專利名稱：用解脂亞羅威阿酵母轉化株表達和分泌異源蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明涉及酵母蛋白的分泌技術。更具體地說，涉及重組解脂亞羅威阿酵母(Yarrowia lipolytica)克隆載體，包括為哺乳動物蛋白質(例如凝乳酶原)和其他多肽的表達和分泌編碼的異源DNA；涉及表達載體，包括解脂亞羅威阿酵母基因啟動子(例如XPR2或LEU2)、堿性蛋白酶信號(或前順序)、酶原區(pro region)、XPR2終止區，以及由于遺傳密碼簡并性或使用其它解脂亞羅威阿酵母基因成分產生的變異體及其功能等同物。此外，本發明還涉及攜帶所述表達載體和分泌載體的酵母轉化株，它們在產生天然功能狀態的異源蛋白質中的應用；以及完成上述各項的方法。
穩定而又充分地提供對工業(例如凝乳酶原、牛生長激素)或醫用(例如尿抑胃激素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、人過敏毒素C5a)有著重要價值的各種蛋白質或多肽，特別是提供易于獲得的功能態優質產品的原料，這種經濟上的誘惑力，導致許多研究人員把DNA重組技術應用于作為生產異源蛋白質“工廠”的微生物。
由于從重組宿主細胞特別是大腸桿菌的胞內積累中回收具有生物活性的外源或異源(外來的)蛋白質時遇到一些困難，所以，作為有可能解決困難的方法，廣泛的研究集中在蛋白質的分泌上。在大腸桿菌中，異源蛋白質往往是以可折射光的包涵體的狀態在細胞內產生的。該蛋白質通常水溶性很低，而且很少有或者沒有生物活性。從可折射光的包涵體中提取該蛋白質通常包括苛刻的化學處理，這種處理可能花費昂貴而回收到的所需的有生物活性的天然蛋白質微乎其微或者一無所獲。此外，為了釋放可折射光的包涵體，需要破壞細胞，因而所述蛋白被大腸桿菌產生的不良物質污染的可能性也隨之加劇。除了大腸桿菌外，其它微生物也能產生不溶性胞內狀態的異源蛋白質，例如1982年7月28日公布的英國專利2,091,271號，公開了用DNA重組技術對啤酒酵母進行遺傳改造以表達牛犢凝乳酶。鑒于這些困難，從宿主微生物分泌該種蛋白質已轉向力圖產生具有天然活性構型的蛋白質。
一種特定蛋白質，包括異源蛋白質或多肽，是否可由特定的微生物分泌，看來似乎決定于蛋白質。在大多數真核細胞中，有的蛋白質合成裝置與內質網膜相連，初生多肽鏈氨基端附近的氨基酸順序(稱為“信號順序”)的作用是引導蛋白穿過內質網膜。接著在提供活性成熟蛋白質的分泌過程中，經蛋白質水解切除信號順序。已經做出的某些嘗試，目的是為了在包括枯草桿菌、啤酒酵母的微生物中和培養哺乳動物細胞中，用信號順序建立分泌異源蛋白質的方法。然而所述的這些微生物尚未證明是理想的。
枯草桿菌的固有特性，例如分泌許多蛋白質，包括易降解分泌的異源蛋白質的許多蛋白酶；轉化株由于失去異源DNA而造成的不穩定性也阻礙了它的發展。
已經成功地對哺乳動物細胞進行了遺傳改造使其表達和分泌異源蛋白質，但是，這些系統都有技術上的要求，并且費用很高，要把大多數蛋白質作為產品進行商業生產仍然是不切實際的。
雖然啤酒酵母作為蛋白質分泌系統似乎有某些固有的局限性，但蛋白質分泌研究在啤灑酵母上取得的成功超過枯草桿菌。1984年10月31日公布的歐洲專利申請0123544號，介紹了啤酒酵母α因子基因的分離，并且將啟動子和/或其信號肽部分與位于某個質粒上編碼相對于酵母而言的異源蛋白質的DNA相結合，用于轉化能夠在細胞培養物中產生成熟的單一蛋白質的酵母細胞。1983年9月14日公布的歐洲專利申請0088632號，介紹了在啤酒酵母中表達和分泌異源蛋白質的方法。可是啤酒酵母以這些或另一些分泌系統能有效分泌的蛋白質的大小看來似乎限于20,000道爾頓左右。正如Smith等所介紹的，克服啤酒酵母作為分泌微生物的這種普遍的低效率要求多重突變(Science 229，1219～1224(1985))。這種趨勢的一個例外就是觀察到大于20000道爾頓的曲霉屬酶類明顯可以由啤酒酵母分泌，但是這些酶被啤酒酵母高度糖基化，這可能影響分泌的效率。
特殊的興趣在于解脂亞羅威阿酵母，一種用來產生檸檬酸和單細胞蛋白質的工業上重要的酵母菌種。它也可用于產生赤蘚糖醇、甘露糖醇和異丙基蘋果酸。與啤酒酵母相反，解脂亞羅威阿酵母由于能夠有效地把高分子量蛋白(堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和核糖核酸酶)分泌到生長培養基中，由此有可能回收天然狀態的異源蛋白質而無需破壞生產細胞，所以特別令人感興趣并具有特殊的意義。此外，解脂亞羅威阿酵母能分泌很少量的幾種蛋白質，因而有可能在生長培養基中產生作為主要蛋白質的所需異源蛋白質，并且簡化所述的異源蛋白質產物的回收。
解脂亞羅威阿酵母產生高水平的胞外蛋白酶，這是由解脂亞羅威阿酵母分泌的主要蛋白質。特定的蛋白酶(堿性的、酸性的或中性的)取決于所用的解脂亞羅威阿酵母菌株(Ogrydziak等，J.Gen.Microbiol.(1982)128，1225～1234)。堿性胞外蛋白酶的N-末端氨基酸順序的部分順序分析已由Ogrydziak等人作了報導(在上述引文中)。
1984年7月25日提交的共同未決專利申請634,505號，介紹了通過突變互補作用轉化解脂亞羅威阿酵母和克隆解脂亞羅威阿酵母基因的方法，公開了通過解脂亞羅威阿酵母的xpr2突變的互補作用，克隆編碼分泌的堿性蛋白酶的XPR2基因。該方法包括用在載體pLD40上的解脂亞羅威阿酵母基因庫的Bgl II部分消化產物來轉化解脂亞羅威阿酵母的宿主菌株，已在1985年4月24日公布的歐洲專利申請0138508號即上述美國專利申請的相應申請中作了介紹。
本發明提供制備載體的方法，這類載體在被引入解脂亞羅威阿酵母宿主時，使宿主能夠產生和分泌由異源DNA編碼的特異蛋白質于培養基中，這類異源DNA可以來自任何來源，但特別是來自真核DNA和合成DNA；提供重組解脂亞羅威阿酵母克隆載體，包括編碼表達哺乳動物蛋白質和其他多肽的異源DNA，其中包括適合轉化解脂亞羅威阿酵母宿主的質粒，特別是整合表達載體，包括LEU2基因啟動子、XPR2基因啟動子、堿性蛋白酶前原區(prepro region)和XPR2終止區；提供具有異源編碼順序的表達質粒，所述異源編碼順序帶有位于LEU2啟動子下游的XPR2分泌信號，使得在用所說表達質粒轉化的解脂亞羅威阿酵母中能表達和分泌異源蛋白。
本發明說明成熟異源蛋白質的表達和分泌，特別是從經過遺傳改造的解脂亞羅威阿酵母細胞培養物表達和分泌凝乳酶原和人過敏毒素C5a。解脂亞羅威阿酵母細胞外堿性蛋白酶精確氨基酸順序和DNA順序的發現使人們有可能確定，異源蛋白質可以通過重組DNA技術來表達和分泌，以供細胞培養生產。就凝乳酶原而言，表達和分泌成熟的酶原(凝乳酶的前體)。
現在已經發現解脂亞羅威阿酵母可通過重組DNA技術進行遺傳改造，使產生的轉化株能夠表達和分泌天然狀態的異源蛋白質。這可通過構建攜帶XPR2基因信號或XPR2基因信號和第一個酶原順序(pro1)或兩個酶原順序(pro1+pro2)的載體來完成，XPR2基因是與需要分泌的異源蛋白質的結構基因順序相連接的。
通過在DNA載體的XPR2位點上的整合產生的轉化株，包括一段在基因兩端喪失調節或結構成分的XPR2基因而不再產生堿性蛋白酶，這一特征不僅為異源蛋白質的分泌所需而且也能用于篩選轉化株。
此外，攜帶XPR2啟動子和編碼堿性蛋白酶分泌信號順序的順序的載體能夠在轉化的解脂亞羅威阿酵母細胞中實現分泌成熟的異源蛋白質。這種類型的有些重組DNA載體能夠實現表達/分泌，而與酵母基因組的整合位點無關。一般說來，含有足夠的5′和3′側翼DNA的載體能夠表達與整合位點無關的產物。
此外還令人驚奇和出乎意料地發現，將pBR322衍生質粒整合到解脂亞羅威阿酵母染色體DNA提供了能夠進一步促進位點特異性整合轉化的同源區，因此pBR322的整合拷貝可以作為新來的轉化DNA的“連接臺”(＂docking plat form＂)。將pBR322的駐留拷貝整合到解脂亞羅威阿酵母染色體DNA中，盡管pBR322不是天然的解脂亞羅威阿酵母DNA，然而為整合提供了一個已知的靶。包括這樣一個位點的解脂亞羅威阿酵母轉化受體在兩個主要方面能夠超過不含這樣位點的受體，即存在一個具有已知順序和已知限制圖可作為位點特異性整合的靶區；通過用pBR322作為整合的靶位可以確定插入的質粒是否含有完整的功能單位或是僅相對于所需基因的一部分的基因。例如，僅含XPR2基因3′片段的質粒就能轉化XPR2-1002受體，如果它含有野生型密碼子并在XPR2位點上整合的話。然而，同一個質粒如果被整合到pBR322中的話，也許不能把XPR2-1002宿主轉化為蛋白酶陽性的表現型，因為它缺少完整的功能單位。
因此，在解脂亞羅威阿酵母轉化株中包括一個與異源載體DNA同源的區域，所述同源區包括該解脂亞羅威阿酵母整合轉化期間作為受體位點的外源DNA。除了pBR322及其衍生物外，還有粘粒、像M13和λ一類的噬菌體、合成衍生DNA和像pUC13一類的普通質粒都可用于產生具有“連接臺”的解脂亞羅威阿酵母轉化株。
“LEU2”啟動子順序指的是位于ATG上游的上游非翻譯區，它含有進行表達所需的大多數(如果不是全部的話)特征。
“XPR2”啟動子順序指的是位于信號(或前信號)順序之前的上游非翻譯區，它是進行表達所必需的。此外，有或沒有pro順序的XPR2基因的信號，在解脂亞羅威阿酵母啟動子而不是XPR2基因的表達控制下，可用于分泌蛋白質。因此，攜帶LEU2啟動子和堿性蛋白酶分泌信號順序的載體，在已經轉化的解脂亞羅威阿酵母細胞中能成功地分泌成熟的異源蛋白質。
