樣檢測原(yuan)料碳源(yuan)如葡(pu)萄糖的(de)剩(sheng)余量(liang)與(yu)產物赤(chi)蘚(xian)糖醇的(de)生成量(liang)，當(dang)碳源(yuan)如葡(pu)萄糖消耗(hao)完后停止發(fa)酵。

38、作(zuo)為本(ben)發(fa)明的一個實(shi)施方案(an)，步(bu)驟一中(zhong)，所述菌液(ye)(ye)分(fen)(fen)離(li)(li)包括：采(cai)用離(li)(li)心或(huo)者(zhe)膜過濾(lv)菌液(ye)(ye)分(fen)(fen)離(li)(li)方法分(fen)(fen)離(li)(li)去除菌體，將菌體漂(piao)(piao)洗后合并發(fa)酵液(ye)(ye)(將菌體加入水漂(piao)(piao)洗兩次(ci)或(huo)以上以充分(fen)(fen)回收其中(zhong)的赤蘚(xian)(xian)糖醇(chun))，得(de)到澄清含赤蘚(xian)(xian)糖醇(chun)的發(fa)酵液(ye)(ye)，濃(nong)縮得(de)到富(fu)含赤蘚(xian)(xian)糖醇(chun)濃(nong)縮液(ye)(ye)。

39、作為本(ben)發明的一個(ge)實施方(fang)案，步驟二(er)中，所述分離(li)純(chun)化包括：將富含赤(chi)(chi)蘚糖醇(chun)的發酵液(ye)進(jin)行一次結(jie)晶(jing)得到赤(chi)(chi)蘚糖醇(chun)粗制(zhi)(zhi)品，再經(jing)粗品重溶(rong)、離(li)子(zi)(zi)交換去除離(li)子(zi)(zi)、脫色、濃縮、二(er)次結(jie)晶(jing)得到赤(chi)(chi)蘚糖醇(chun)精制(zhi)(zhi)品、干燥。

40、與(yu)現(xian)有(you)的(de)技術相比(bi)，本(ben)發明具有(you)如下有(you)益效(xiao)果(guo)：

41、1、本發(fa)明提供(gong)的(de)(de)(de)(de)低(di)(di)產(chan)泡(pao)(pao)能(neng)力(li)的(de)(de)(de)(de)解脂耶氏酵(jiao)母菌(jun)株(zhu)，由葡萄糖發(fa)酵(jiao)合成赤蘚(xian)糖醇的(de)(de)(de)(de)過程中泡(pao)(pao)沫少(shao)，能(neng)夠(gou)提高發(fa)酵(jiao)罐的(de)(de)(de)(de)有效利(li)用率，如利(li)用產(chan)泡(pao)(pao)沫的(de)(de)(de)(de)菌(jun)株(zhu)，在100立方(fang)米體(ti)積(ji)的(de)(de)(de)(de)發(fa)酵(jiao)罐中只能(neng)裝入(ru)60立方(fang)體(ti)積(ji)或(huo)更(geng)少(shao)的(de)(de)(de)(de)發(fa)酵(jiao)液，而(er)利(li)用本發(fa)明提供(gong)的(de)(de)(de)(de)不產(chan)泡(pao)(pao)沫或(huo)者產(chan)泡(pao)(pao)沫明顯(xian)降低(di)(di)的(de)(de)(de)(de)菌(jun)株(zhu)，則可以(yi)裝入(ru)70立方(fang)甚至更(geng)多(duo)體(ti)積(ji)的(de)(de)(de)(de)發(fa)酵(jiao)液，裝入(ru)更(geng)多(duo)的(de)(de)(de)(de)發(fa)酵(jiao)液能(neng)得到(dao)更(geng)多(duo)的(de)(de)(de)(de)產(chan)物赤蘚(xian)糖醇。

42、2、使(shi)用本發明得到的(de)不產(chan)泡沫或者產(chan)泡沫明顯(xian)降(jiang)低的(de)菌株，在(zai)整個發酵過程中(zhong)消泡劑的(de)用量大(da)(da)大(da)(da)降(jiang)低，減少了消泡劑的(de)成(cheng)(cheng)本，并(bing)且在(zai)不同發酵條(tiao)件(jian)(例如發酵培養體積、ph、溫(wen)度、高(gao)糖(tang)(tang)濃度等)下均(jun)能(neng)穩定維持低泡的(de)性能(neng)；同時(shi)能(neng)夠(gou)高(gao)效合成(cheng)(cheng)赤(chi)蘚糖(tang)(tang)醇(chun)，提高(gao)赤(chi)蘚糖(tang)(tang)醇(chun)的(de)產(chan)量，發酵液(ye)中(zhong)最高(gao)230克/升(sheng)的(de)赤(chi)蘚糖(tang)(tang)醇(chun)，并(bing)且其純(chun)度達到99.9％及以上，具有(you)實際(ji)使(shi)用的(de)價值(zhi)。

43、3、消(xiao)泡劑(ji)粘(zhan)附在(zai)結晶(jing)體表面(mian)會降(jiang)低產品(pin)(pin)的(de)品(pin)(pin)質，若晶(jing)體表面(mian)沒有清洗干(gan)凈，就容(rong)(rong)易使得(de)產品(pin)(pin)容(rong)(rong)易成(cheng)塊，不(bu)利于(yu)后續(xu)加工使用(yong)(yong)。但使用(yong)(yong)本發明(ming)得(de)到的(de)不(bu)產泡沫(mo)(mo)或者產泡沫(mo)(mo)明(ming)顯(xian)降(jiang)低的(de)菌株，由于(yu)消(xiao)泡劑(ji)的(de)使用(yong)(yong)量減(jian)少還能降(jiang)低發酵液(ye)(ye)的(de)粘(zhan)度，發酵結束(shu)后菌液(ye)(ye)能更容(rong)(rong)易分離(li)，并且產品(pin)(pin)赤(chi)蘚糖醇結晶(jing)體表面(mian)粘(zhan)附的(de)消(xiao)泡劑(ji)要減(jian)少。