人過敏毒素C5a也稱為補體蛋白質C5a(人C5a)，它是體內作為補體激活作用的結果產生的具有生物活性的多肽片段。它在調節體液免疫反應和細胞免疫反應的某些方面起著免疫調節劑的作用，其一級結構和其它過敏毒素的一級結構都已清楚。它的生物學和理化特征在由H.J.Muller-Eberhard和P.A.Miescher合編的《補體》(Complement)一書中，已由Hugli作了概述(紐約Springer-Verlag出版社出版，1985年73～99頁)。
本領域專業人員都會理解，在本發明中可以采用編碼實際上任何已知氨基酸順序的異源DNA。這里所公開的方法在細節上作必要的修正后可以用來產生和分泌任何已知的異源蛋白質，其中有代表性的在1985年7月30日公布的美國專利4,532,207號中已一一列舉。此外，任何其他解脂亞羅威阿酵母分泌蛋白質基因，如核糖核酸酶和酸性蛋白酶基因，可以用來代替XPR2基因，也可以用由所述的2個或更多的基因相連的片段所組成的雜種基因，例如XPR2基因的信號順序和核糖核酸酶基因的啟動子順序結合的雜種基因來代替。
包括在本發明范圍內的還有這里所述的DNA順序或核苷酸順序的功能等同物。遺傳密碼的簡并性容許由其他的密碼子代替某些密碼子，兩者指代的是相同的氨基酸，因此產生相同的蛋白質。事實上，DNA或核苷酸順序在很大程度上是可以改變的，因為除了蛋氨酸和色氨酸外，已知的各種氨基酸都可以由一個以上的密碼子進行編碼。因此，部分或全部XPR2基因都可以人工合成，產生出與圖3的DNA順序具有明顯差別的DNA順序。但其編碼的氨基酸順序可以保持。給定的DNA或核苷酸順序這種功能上的更替提供了用融合的外來DNA順序促進分泌和/或加工所編碼的異源蛋白的機會。因此凡是因遺傳密碼所致的XPR2基因及其片段的核苷酸順序的所有變化都包括在本發明內。此外，也可能除去一些密碼子或由除了簡并碼子外的密碼子取代一個或更多的密碼子，產生結構上改變的多肽，但與由未改變的DNA分子產生的多肽相比，在實用性和活性方面基本上是相同的。所述這兩種多肽的功能都是相同的，如同兩種DNA分子產生兩種多肽，盡管所述的兩種DNA分子之間差別與遺傳密碼的簡并性無關。其最簡單的例子就是凝乳酶原A和凝乳酶原B，它們是凝乳酶原的兩種等位基因形式，其區別僅在于，在凝乳酶原A的286位上是天冬氨酸殘基，而在凝乳酶原B的286位上是甘氨酸殘基。
利用這個方法，通過應用得自解脂亞羅威阿酵母XPR2基因和/或LEU2基因的表達和分泌信號，表達和分泌哺乳動物的異源蛋白質凝乳酶原和人過敏毒素C5a已經在解脂亞羅威阿酵母中取得成功。凝乳酶原和人過敏毒素C5a的DNA順序通過合成的寡核苷酸連接到XPR2基因順序上假定為編碼堿性磷酸酶信號肽的位點或蛋白酶前體加工位點以產生基因構建體，上述兩個位點被命名為pro1和pro2，所產生的基因構建體然后經整合轉化插入到解脂亞羅威阿酵母中。重組培養物表達具有凝乳酶原和人過敏毒素C5a的分子量和免疫反應活性的異源蛋白質并輸出到生長培養基中。如此產生的凝乳酶原可以認為是其天然構型的折疊形式，因為除去前肽后它具有完全的酶活性。
此處所用的“重組DNA材料”一詞包括含有至少下列材料之一的任何材料解脂亞羅威阿酵母的XPR2基因、信號(或前信號)、por1和pro2(共同構成pro區)、啟動子或其終止順序；LEU2啟動子；以及可能由于遺傳密碼的簡并性所產生的功能與上述順序相同的順序。所述重組DNA材料中具有代表性的材料為DNA片段、質粒或載體，或含有上述順序中任一個或者全部順序的轉化株。
材料New England Biolabs供給的限制性核酸內切酶和T4連接酶，Bethesda Research Laboratories供給的細菌堿性磷酸酶，PL-biochemicals供給的T4多核苷酸激酶，和New EnglandNuclear供給的[γ-32P]ATP。所有的酶都是在提供者所推薦的條件下使用的。
培養基GPP培養基-(甘油/ -蛋白胨培養基)，(每升)含有6.7克甘油、1.6克Difco -蛋白胨、1.7克不含氨基酸和硫酸銨的Difco酵母含氮堿基化合物、30毫克尿嘧啶、和0.5毫升/升分子量為2000的聚丙二醇(Polysciences)溶于40mM磷酸緩沖液(pH6.8)。(聚丙二醇為進行凝乳酶分析進行培養時省略不用)。 -蛋白胨在磷酸緩沖液中單獨進行高壓滅菌。YEPD(酵母提取物/蛋白胨/右旋糖培養基)，(每升)含有5克酵母提取物、10克蛋白胨和20克右旋糖。
大腸桿菌生長在37℃的LB培養基中。LB培養基(每升)含有10克細菌胰酶解蛋白胨(Bactotryptone)、10克細菌酵母提取物、10克氯化鈉；用氫氧化鈉將pH調至7.5。
DNA順序分析這里所描述的來自各種質粒的DNA片段都是在聚丙烯酰胺凝膠上進行分離并用Maxam等人的方法(Methods inEnzymology，65，499(1980))測序。
連接方法DNA片段，包括被切割的載體質粒，都是用T4 DNA連接酶通過混合所需要的組分進行連接(帶有適宜的構建末端的DNA片段以提供正確的配對)。微克量的載體和插入片段需加約10單位的連接酶。將所得的連接反應物轉化到大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC-33625)或HB101(ATCC-33694)的感受態細胞中。
化學合成DNA的制備為構建用于表達和分泌凝乳酶的雜種基因，用改進的Phosphoramidite方法(Sinha等，Tetrahedron Letters24，5843(1983))通過Genetic Design 6500(Watertown，MA)DNA自動合成儀合成8個寡核苷酸，并且從6M尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠中進行純化。將互補寡核苷酸的等分部分在TE(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM NaEDTA)中在4℃條件下互相混合和退火過夜。雙股寡核苷酸的等分部分(約2微克)在37℃下用T4多核苷酸激酶在反應混合物中進行磷酸化，該反應混合物20μl含有70mM Tris(pH7.6)、10mM氯化鎂、5mM二硫蘇糖醇、5mM ATP。
質粒DNA制備質粒DNA的大量制備采用Holmes等人的方法(Anal.Biochem.，114，195～197(1981))，然后用溴乙錠-氯化銫浮力密度梯度離心。質粒DNA的小量制備采用Birnooim等人的堿性SDS方法(NAR1，1513(1979))。
凝乳酶原的表達/分泌載體的構建進行一系列不同的構建體的制備是為了獲得最終表達載體。所有各個步驟都在附圖中予以說明。一般說來，DNA片段是用凝膠電泳分離，并與另一些片段，或者被切割的DNA質粒，于4℃的20微升50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化鎂、20mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和200單位的T4連接酶中進行連接。如果需要用限制性核酸內切酶進行DNA的部分消化，則需要通過實驗確定最佳的切割時間。
培養液中凝乳酶原的鑒定含有表達載體的酵母轉化株在GPP培養基(同上)中生長過夜。離心去除酵母細胞后，將1毫升的50％TCA加到每個5毫升等分的培養液中，在4℃下保持60分鐘。離心得到沉淀，再用2毫升冷丙酮洗兩次。將沉淀的蛋白質溶于100微升的SDS樣品緩沖液，等分部分在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳(Laemmli，U.K.，(1970)Nature227，680)。凝膠分辨的蛋白質通過電泳轉移到硝化纖維素(Schleicher和Schuell，0.22微米)，用凝膠片經免疫印跡分析法(Hawkes，R.等，(1982)Anal.Biochem.119，142)進行凝乳酶原的鑒定。濾紙涂上家兔抗凝乳酶原抗體，然后與結合羊抗兔IgG抗體的過氧化物酶(Cappel，Malvern，Pa)保溫。結合抗體用4-氯-1-萘酚和過氧化氫染色檢測。
培養液中凝乳酶原的凝乳活性各種解脂亞羅威阿酵母轉化株的培養液按照Ernstrom改進方法(J.Dairy Sci.41，1664(1958))測定凝乳活性。簡言之，測定包括測量凝乳酶在活化的培養上清液中凝結緩沖過的脫脂乳所需的時間長度并與純化凝乳酶標準物比較這些數值。酵母培養物(25毫升)在GPP培養基中生長過夜。離心后去除細胞，將5毫升培養上清液的等分部分在真空條件下冷凍干燥。把每份經冷凍干燥的上清液再懸浮于300微升蒸餾水中。還要制備一組純化的牛犢凝乳酶原稀釋液作為對照參考標準。在培養基中和對照條件下的凝乳酶原的活化是通過加入大約5～10微升的濃鹽酸，使pH值達到大約2左右，在22℃下保溫1小時。脫脂乳的制備是將60克干燥的脫脂奶粉(Difco)加到500毫升的41.5mM醋酸鈉(pH6.3)和13.6mM氯化鈣中，在4℃條件下攪拌20分鐘。制備后立即進行底物測定。將每個制備的酶以60微升為一等分(相當于1毫升的培養上清液)，在37℃下加到1毫升等分的脫脂乳中，記錄凝結時間。
用于C5a基因的合成寡核苷酸的制備用于C5a結構基因合成的寡脫氧核苷酸的化學制備是采用改進的Phosphoramidite方法(Sinha等，在上述引文中)在一個DNA自動合成儀Genetic Design6500(Watertown，MA)上用可控多孔玻璃載體進行的。用3％(重量/體積)二氯乙酸的二氯甲烷溶液進行脫三苯甲基作用，用飽和四唑的乙腈溶液加以Phosphoramidites線性激活，以二乙氧基膦四唑化物封端，用含水碘/THF氧化(Matteucci等，1981，J.Amer.Chem.Soc.105，3183)。每個加入周期的總時間是14分鐘。得到圖9中的10個47聚體A-J片段，每個步驟的平均得率為98.8％(用三苯甲基分析)，用Matteucci等人(在上述引文中)的方法解封，從0.3M醋酸鈉中經乙醇沉淀出并在退火前先在10％聚丙烯酰胺-尿素變性凝膠上用制備性凝膠電泳進行分離。
人C5a基因的組裝、克隆和順序測定圖9表示所需蛋白質的氨基酸順序和制備編碼人C5a蛋白質的基因所需的合成寡核苷酸的排列。除A和F外的所有低聚物，都是在它們的5′末端用T4多核苷酸激酶進行磷酸化。基因的組裝包括退火和連接兩個主要反應，兩個反應含有低聚物A、B、I和J，以及低聚物C、D、E、F、G和H。最終得到的94堿基對和141堿基對雙股DNA片段都是在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳后進行分離，相互共同連接，他們的235堿基對產物用凝膠電泳分離。含有編碼C5a的結構基因的235堿基對DNA片段插在pBR322 DNA載體的EcoRI和Hind III兩個位點之間并轉化大腸桿菌K-12菌株HB101感受態細胞。從6個轉化株分離得到的DNA質粒的限制性酶切分析表明6個克隆中有5個含有大小合適的EcoRI/Hind III片段。這些質粒中每個質粒的C5a基因區的核苷酸順序都用Maxam等人的方法(Methods Enzymol.65，499(1980))測定。
用于大腸桿菌的C5a表達質粒的構建和特性鑒定DNA片段分離的方法和連接反應的條件采用1982年Maniatis等發表的方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor)。大腸桿菌trp啟動子-操縱子，開始是從ptrpL1得到的(Edman等，(1981)Nature 291，503)，含有用于C5a表達質粒(pC5a-48)的trp啟動子-操縱子順序的360堿基對EcoRI片段，是由凝乳酶原表達質粒pPFZ-R2中分離得到的，關于這一點在1985年7月3日公布的歐洲專利申請0147178號中已作了介紹。
解脂亞羅威阿酵母培養液中C5a的鑒定除了羊抗C5a和兔抗羊免疫球蛋白G(Cappel)用于免疫印跡外，采用如上介紹的鑒定凝乳酶原方法。羊抗人C5a抗體的制備采用Manderino等人的方法(J.Immunol.Methods 53，41-50(1982))。
載體pLD40已在1985年4月24日公布的歐洲專利申請0138508號中作了介紹。微生物名稱ATCC 20774(CCTCC 86-142)解脂亞羅威阿酵母 PC30869ATCC 20781(CCTCC 86-149)解脂亞羅威阿酵母 DL112-PC-30869，帶XPR2的轉化株ATCC 20776(CCTCC 86-144)解脂亞羅威阿酵母 DL-148。
解脂亞羅威阿酵母 ATCC20688(CCTCC 86-152)的轉化株，帶由SnaBI消化的pLS-3ATCC 20775(CCTCC 86-143)解脂亞羅威阿酵母 DL-144。
解脂亞羅威阿酵母 ATCC20688(CCTCC 86-152)的轉化株，帶未切割的pLS-3ATCC 20777(CCTCC 86-145)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉化株，帶由SnaBI切割的pC5aX-3ATCC 20778(CCTCC 86-146)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉化株，帶由SnaBI消化的pXX-11ATCC 20779(CCTCC 86-147)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉化株，帶由SnaBI切割的pXX-22ATCC 20780(CCTCC 86-148)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉化株，帶由SnaBI切割的pXX-33ATCC 20794(CCTCC 86-150)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉化株，帶pLD56ATCC 20795(CCTCC 86-151)解脂亞羅威阿酵母ATCC 20794(CCTCC 86-150)的轉化株，帶由NruI切割的pLX-34上述載體根據布達佩斯條約的規定都保藏在美國馬里蘭州洛克維爾美國典型培養物保藏中心，這是一個公認的承擔永久性保存樣品的保藏機構。如果本申請被授予專利，該中心將隨時準備接待公眾。在本申請未決期間，這些樣品可以提供給美國專利和商標局授權去那里的官員進行測定，項目編號為37CFR1.14和35USC122；根據外國專利法，在向這些國家提交過本申請副本或其成果的，也可以使用這些樣品。由于授予了專利，對于公眾利用所保藏的微生物的全部限制措施將不可避免地予以撤消。
解脂亞羅威阿酵母ATCC20774(CCTCC 86-142)(Pfizer公司培養物保藏所鑒定編號為PC30869)的分類學研究是由J.R.DeZeeuw博士負責的，他提供了下述說明。所用的方法是由J.L.Eodder在《酵母菌》(第二版)(N.Holland Publishing Co.，
Amsterdam，1970)一書中推薦的那些方法。
CBS599是解脂假絲酵母典型培養物(《酵母菌》，第二版，N.Holland Publishing Co.，Amsterdam，1970)，CBS6124在《酵母菌》(第三版)一書中是解脂復膜孢子酵母的典型培養物，對兩者進行了比較。較早還稱為解脂擬內孢霉。其無性狀態是解脂假絲酵母。確定這個種的分類學地位的是van der Walt和von Arx(Antonie vanLeeuwenhoek，46，517～512(1980))。現時較佳的名稱為解脂亞羅威阿酵母。
菌株PC-30869的培養、形態和生理特征與由Kreger-van Rij編的《酵母菌》(第三版，第406～408頁，Elsevier Science PublishersB.V.，Amsterdam，1984)一書中所列的解脂復膜孢子酵母的規范介紹是一致的。
表1 解脂亞羅威阿酵母菌株的比較Pfizer公司資料來源 基因型登記號PC-30265NRRL YB-423(即CBS 6124)， 野生型，二倍體《酵母菌》(第三版)中的典型培養物PC-30286CBS 599，《酵母菌》MATA野生型，單倍(第二版)中的典型 體培養物PC-30869參閱下面的介紹 MATB bio-6，leu2-40，xpr2-1002PC-30869是由遺傳上適于重組的解脂亞羅威阿酵母PC-22208的突變體構建的，解脂亞羅威阿酵母PC-22208是由Pfizer公司從土壤中分離的，解脂亞羅威阿酵母PC-30026則是NRRL Y-1094的次代培養物。PC-30869在表型上與其野生型親代的差異在于①不產生具有活性的胞外堿性蛋白酶；②生長需要生物素；③要求L-亮氨酸作為營養來源。
PC-30869在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YEPD)培養基中的對數期生長期間，芽細胞呈卵圓形，平均大小為2.6×5.5微米。在YEPD瓊脂上，真假菌絲體都突起，有胚泡孢子，兩側大多數為單個的。沒有明顯的類胡蘿卜素色素。該物是作為“B”交配型單倍體與測定微生物種的有權堿性的測交品系進行雜交(表5)。典型的子囊孢子的形成是V8瓊脂上進行觀察的。碳同化的模式見附表2。沒有進行發酵試驗。銨離子和尿素(無硝酸鹽)是可以被利用的唯一氮源(表3)。菌株PC-30869要求維生素B1和D-生物素(表4)。只有維生素B1是該培養物的野生型親本所需要的。在37℃下未看到生長。
表2碳同化作用*碳 源 參考列表介紹** 培養物3026530286 308691.L-阿拉伯糖 - -- -2.纖維二糖- -- -3.赤蘚醇 + +++ ++++++4.D-半乳糖- -- -5.D-葡萄糖- +++ ++++++6.肌醇- -- -7.乳糖- -- -8.麥芽糖 - -- -9.D-甘露糖醇 + +++ ++++++10.棉子糖 - -- -11.核糖醇 - -- -12.D-核糖 -(+) -- ++13.L-鼠李糖 - -- -14.可溶性淀粉 - -- -15.蔗糖 - -- -16.海藻糖 - -- -17.D-木糖 - -- -18.琥珀酸 + +++ ++++++19.檸檬酸 + +++ ++++++*基礎培養基是細菌酵母氮基質補加10微克/升的D生物素和149毫克/升的L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽，以提供100毫克/升的L-亮氨酸。
**Kreger-van Rij.(在上述引文中)。
表3 氮同化作用*氮源 參考列表介紹** 培 養 物3026530286 308691.(NH4)2SO4+ +++ ++++++2.KNO3- -- -3.尿素 + +++ ++++++*基礎培養基是細菌酵母碳基質補加116毫克/升的酮異己酸鈉，以提供對應的100毫克/升的L-亮氨酸，再補加10微克/升的D-生物素。
**Kreger-van Rij.(在上述引文中)表4 需要的維生素*補加內容***參考結論** 培 養 物30265 30286 308691.缺 -極微 極微 -2.維生素B1.HCl+++++++-3.D-生物素-極微 極微 極微4.維生素B1+++++++++++生物素*基礎培養基是無細菌維生素酵母基質加149毫克/升的L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽，以提供100毫克/升的L-亮氨酸。
**Kreger-van Rij.(在上述引文中)。
***如所述基礎培養基再補加200微克/升維生素B1。HCl和/或10微克/升的D-生物素。
表5 子囊孢子的形成測交菌株交配培養物30265 30286 30869缺號(自交配培養物) ++ - -30264 (A交配型)++ - +++30267 (B交配型)++ +++ -①培養物30264和30267是由L.J.Wickerham博士惠供的異性交配型單倍體菌株，已在Science(167，141(1970))上作了正式介紹。
②30264是Wickerham的解脂亞羅威阿酵母YB-421③30267是Wickerham的解脂亞羅威阿酵母YB-423-12表6 其他特征參考數據* 培養物30265 30286 30869細胞形狀卵圓形 卵圓形卵圓形卵圓形細胞的平均體積(微米)(2～4.5)×(4-22) 3.3×9.1 3.0×8.2 2.6×5.5營養繁殖芽殖 芽殖 芽殖 芽殖發酵缺 缺 缺 缺37℃時生長 不生長 不生長 不生長 不生長菌落生長三個培養物生長相似并與文獻介紹一致。真假菌絲體都突起，有胚孢子，兩側大多數是單個的。沒有明顯的類胡蘿卜素色素。*Kreger-van Rij.(在上述引文中)。
PC-30689不同于專利文獻所介紹的解脂亞羅威阿酵母的其他菌株，是基于將其表型進行比較的結果(表7和8)。
ATCC20228(Nubel等，美國專利4,155,811)的特征在于具有像這個種的典型菌株CBS599和CBS6124的野生型營養。尤其是它不需要尿嘧啶、亮氨酸或為生長用的生物素，以及使明膠液化。
ATCC 20628(DeZeeuw等，美國專利4,407,953)不像ATCC20228需要補加生長用的亮氨酸。像ATCC20228一樣，它也不需要尿嘧啶或生物素。它也液化明膠。
ATCC20688(CCTCC 86-152)(歐洲專利申請0138508)即使培養基中補加了尿嘧啶和亮氨酸，也只是僅僅能夠生長。這種對尿嘧啶的需要就使ATCC20688(CCTCC 86-152)跟ATCC20228和ATCC20628得以區別。ATC C20688(CCTCC 86-152)不需要生物素，而能使明膠液化。
培養物PC-30869不同于上述所有菌株，它需要生物素和亮氨酸，但不需要生長用的尿嘧啶，它也不能使明膠液化。
表7 營養要求從所列培養基中去掉的營養物培養物 無亮氨酸 尿嘧啶 生物素CBS599 +++++++++ +++CBS6124 +++++++++ +++ATCC20228 +++++++++ +++ATCC20628 +++- +++ +++ATCC20688(CCTCC 86-152) +++- - +++PC-30869+++- +++ -完全培養基含有16.7克/升的無細菌維生素酵母基質加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L-亮氨酸、10微克/升的D-生物素，和200微克/升的維生素B1鹽酸鹽。
表8 明膠液化作用培養物液化作用CBS599+CBS6124 +ATCC20228 +ATCC20628 +ATCC20688(CCTCC 86-152) +PC-30869 -培養基含有120克/升的明膠、16.7克/升的無細菌維生素酵母基質加100毫克/升的尿嘧啶 、100毫克/升的L-亮氨酸、10微克/升的D-生物素和200微克/升的維生素B1鹽酸鹽。


圖1由解脂亞羅威阿酵母菌株DL112分離得到的重疊質粒pLD57、pLD58和pLD62的部分線性限制圖。*即圖1是關于從XPR2轉化株DL112回收質粒的圖解說明。各個標記區是(從左到右)解脂亞羅威阿酵母未排列成順序，EcoRI部位與連接解脂亞羅威阿酵母DNA(以前為BamHI部位)之間的小片段pBR322，解脂亞羅威阿酵母LEU 2基因，pBR322的大片段和排列成順序的XPR2的突變等位基因。“B”是BglII部位，“E”是EcoRI部位。用線條表示回收的3個質粒它們在BglII部位的末端連接成環形分子。
圖2為XPR2基因合成寡核苷酸探針。從已經發表的成熟蛋白酶的前25個氨基酸殘基中大多數殘基的順序(Ogsydziak等，在上述引文中)，標有I和II的兩個區為構建32倍或不足32倍簡并的14聚體寡核苷酸探針提供了可能性。兩個區分別在7和18位氨基酸起始。為每個區制備了4個不同的8倍簡并的混合探針并指定了圖中所示的170～186之間的編號。在所示的預期核酸順序中，“X”表示所有四種堿基，U表示兩種嘌呤，Y表示兩種嘧啶。
圖3 XPR2基因的核苷酸順序啟動子、pre(-157～-136)，pro1(-135～-98)，pro2(-97～-1)，堿性細胞外蛋白酶和終止順序。
圖4構建終止密碼子載體pterm4的順序。
圖5構建質粒pLS-3的順序和限制性圖。
圖6構建質粒pXX-33的順序和限制性圖。
圖7構建質粒pXX-22的順序和限制性圖。
圖8構建質粒pXX-11的順序和限制性圖。
圖9人過敏毒素C5a氨基酸順序。
圖10質粒pC5a-48的限制性圖。
圖11構建質粒pC5aX-3的順序和限制性圖。
圖12LEU2基因的核苷酸順序。
圖13構建質粒pLX-34的順序和限制圖。
XPR2基因的順序分析克隆的XPR2基因的DNA順序分析是用化學降解法(Maxam等，1980，Methods Enzymol.65，499)在由質粒pLD57、pLD58、pLD62(圖1)和pLD84、pLD86(參閱下面所述)制備的重疊限制性片段上完成的。結果表明克隆的酵母基因組DNA實際上含有胞外堿性蛋白酶的基因。XPR2基因的核苷酸順序和由核苷酸順序推測的帶有信號順序的堿性蛋白酶前體的氨基酸順序在圖3中給出。胞外蛋白酶的氨基酸順序中的大部分順序過去都是未知的(Ogrydziak等，在上述引文中)，這里是第一次提出。此外，需要胞外蛋白酶表達和分泌的順序這里也是第一次予以介紹。編碼堿性蛋白酶、它的前體和信號順序的DNA順序由1362堿基對組成(圖3)。這些多肽鏈的一級結構是由核苷酸順序推斷得到的，共有454個氨基酸殘基。堿性蛋白酶是以前體的形式在細胞內合成的，這種前體形式經過蛋白水解加工形成被分泌的狀態或成熟狀態。分析由核苷酸順序推斷得到的氨基末端氨基酸順序表明假定的信號肽存在于前體分子中。所述信號肽含有22個氨基酸殘基，其結構特點類似于高等真核生物和原核生物信號肽的結構(Perlman等，1983，J.Mol.Biol.167，391)。通常與已知的成熟堿性蛋白酶(Ogrydziak等，1982，J.Gen.Microbiol.128，1225)的25個氨基末端氨基酸相一致的所指示的氨基酸順序中的一個區之前是含有信號肽和2個胰蛋白酶型的切割位點(Lys-Arg)的157個氨基酸殘基。用所述切割位點把pro區分為pro1(-135～-98)和pro2(-97～-1)，參見圖3。成熟堿性蛋白酶有由核苷酸推斷出的297個氨基酸。預示來自核苷酸順序的各種蛋白酶形式的氨基酸順序是與純化形式的酶的大小一致的。除了堿性蛋白酶前體結構順序外，還測定了5′端側翼順序片段大約700堿基對和3′端側翼順序的600堿基對。這些區的分析，說明它們含有類似于其他真核啟動子和終止密碼子的順序，而且對堿性蛋白酶的表達來說多半是不可缺少的。
如上所述，轉化解脂亞羅威阿酵母的方法和通過突變的互補作用克隆解脂亞羅威阿酵母基因的方法，包括通過xpr2突變的互補作用克隆編碼分泌的堿性蛋白酶的XPR 2基因，已在歐洲專利0138508中作了報導。該報導中所述方法包括通過用Bgl II部分消化載體pLD40中的解脂亞羅威阿酵母基因庫后轉化解脂亞羅威阿酵母宿主菌株，所述載體的特征是它攜有含有解脂亞羅威阿酵母LEU2區的小片段和3個EcoR I、4個EcoR V、6個Ava I、1個Bgl II、1個Nco I、1個ApaI、2個Xho I和1個BstXI核酸內切酶的限制性位點。解脂亞羅威阿酵母XPR2轉化株中的一個轉化株用來回收來自解脂亞羅威阿酵母NRRL Y-1094中的野生型基因(pLD84和pLD86)，解脂亞羅威阿酵母NRRL Y-1094如實施例一所述供表達/分泌載體構建時用。
LEU2基因的順序分析pLD25(歐洲專利0138508)中克隆的LEU2基因的DNA順序分析是在重疊限制性片段上用化學降解法(Maxam等，1980，Methods Enzymol.65，499)測定的。為了對β-異丙基蘋果酸(IPM)脫氫酶密碼區和恰當的閱讀框架進行定位，利用了以前測定的啤酒酵母LEU2基因所示的氨基酸順序(Andreadis等，1984，J.Biol.Chem.259，8059)。鑒定出了解脂亞羅威阿酵母基因組順序區，該基因組順序編碼同源于啤酒酵母蛋白質順序區的氨基酸順序。2.8Kb LEU2基因的核苷酸順序和由核苷酸順序推斷得到的β-IPM脫氫酶氨基酸順序在圖12中給出。此外，表達解脂亞羅威阿酵母β-IPM脫氫酶需要的順序這里是第一次予以介紹。編碼這405個氨基酸蛋白質的DNA順序是由1215堿基對組成的(圖12)。除了β-IPM脫氫酶編碼順序外，測定了5′端順序的大約798堿基對和3′端順序的797堿基對(包括TAA轉譯終止密碼子)。對這些區的分析表明它們包括類似于其他真核生物的啟動子和終止密碼子的順序，而且是表達時必不可少的。
解脂亞羅威阿酵母LEU2基因的5′上游區在轉譯起點前78堿基對和在所說mRNA起點前30堿基對含有TATATATA順序。對于真核生物中轉錄的啟始具有重要意義的第2個順序是CAAT盒，在LEU2基因中，這部分順序定位在假定的轉錄起始位點前74堿基對，假定的轉錄起始位點自ATG起-48堿基對(圖12)。
Zaret等(Cell 28，563(1982))認為3′下游區在終止密碼(TAA)之后的72至120核苷酸上有一段順序與5′-TAG…TA(T)GT…TTT-3′順序同源，這對啤酒酵母中的轉錄終止很重要。
實施例一所用宿主菌株是ATCC 20774(CCTCC 86-142)(MATBleu2-40 bio-6 xpr 2-1002)。XPR2轉化株-解脂亞羅威阿酵母ATCC 0781是在脫脂乳指示平板上形成區帶的一個菌落，然后從缺亮氨酸平板上進行平板影印培養。用歐洲專利申請0138508中的方法從轉化株中制備染色體DNA并用來回收被分泌的蛋白酶的基因。染色體DNA用Bgl II酶進行部分消化，并連接到含有大腸桿菌復制子和來自載體的氨芐菁霉素抗性基因的環化片段上，用以轉化大腸桿菌。染色體DNA也用Sal I酶消化并用于在Southern實驗中指示轉化株正常LEU2區未曾受到干擾。(LEU2區的Sal I到EcoR I間的520bp片段即是包含于pLD40中的5′至LEU2片段間的順序用作探針)。為此，由于同源性對于把質粒庫整合到解脂亞羅威阿酵母中是必需的，所以XPR2區肯定是整合位點。三個重疊但不同的質粒pLD57、pLD58和pLD62開始是從解脂亞羅威阿酵母ATCC 20781(CCTCC 86-149)回收的。它們在圖1中給出。與基于已知的成熟分泌性蛋白酶蛋白質的前25個氨基酸殘基順序(圖2和3)合成的針對XPR2基因的合成寡核苷酸探針雜交表明分泌性蛋白酶的基因已被克隆。為了測定回收的基因是代表野生型拷貝還是突變型拷貝，用pLD58轉化受體解脂亞羅威阿酵母菌株。由于沒有從任何依賴于亮氨酸的轉化株產生蛋白酶陽性轉化株，所以結論是pLD58含有該基因的等位基因突變。
存在于野生型菌株NRRL Y-1094中的XPR2基因形式是通過大腸桿菌菌落的雜交試驗得到的。探針用的是由測序數據預計含有整個結構基因的2Kb Pvu I-EcoR I片段。正如歐洲專利申請0138508所介紹的，從pLD 40中NRRL Y-1094 DNA的Sau 3A部分消化的片段的原始庫中，獲得與本探針雜交的一些克隆。其中兩個克隆含有非常相似于被命名為pLD 84和pLD 86的質粒，他們被用來構建表達載體。兩種質粒含有相同的XPR2密碼子的5′末端即Sau3A位點(被結合重新產生載體的BamH I位點)，圖3中的順序就是從此開始的。每個都含有蛋白酶的全部結構基因和假定的轉錄終止密碼子，并且包括來自NRRL Y-1094菌株的XPR2密碼子大約4至5Kb的整個插入片段。pLD 86中的插入片段3′端含有額外的幾百堿基對。為了構建表達載體，我們用的是3′擴展到Bgl II位點的順序(堿基對2655)，所以兩個質粒供應了相同的DNA，其作用是與圖3的順序相等的。
表達/分泌載體的構建為了實現表達和分泌解脂亞羅威阿酵母中的凝乳酶原而設計的一個計劃采用在整合性克隆載體中的各種雜交基因的構建體。這樣一個途徑創造出幾個具有廣泛的共同DNA順序區域的不同的質粒。事實上，用于組裝質粒的標準構建方案是用凝乳酶原基因插入到所示的XPR2信號肽加工位點假定的pro1加工位點和已知能產生成熟堿性蛋白酶的裂解位點的3′端。一般說來對異源基因而言，理想的是插在用于表達的酵母啟動子和終止順序之間。已認識到雜交基因順序的氨基末端順序部分隨著不同的質粒構建體而變化，但是凝乳酶原結構基因順序、XPR2終止密碼子順序和穿梭載體DNA在各個表達質粒構建體中則是相同的。于是計劃把相同的凝乳酶原結構基因片段和終止密碼子/載體質粒用于如下所述的各個表達質粒構建中。不同的凝乳酶原表達/分泌質粒構建體在緊接著XPR2基因啟動子順序下游的N末端堿性蛋白酶前體順序的長度范圍內有所變化，所說的前體順序在凝乳酶原基因順序之前。為此，在XPR2凝乳酶原接合區內，把各個表達質粒的啟動子片段的組分設計成可變的順序。所有表達/分泌載體都用含有三個組成片段的相似的連接反應進行組裝。
用于構建終止密碼子載體pterm4的實驗步驟見圖4所示。首先將合成連接子與含有XPR2基因3′末端的片段連接，后者包括轉錄終止和多聚腺苷酸化信號。簡單地說，用核酸內切酶Kpn I切割質粒pLD 84，再用合成連接子雙股DNA連接(圖4)。用核酸內切酶Hind III和Bgl II切割連接產物并將一個760堿基對片段插入到用相同的兩個核酸內切酶進行線性化的質粒pLD 41中，得到pterm4。質粒pterm4用它的限制制性圖來鑒定。對用EcoR V、EcoR I、KpnI、Bgl II-Hind III和Bgl II-Bcl I等一系列限制性核酸內切酶消化的結果進行分析。消化提供了合適的片段，證明在如歐洲專利0138508所述的穿梭質粒pLD41中存在著合成連接子和XPR2基因的“完整”3′末端。圖4給出了這個7.3Kb終止密碼子載體的部分圖。
表達/分泌質粒pLS-3的構建圖5概述了用于解脂亞羅威阿酵母中分泌凝乳酶原的起始質粒的構建。其限制性圖在圖5中給出。凝乳酶原分泌質粒的構建是從制備含有大部分凝乳酶原結構基因順序的片段著手的。從大腸桿菌凝乳酶原表達質粒pPFZ-84A中分離出含有編碼凝乳酶原的6-365殘基密碼順序的1080堿基對BclI-BamH I(部分)DNA片段。(質粒pPFZ-84A是凝乳酶原表達質粒pPFZ-R2的衍生物，它的構建在1985年7月3日公布的歐洲專利申請0147178號中已作了介紹，并且已用限制性片段置換法通過合成寡核苷酸指導的誘變制成。具體地說，pPFZ-84A不同于pPFZ-R2僅有兩處，即在凝乳酶原氨基酸殘基214(天冬酰胺→天冬氨酸)286(天冬氨酸→甘氨酸)兩個堿基對，從而編碼所謂的凝乳酶原A等位基因，但兩個質粒都含有凝乳酶原的理想順序并且在這個實施例中作用是相等的)。含有編碼堿性蛋白酶前體和凝乳酶原1至5的密碼順序的XPR2啟動子組成片段按下述方法制備。從XPR2亞克隆質粒pLD 90分離出含有啟動子區和堿性蛋白酶基因5′末端的870堿基對Hind III-Ava I DNA片段，它與具有下述結構的人工合成片段連接5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTG 5′譯讀方向——→這個順序含有Ava I粘性末端，然后是對堿性蛋白酶前肽的最后9個密碼子進行編碼的順序，接著對凝乳酶原的前4個氨基酸進行編碼的，最后在BamH I位點終止。啟動子組成片段是通過標準連接反應，借助T4連接酶將人工合成片段和870bp Hind III-Ava I片段連接后再用Hind III和BamH I切割而得到的。最后得到的連接順序通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純化，選出916堿基對HindIII-BamH I DNA片段。如上所述，雜交基因的3′末端是由終止密碼子/載體質粒pterm4得到的。質粒pterm4用Hind III-Bcl I消化，并從瓊脂糖凝膠中分離出大約7.3Kb Hind III-Bcl I終止密碼子/載體DNA片段，該片段含有XPR2終止密碼子、LEU2可選擇標記物和pBR322。
凝乳酶原表達/分泌質粒pLD-3通過對3個組成DNA片段(用Hind III-Bcl I切割的pterm4質粒、以及916堿基對HindIII-BamH I啟動子和1080堿基對BamH I-Bcl I凝乳酶原基因的片段)的保溫而結合在一起，構建如上所述有連接酶T4參加(見圖5)。連接的混合物采用Dagert等人(Gene 6，23-28(1979))的氯化鈣方法轉化大腸桿菌K12菌株MM294。從選擇出的氨芐菁霉素抗性轉化株中分離質粒，質粒pLS-3用其限制性圖進行鑒定(圖6A)。這個質粒的XPR2-凝乳酶區經測序，肯定為人工合成DNA的適合順序和理想片段的恰當的結合。
pLD 90的制備。這種質粒含有源自pLD84的亞克隆。如下所述，將自XPR2啟動子區的Pvu I位點至終止 區的EcoR I位點的DNA區亞克隆到pBR322的Hind III位點。用上述的兩個限制性酶消化幾微克pLD84。然后，被消化的DNA分子的“粘性”末端用DNA聚合酶I的克列諾夫(Klenow)片段填平。將激酶處理過的HindIII連接子(由New England Biolabs供應的CAAGCTTG)用T4 DNA連接酶加到末端。去除多余的連接子，用Hind III酶進行連續消化，形成Hind III粘性末端。將DNA分子的混合物在制備性瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的2Kb帶，進行純化，與經Hind III消化過的并經細菌堿性磷酸酶處理過的載體pBR322一起加到連接反應中。連接混合物用于轉化感受態大腸桿菌。帶有靠近pBR322的EcoR I位點的XPR2終止密碼子的EcoR I位點的方向取名為pLD90，相反方向的則取名為pLD91。
包括在pLS-3中的XPR2啟動子區的5′末端是PvuI位點，大約是從圖3所列順序區開始起的280堿基對。發現含有野生型蛋白酶基因的質粒在這樣大量啟動子控制下，當被整合到基因組在遠離固有的xpr2座位的位點時，不能使轉化株產生大量的蛋白酶(在脫脂乳平板上的透明區作出的鑒定)。
我們注意到，如果pLS-3含有縮短的因而是“有缺陷”的啟動子，那么從質粒與固有的野生型XPR2基因重組的整合結果，產生完整的啟動子，它控制凝乳酶原融合產物的表達，但有缺陷的啟動子則是控制蛋白酶的表達。類似基因破碎型的試驗是用Shortle等人(Science 217371～373，1982)的啤酒酵母活性基因來完成的。與我們的預料相一致的是，有些帶有pLS-3不依賴亮氨酸的轉化株，現在知道實際上就是有缺陷的蛋白酶。有缺陷的蛋白酶轉化株與不希望要的副產品如在leu2上的基因轉化株相比，更可能是所需要的在XPR2座位上的整合株。關于受體菌株ATCC20688(CCTCC 86-152)，我們發現未切割的pLS-3產生6.5％蛋白酶缺陷的轉化株，反之，用Sna BI切割的質粒所產生的蛋白酶缺陷的轉化株約為70％。就這種轉化而言，基因破碎都可回避為了從所有轉化株中證實合適的整合而需要進行大量的Southern印跡試驗。
含有在XPR2啟動子控制下的野生型蛋白酶結構基因的質粒(位于圖3所列順序的起始處)，當其被整合到解脂亞羅威阿酵母細胞除xpr2座位外的位點上時，可以表達大量的蛋白酶。可是，從這類整合株中有效地表達異源基因可能要求進一步改進這個控制區DNA。
凝乳酶原的分泌用未切割pLS-3 DNA和用SnaB I消化的pLS-3 DNA轉化解脂亞羅威阿酵母菌株ATCC20688(CCTCC86-152)，可分別獲得xpr-leu+轉化株ATCC20775(CCTCC86-143)(DL144)和ATCC20776(CCTCC 86-144)(DL148)。將這些轉化菌株接種到含有YEPD培養基的試管中。細胞在28℃下生長過夜。將這些培養物的等分試樣(250微升)以1∶100稀釋到每份為25毫升的GPP培養基中。在28℃下細胞在搖瓶中生長16～18小時，測得600nm處吸光率為5.0-7.0，然后經離心收獲細胞，通過濃縮上清液并將濃縮物進行SDS-PAGE，測定所得到的培養液或上清液中的凝乳酶原。通過電泳把板狀凝膠轉移到硝化纖維素紙上，電泳在20mM Tris堿、150mM甘氨酸、20％甲醇存在下以，500毫安在4℃下進行2小時。板狀凝膠中移出的蛋白質是用考馬斯藍染色來鑒定的。
硝酸纖維素紙在37℃下干燥，在65℃烘烤1小時，然后在TBS(200mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5)中漂洗。將硝酸纖維素紙置于含有10％馬血清(Gibco，Chagrin Falls，餓亥餓)的TBS中，在室溫下保溫30分鐘，然后在含有10％馬血清和經適當稀釋的凝乳酶原抗體的TBS中在室溫條件下保溫16小時。再將硝酸纖維素紙放在TBS中漂洗三次，10分鐘，接著在含有10％馬血清的TBS中保溫，然后在含有10％馬血清和經適當稀釋的結合了辣限過氧化物酶的羊抗兔IgG抗體的TBS中保溫2小時。再將硝化纖維素紙在TBS中漂洗3次，10分鐘，在4-氯-1-萘酚(3毫克/毫升的甲醇溶液)中顯色，然后加到含有0.01％過氧化氫的TBS中至濃度為0.5毫克/毫升。測定兩個上清液中存在分子量為40,000的凝乳酶原。
在酸活化濃縮培養上清液(見上)后，在從含有pLS-3轉化培養物ATCC20775和20776制備的樣品中存在著明顯的凝乳活性。正如所預料的，在受體解脂亞羅威阿酵母ATCC20688的對照培養上清液中沒有得到凝乳活性。
表達/分泌質粒pXX-33的構建為了把pLS-3轉入改進的表達質粒pXX-33所作出的改進已在圖6中作了概述。這種改進增加了XPR2啟動區280堿基對，就pLS-3而言，表達質粒pXX-33含有一個編碼完整的堿性蛋白酶前肽原(prepro-peptide)(157個氨基酸殘基)的雜交基因，堿性蛋白酶被連接到整個凝乳酶原的結構基因順序上。
在以比pLS-3中多280bp的XPR2啟動子構建凝乳酶原表達/分泌質粒之前，有必要將含有完整堿性蛋白酶基因的一個限制性片段亞克隆到Hind III位點。這個亞克隆是通過把合成連接子加到由XPR2基因組文庫克隆pLD86分離得到的限制性片段中組裝而成。構建這種帶有上游區Hind III位點的XPR2亞克隆是從制備含有所有堿性蛋白酶基因的DNA片段著手的。XPR2克隆pLD-86的基因組區中的2.3Kb EcoR I-BamH I(部分)片段是通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化的，用合成片段進行連接，其順序為5′GATCGAAGCTTG3′3′ TTCGAACTTAA5′這種連接子順序含有一個BamH I粘性末端(但不再重新產生BamH I位點)，然后先后為Hind III位點和EcoR I粘性末端。連接產物用Hind III消化，然后插入到pBR322的Hind III位點。質粒pXHP-24通過它的限制性圖予以鑒定，成為用于未來表達構建體的XPR2啟動子片段的來源。
在質粒pXHP-24中，亞克隆的XPR2基因含有的5′XPR2啟動子順序比pLS-3中所含有XPR2啟動子順序多大約280堿基對。首先，啟動子組成片段通過標準連接反應，用合成DNA片段(如上面所述的pLS-3)和pXHP-24中的1 150堿基對Hind III-Ava I片段借助T4連接酶進行連接，然后用Hind III及BamH I切割后得到。將所得到的連接順序通過凝膠電泳純化，選出大約1196堿基對Hind III-BamH I片段。第二個片段含有編碼6～151個凝乳酶原氨基酸殘基的順序，是從經BamH I和Xma I切割的pLS-3以及凝膠純化所得到的440堿基對BamH I-Xma I DNA片段進行制備的。第三個含有凝乳酶原基因的剩余部分、XPR2終止密碼子和載體順序的片段是由用Hind III和Xma I切割的pLS-3，以及凝膠純化大約8.0Kb Hind III-Xma I載體片段進行制備的。然后將三個片段用上述標準方法進行連接。將連接反應產物用于轉化大腸桿菌K12菌株MM294。從根據氨芐青霉素抗性選出的轉化株中分離出質粒，質粒pXX-33用它的限制性圖進行鑒定(圖6)。對這種質粒的蛋白酶-凝乳酶原區測序證實了所需片段的正確連接。
然后用經SnaB I切割的pXX-33轉化解脂亞羅威阿酵母ATCC 20774提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20780，通過如上面所述的pLS-3的情況測定轉化培養物分泌到培養基中的凝乳酶原。結果證明在培養上清液中存在凝乳酶原。
在酸活化濃縮的培養上清液后(見上)，在由轉化培養物解脂亞羅威阿酵母ATCC20780中制備的樣品中觀察到明顯的凝乳活性。
表達/分泌質粒pXX-22的構建構建表達/分泌質粒pXX-22的實驗步驟已在圖7中給出。表達載體在兩個方面不同于pLS-3。如同pXX-33一樣，它含有附加的280堿基對片段的XPR2啟動子順序。其次，它含有編碼堿性蛋白酶信號肽的順序和僅僅38個前肽(pro1)的氨基酸殘基。
構建pXX-22的計劃與pXX-33相創似。首先，啟動子組成片段是通過標準的連接反應，用pXHP-24中的890堿基對HindIII-Bgl II片段以及合成片段借助T4連接酶進行連接，再用HindIII和BamH I消化之后得到的，合成片段的順序為5′GATCTTGCTGAGATCACTAG 3′3′AACGACTCTAGTGATCCTAG 5′得到的連接順序通過凝膠電泳分離920堿基對Hind III-BamH IDNA片段進行純化。另一個編碼凝乳酶原6～151殘基的片段，是由pLS-3經BamH I和Xma I切割以及凝膠純化所得到的440堿基對BamH I-Xma I DNA片段而分離出來的。第三個含有凝乳酶原基因其余部分、XPR2終止區和載體順序的片段是通過用Hind III和Xma I切割pLS-3以及凝膠純化大約8.0Kb載體片段進行制備的。然后將3個DNA片段用上述標準方法進行連接。將連接反應物用來轉化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選擇的轉化株中分離出質粒，質粒pXX-22是用它的限制性圖進行鑒定的(圖7)。
然后用經SnaB I切割的pXX-22轉化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774，以提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20779，通過如上面所述的pLS-3的情況測定轉化培養物在培養液中分泌的凝乳酶原。按照上述方法確定在培養上清液中存在著凝乳酶原。在酸活化濃縮的培養上清液后(見上)，在由轉化培養物解脂亞羅威阿酵母ATCC20779中制備的樣品中觀察到顯著的凝乳活性。
表達/分泌質粒pXX-11的構建構建凝乳酶原表達/分泌質粒pXX-11的實驗步驟在圖8中作了概述。這種質粒含有XPR2啟動子順序和連接編碼凝乳酶原順序的22個氨基酸殘基信號肽。用于pXX-11的構建計劃與用于pXX-22和pXX-33的構建計劃相類似。簡單說來，啟動子組成片段是通過標準的連接反應，用pXHP-24中大約750堿基對Hind III-Bgl II DNA片段和合成片段在T4連接酶存在下連接，再經Hind III和BamH I切割后獲得的，其中合成片段的順序為5′ TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3′3′AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5′——→所得連接順序通過凝膠電泳純化，選出790堿基對Hind III-BamHI DNA片段。編碼凝乳酶原殘基6～151的另一個片段則是從pLS-3中經BamH I和Xma I切割并經凝膠純化所得到的440堿基對BamH I-Xma I DNA片段分離出來。第3個含有凝乳酶原結構基因其余部分、XPR2終止密碼子和穿梭載體順序的片段則是通過用Hind III和Xma I切割pLS-3并經凝膠純化的大約8.0Kb載體片段進行制備的。然后將3個DNA片段用上述標準方法進行連接。連接反應物用于轉化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選擇的轉化株中分離出質粒，質粒pXX-11用它的限制性圖進行鑒定(圖8)。質粒的XPR2-凝乳酶原部分的測序證實了合適的合成DNA順序及所需片段的正確連接。
然后用經過SnaB I切割的pXX-11轉化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774產生解脂亞羅威阿酵母20778，通過如上面所述的pLS-3方法測定轉化培養物分泌在培養基中的凝乳酶原。按照上述方法，確定在培養上清液中存在著凝乳酶原。
凝乳測定(見上)表明，在含有pXX-11的轉化株ATCC20778的培養上清液中存在著明顯的凝乳活性。
實施例二 連接臺的構建對應于ATCC20774中的bio-6等位基因的野生型BIO基因按如下方法通過互補進行克隆。經Sau3A部分消化插入pLD40的BamH I位點(這是在EcoR I位點上的pBR322+LEU2)的解脂亞羅威阿酵母染色體DNA構建了基因文庫，制備了大量文庫DNA作為混合培養大腸桿菌質粒制備物(這是與用于克隆XPR2基因相同的文庫)。用酶Apa I(在LEU2區進行一次切割)消化幾微克的文庫DNA，通過將轉化混合物涂覆在缺亮氨酸的合成培養基上，用該DNA轉化ATCC 20774(leu2 xpr2 bio)。獲得幾萬個不依賴亮氨酸的轉化株。為了搞清哪些菌落含有包括BIO基因的文庫質粒(如果有的話)，把不依賴亮氨酸的轉化株平板影印轉移到含有生物素選擇培養基的瓊脂平板上(每升配方25毫克脫硫生物素、20克葡萄糖、5克硫酸銨、1克KH2PO4、0.5克MgSO4·7H2O、0.1克CaCl2、0.1克NaCl、500微克硼酸、400微克硫胺素·HCl、400微克ZnSO4·7H2O、400微克MnSO4·H2O、200微克Na2MoO4·2H2O、200微克FeCl3·6H2O、100微克KI和40微克CuSO4·5H2O)。
一種生長在生物素選擇培養基上的解脂亞羅威阿酵母BIO+轉化株，取名為DL31。我們著手從解脂亞羅威阿酵母菌株DL31中回收含有BIO基因的基因文庫質粒。從培養菌株DL31中制備染色體DNA。用限制性酶Apa I消化幾微克這種染色體DNA就能切除文庫質粒。將被消化的DNA的等分部份用于連接反應，使未知的文庫質粒環化。然后將連接混合物用來轉化氨芐青霉素抗性大腸桿菌培養物，以回收進入大腸桿菌的含有BIO的未知質粒。獲得了少量的氨芐青霉素抗性大腸桿菌轉化株。用大腸桿菌轉化株進行小規模的質粒制備。這樣得到的質粒DNA的限制性消化物表明含BIO的未知質粒，正如所預料的那樣等同于在BamHI位點帶有插入片段的pLD40。這種質粒一定源于我們的基因文庫，取名為pLD51。
質粒pLD56是通過去除pLD51中的LEU2基因作為pLD51的亞克隆而產生的，介紹如下。用酶EcoR I消化質粒pLD51的等分部分，以去除LEU區。被消化的DNA用于DNA的連接反應，使質粒環化。然后完成大腸桿菌的轉化，以克隆含有BIO的較小質粒。有一種氨芐青霉素抗性大腸桿菌轉化株表明含有所期望的較小質粒，取名pLD56。完成了pLD56的一些限制性消化。含有BIO的pLD56片段，作為在pBR322的BamH I位點存在的一個插入片段，長約3.6Kb。
一張非常粗略的解脂亞羅威阿酵母DNA的3.6Kb插入片段插入pBR322的BamH I位點(包括pLD56)的限制性圖將在下面介紹，從插入開始的大約距離以bp數示于括號內。量值的估計是從幾決瓊脂糖凝膠得出的，量值的誤差相當大Pvu II(800)，Pvu II(1200)，Pst I(1800)，Mlu I(2000)，Pst I(2300)，EcoR V(2700)，Nco I(3200)(取向pBR322的Sal I位點居于所述各位點之先，Hind III位點在各位點之后)。
菌株ATCC20774(MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002)用完整的pLD56(pBR322+含有BIO基因的約3.6Kb解脂亞羅威阿酵母染色體DNA)轉化。對3個不依賴生物素的不同轉化株與其親代菌株作比較，進行Nru I切割(以pBR322為目標)pLD40(在pBR322上的LEU2)的高頻轉化試驗，以測定哪些含有整合到BIO區的固有pBR322。因為pLD40都整合到固有的pBR322中，所以3個轉化株都顯示出高頻轉化。這已由Southern印跡雜交試驗所確認。3個原始的解脂亞羅威阿酵母BIO轉化株中有一株取名為DL118并進一步用作DNA受體。上述的限制性圖需要確定(1)以什么作為BIO特異性雜交探針(一個Nco I-Pvu II片段)；(2)需要用哪種酶來正確地切除pLD56質粒(Mlu I)；(3)哪個酶只在pBR322部分中進行一次切割(Cla I)；(4)哪種酶完全不能切割質粒(Apa I)。ATCC20774和DL118(已用BIO片段探測)中DNA的Cla I和ApaI消化物的Southern雜交表明，正如預料的一樣，DL118的生物素區(在與ATCC20774的BIO區相比較時)是被附加的近似于pLD56大小的DNA破壞了。DL118 DNA的Mlu I消化片段(已用pBR322進行探測)進一步表明附加的DNA與完整的pLD56同樣大小。
表達/分泌質粒pLX-34的構建構建的表達質粒是把帶有XPR2分泌信號(157個氨基酸前原順序)的凝乳酶密碼順序置于LEU2啟動子的下游。這種表達質粒顯示出除了XPR2啟動子外的啟動子可用來成功地分泌異源蛋白質。此外，這種表達載體能夠實現與解脂亞羅威阿酵母基因組中整合位點無關的表達/分泌。成功地分泌帶有除了XPR啟動子外的其他啟動子的凝乳酶原說明為了鑒定解脂亞羅威阿酵母中另外新的更強的啟動子構建表達載體的可能性。此外，這種方法能夠用來獲得表達培養物，該培養物具有兩個分離的雜交凝乳酶原基因，一個由LEU2啟動子表達，另一個由XPR2啟動子表達，被分別整合在宿主基因組中不同的位點上。
構建表達載體的試驗步驟在圖13中已作了概述，該載體含有凝乳酶原基因，帶有用LEU2啟動子順序表達的堿性蛋白酶分泌信號(157個氨基酸的XPR2前原順序)。構建這種質粒是從制備LEU2啟動子片段起始的，該片段含有上述β-異丙基苯果酸脫氫酶基因的ATG轉譯起始密碼子前的5′非轉譯順序大約300堿基對(圖12)。從穿梭載體pLD40中分離出為LEU2啟動子順序的270堿基對部分編碼的300堿基對Hind III-Fok I DNA片段。這個片段用T4連接酶與54堿基對具有下列順序的合成連接子連接，----------Leu2-------FokI5′-ATACAACCACACACATCCACAATG3′-TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC-----------------Xpr2----------------BglIAAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-3′TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5′然后用Hind III進行消化。所得連接順序再用凝膠電泳分離大約360堿基對的Hind III-Bgl I DNA片段進行純化。編碼XPR2前原順序的剩余部分和凝乳酶原的前152個氨基酸殘基的另一個組成片段是從表達質粒pXX-33(圖6)經Bgl I和Xam I切割分離出來的，再用凝膠純化得到887堿基對DNA片段。第三個片段含有凝乳酶原基因的剩余部分、XPR2終止密碼子和載體順序，它是通過HindIII和Xma I切割pXX-33，再經切割大約8.0Kb載體片段再經凝膠純化制備得到的。將這三個DNA片段用上述標準方法連接。連接反應物用于轉化大腸桿菌K12菌株HB101。從選出的氨芐青霉素抗性轉化株中分離質粒，質粒pLX-34用它的限制性圖(圖13)進行鑒定。
用經Nru I切割的pLX-34 DNA來轉化解脂亞羅威阿酵母ATCC20794(DL118)，以提供解脂亞羅威阿酵母ATCC 20795(DL251)，并按上述pLS-3時的方法測定由不依賴亮氨酸的轉化株培養物分泌到培養液中的凝乳酶原。這種轉化方法指導pLX-34整合到預先引入宿主染色體bio座位上的pBR322順序中(如上所述)。pLX-34在這個位點上的整合是用Southern分析法予以證實的。
用DL118作為受體Southern雜交實驗按下述方法進行DL118轉化株DNA的Nru I消化片段(例如當參入質粒是凝乳酶原表達質粒時，就與凝乳酶原探針雜交)精確地切割了參入質粒。用幾毫微克經Nru I消化的轉化質粒檢查雜交帶的正確大小，這些轉化株DNA(已用32P標記的pBR322進行探測)的Mlu I消化片段(在轉化質粒中Mlu I不切割)也表明DL118固有的pBR322順序由于加入了一個或更多個轉化質粒的分子而受到破壞。這證明整合是在所需位點上發生的。
將轉化株培養物解脂亞羅威阿酵母ATCC20795(DL251)置于YEPD培養基中于22℃培養，以利于由LEU2啟動子表達。在培養上清液中存在的凝乳酶原用酸活化培養上清液的凝乳測定(見上)予以證實并經免疫印跡分析(見上)確認。上述結果表明，這個雜交基因是一個獨立的表達單位，當在除了XPR2或LEU2外的位點上整合時，能夠表達/分泌。這個特點使人們能夠用多重雜交基因構建表達培養物，它具有產生高水平的細胞外凝乳酶原的潛在能力。
實施例三 人C5a的合成基因的順序實現由細菌產生人過敏毒素C5a而設計的計劃，類似于如在歐洲專利申請0147178號中所述的用于合成和表達表皮生長因子(EGF)的先前方法。采用構建的一個基因，其中用于編碼激活的補體成分C5a的順序是人工合成的。給出已知的人C5a的氨基酸順序，我們設計了一個編碼其74個氨基酸信息的DNA片段(圖9)。選擇合成基因順序以擴大大腸桿菌和啤酒酵母優選密碼子的利用，并可使限制性核酸內切酶的若干位點便于鑒定。這項方案可以通過在編碼C5a多肽第一個氨基酸的三聯體之前引入蛋白質合成的ATG起始密碼子，使得過敏毒素在大腸桿菌內直接表達。為便于在所需的取向上插入到質粒pBR322中，設計的合成C5a基因在其末端含有EcoR I和Hind III限制性核酸內切酶識別位點。為了獲得C5a基因順序，通過phosporamidite方法合成10個47聚體并且組裝成235bp雙股DNA片段。將C5a基因片段插入到被適當切割的pBR322中，并從隨機挑選的轉化株中通過質粒DNA的限制性切割分析來鑒定克隆基因。然后采用DNA順序測定法分析若干C5a克隆，鑒別出帶有正確順序的克隆。在被檢查的5個克隆中有2個找到了預期的C5a基因區的核苷酸順序。
人C5a的細菌表達構建C5a表達質粒是從用限制性核酸內切酶EcoR I切割C5a亞克隆起始的，然后用細菌堿性磷酸酶處理脫磷酸化。用含有trp啟動子—操縱子和核糖體結合位點順序的pPFZ-R2中的360bp EcoR I DNA片段，構建C5a表達質粒。用連接反應物轉化大腸桿菌菌株HB101的感受態細胞。對各個轉化中的一些抗藥性菌落進行純化，并對它們的質粒DNA進行限制性核酸內切酶圖譜分析，以鑒定在能導致C5a基因轉錄的取向上帶有trp啟動子的那些表達質粒。從上述連接反應中得到的多重分離物與含有過敏毒素基因的質粒相一致，所說的過敏毒素基因鄰近直接表達C5a所需的構型中的細菌啟動子順序。C5a表達質粒p C5a-48的限制性圖見圖10。
人過敏毒素在解脂亞羅威阿酵母中的表達和分泌編碼分泌人過敏毒素C5a的表達/分泌載體pC5a X-3的制備技術如實施例一對pXX-33所述。然后將解脂亞羅威阿酵母ATCC20774用這個分泌載體轉化，并測定由轉化培養物產生的人C5a，除了在免疫印跡步驟中用羊抗C5a和兔抗羊IgG，其余如上所述。對本實施例所述的質粒，證實了C5a存在于培養上清液中。
表達/分泌質粒pC5aX-3的構建構建過敏毒素表達/分泌質粒pC5a X-3的實驗步驟在圖11中概述。這個質粒含有“完整”XPR2啟動子的順序、以及與編碼74個C5a氨基酸殘基的合成順序連接的157個氨基酸殘基信號和肽原。pC5aX-3的構建計劃類似于pXX-33。首先，用Hind III和Ava I切割質粒pXHP-24(或含有所需順序的另一個質粒)，凝膠純化含有XPR2啟動子的1150堿基對片段。另一個片段含有XPR2肽原的3′端和C5a結構基因順序，是借助T4連接酶通過標準連接反應，用大腸桿菌表達質粒pC5a-48中的約220堿基對Hinf I-Hind III DNA片段和帶有下列順序的合成片段連接，，然后再用Ava I和Hind III進行切割得到的。
5′ CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA3′3′ CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5′所得的連接順序通過凝膠電泳純化，選擇出大約250堿基對的AvaI-Hind III片段。含有啟動子的Hind III-Ava I片段和編碼C5a的Ava I-Hind III片段用T4連接酶連接，然后用Hind III消化。約1.4Kb片段進行凝膠純化并且用經Hind III切割的pterm4(如上所述)連接。連接反應物用來轉化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選的轉化株中分離出氨芐青霉素抗性質粒，質粒pC5aX-3用其限制圖進行鑒定。然后將解脂亞羅威阿酵母菌株PC-30869(ATCC20774)用經Sna B I切割的pC5a X-3進行轉化，并按上述方法測定由轉化培養物分泌在培養基中的過敏毒素。用上述方法證實培養上清液中存在C5a。人們認為由與內質網結合的核糖體合成的許多蛋白質是以糖蛋白形式產生的。實際上，糖基化可影響給定蛋白質的分泌。真核蛋白質的N連接糖基化作用發生在三肽順序天冬酰胺-X-蘇氨酸和天冬酰胺-X-絲氨酸，其中X可以是除了可能的天冬氨酸外的任何氨基酸(Hubbard，S.等，1981，Ann.Rev.Biochem.50；555)。凝乳酶原的氨基酸順序包括這樣兩個三肽順序，但對分泌在解脂亞羅威阿酵母培養物中的凝乳酶原進行凝膠電泳分析證明沒有糖基化的跡象。在另一些分泌的真核蛋白質中，也并不是所有的天冬酰胺-X-蘇氨酸/絲氨酸位點都被糖基化。很可能三肽順序內的某些天冬酰胺并不糖基化，因為它們難以接近糖基化酶。
關于人C5a，氨基酸順序包括單個糖基化位點或三肽順序(天冬酰胺-異亮氨酸-絲氨酸)，該順序通常具有與天冬酰胺相連的復合低聚糖(Fernandez，H.等，1976，J.Immunol.117，1688)。分泌到解脂亞羅威阿酵母培養基中的部分C5a分子似乎被糖基化，因為抗原活性的寬區是在免疫印跡的高分子量部分。這種不均一的電泳遷移率與所觀察到的其他分泌蛋白質類似，可能是由于糖基化程度不同所致。在本發明中，某些分泌的異源蛋白質的表觀糖基化啟示人們，解脂亞羅威阿酵母的表達和分泌對產生許多正常的糖基化真核蛋白質將是有用的。
*從XPR2轉化株DL112回收質粒的圖解說明(參閱圖1)。各個標記區是(從左到右)解脂亞羅威阿酵母未經測序部分、pBR322、EcoR I位點與連接解脂亞羅威阿酵母DNA(以前為BamH I位點)之間的小片段、解脂亞羅威阿酵母LEU2基因、pBR322的大片段、和已測序的XPR2的突變等位基因。“B”是Bgl II位點，“E”是EcoR I位點。用線條表示回收的3個質粒，它們在Bgl II位點的末端連接成環形分子。
權利要求
1.產生異源蛋白質的方法，該方法包括，培養一個解脂亞羅威阿酵母轉化株，與異源載體DNA同源的同源區，所述同源區包含在所述解脂亞羅威阿酵母整合轉化期間用作受體位點的外源DNA。
2.根據權利要求1的產生異源蛋白質的方法，其中同源區是由pBR322或其衍生物衍生的。
全文摘要
解脂亞羅威阿酵母的XPR2和LEU2基因順序的排列，重組解脂亞羅威阿酵母克隆載體，包括編碼表達哺乳動物蛋白質和其他多肽的異源DNA；用XPR2基因啟動子、堿性蛋白質前原區和XPR2終止密碼子區等整合的表達載體，能夠在已轉化的解脂亞羅威阿酵母的細胞培養物中表達異源蛋白質并將異源蛋白質分泌到細胞外；解脂亞羅威阿酵母轉化株包括所述的載體和質粒；并提供制備載體的方法。
文檔編號C12N9/60GK1138632SQ9610152
公開日1996年12月25日 申請日期1996年1月15日 優先權日1985年10月18日
發明者L·S·達維多, J·R·德齊, A·E·弗蘭克 申請人:美國輝瑞有限公司