本發明屬于(yu)植物(wu)(wu)分子(zi)生物(wu)(wu)學和(he)植物(wu)(wu)育種領域(yu)，具體涉(she)及水稻轉(zhuan)錄因子(zi) osrav1基因在(zai)調(diao)控種子(zi)耐(nai)貯(zhu)性(xing)和(he)萌(meng)發期耐(nai)鹽性(xing)中(zhong)的應用。

背景技術：

1、水稻種(zhong)子(zi)(zi)活力與種(zhong)子(zi)(zi)貯藏(zang)條(tiao)件等(deng)(deng)因素密切相關，很大程(cheng)度(du)上決定了幼苗(miao)生(sheng)(sheng)長(chang)狀況及(ji)對(dui)逆境(jing)(jing)的(de)耐(nai)受(shou)性(xing)。在種(zhong)子(zi)(zi)貯藏(zang)過程(cheng)中的(de)高(gao)溫和高(gao)濕(shi)環境(jing)(jing)會(hui)導致(zhi)種(zhong)子(zi)(zi)活力下(xia)降(jiang)(jiang)，表(biao)現(xian)為發芽率(lv)降(jiang)(jiang)低(di)、幼苗(miao)生(sheng)(sheng)長(chang)異(yi)常等(deng)(deng)現(xian)象，且對(dui)逆境(jing)(jing)耐(nai)受(shou)性(xing)降(jiang)(jiang)低(di)。沿海地(di)區(qu)水稻直播技術(shu)推廣過程(cheng)主要(yao)面臨鹽漬脅(xie)迫(po)，對(dui)種(zhong)子(zi)(zi)發芽和幼苗(miao)建成產生(sheng)(sheng)負面影響。

2、提升種(zhong)(zhong)子活力(li)(li)是提升作物生產力(li)(li)和(he)適應性(xing)(xing)的關(guan)(guan)鍵策略之一。然而(er)，目前水(shui)(shui)稻中克隆的調(diao)控種(zhong)(zhong)子活力(li)(li)相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)基因(yin)較少，分(fen)子機制(zhi)也不清楚。此外(wai)，種(zhong)(zhong)子萌發(fa)、耐(nai)(nai)(nai)貯(zhu)性(xing)(xing)和(he)萌發(fa)過程(cheng)耐(nai)(nai)(nai)鹽(yan)性(xing)(xing)之間存(cun)在關(guan)(guan)聯性(xing)(xing)，如利用基因(yin)啟動(dong)子或編碼(ma)區的不同等(deng)位變異來(lai)調(diao)控轉錄水(shui)(shui)平(ping)和(he)蛋白活性(xing)(xing)，對提高或平(ping)衡種(zhong)(zhong)子萌發(fa)、耐(nai)(nai)(nai)貯(zhu)性(xing)(xing)和(he)萌發(fa)期耐(nai)(nai)(nai)鹽(yan)性(xing)(xing)等(deng)具有重要(yao)的意義(yi)，相(xiang)(xiang)關(guan)(guan)研究(jiu)為培育高種(zhong)(zhong)子活力(li)(li)的水(shui)(shui)稻品種(zhong)(zhong)提供優異種(zhong)(zhong)質資源。

技術實現思路

1、本(ben)發明的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)是提供水(shui)(shui)稻(dao)轉(zhuan)錄因子 osrav1基因在調控種(zhong)(zhong)子耐(nai)貯性和(he)(he)萌發期(qi)耐(nai)鹽(yan)性的(de)(de)(de)應(ying)用(yong)。通過(guo)(guo)過(guo)(guo)表(biao)(biao)達和(he)(he)crispr/cas9技術活力不同表(biao)(biao)達水(shui)(shui)平 osrav1轉(zhuan)基因材料，發現(xian) osrav1過(guo)(guo)表(biao)(biao)達材料可以提高種(zhong)(zhong)子貯藏(zang)后種(zhong)(zhong)子活力、直(zhi)播條(tiao)件下種(zhong)(zhong)子的(de)(de)(de)成苗率(lv)及耐(nai)鹽(yan)性，這為(wei)培育適宜(yi)(yi)直(zhi)播的(de)(de)(de)高種(zhong)(zhong)子活力的(de)(de)(de)水(shui)(shui)稻(dao)提供了新的(de)(de)(de)基因資(zi)源，這對耐(nai)貯藏(zang)、適宜(yi)(yi)直(zhi)播和(he)(he)耐(nai)鹽(yan)性的(de)(de)(de)水(shui)(shui)稻(dao)品種(zhong)(zhong)選育具有重要意義(yi)。

2、為實現上述目(mu)的，本發明提供了如(ru)下(xia)方案：

3、本發明提供水(shui)稻(dao)轉錄因子  osrav1基因在調控(kong)水(shui)稻(dao)種子耐貯(zhu)性和萌(meng)發期耐鹽性中的應用。

4、所述(shu)調控水(shui)稻(dao)萌(meng)發期(qi)耐鹽(yan)性為提高水(shui)稻(dao)鹽(yan)脅迫條件(jian)下(xia)水(shui)稻(dao)種子的(de)發芽率(lv)及水(shui)稻(dao)萌(meng)芽期(qi)的(de)成(cheng)苗率(lv)、根長、芽長、根干重和芽干重。

5、本發(fa)明(ming)還提(ti)供水稻轉錄因子 osrav1基因在調控水稻直播出苗率中(zhong)的應用。

6、優選的，所(suo)述的 osrav1基因的核酸(suan)序(xu)列如seq?id?no.1所(suo)示(shi)；編碼的氨基酸(suan)序(xu)列如seq?id?no.11所(suo)示(shi)。

7、本發明還提供一(yi)種(zhong)調控水稻(dao)(dao)種(zhong)子(zi)(zi)(zi)活力的(de)方法，在水稻(dao)(dao)中過表(biao)達轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子(zi)(zi)(zi) osrav1基(ji)因(yin)，獲得(de)轉(zhuan)基(ji)因(yin)水稻(dao)(dao)植(zhi)株并得(de)到高種(zhong)子(zi)(zi)(zi)活力的(de)水稻(dao)(dao)品(pin)種(zhong)，所述水稻(dao)(dao)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子(zi)(zi)(zi) osrav1基(ji)因(yin)的(de)核(he)酸序列如seq?id?no.1所示。

8、優(you)選(xuan)的，所述調控(kong)水稻(dao)種(zhong)子活力(li)為提高水稻(dao)種(zhong)子活力(li)。

9、優選的(de)，所述調控水稻種(zhong)子活力為(wei)提高老化(hua)處(chu)理后(hou)水稻種(zhong)子的(de)發芽(ya)速率(lv)和(he)最終(zhong)發芽(ya)率(lv)。

10、優選的，所述調控水稻種子活力為提高鹽脅迫條件下水稻種子的發(fa)芽(ya)率(lv)(lv)及提高鹽脅迫狀態下水稻萌芽(ya)期(qi)的成苗率(lv)(lv)、根長、芽(ya)長、根干重(zhong)(zhong)和芽(ya)干重(zhong)(zhong)。

11、優選的(de)，所述獲得轉(zhuan)基(ji)因水(shui)稻(dao)(dao)植(zhi)(zhi)株(zhu)包括：將帶有(you)osrav1編碼(ma)區(qu)片段(duan)的(de)質粒轉(zhuan)化農桿菌eha105感受態(tai)細胞，侵(qin)染水(shui)稻(dao)(dao)種子(zi)愈傷組織，通過潮霉素篩選獲得轉(zhuan)基(ji)因水(shui)稻(dao)(dao)植(zhi)(zhi)株(zhu)。

12、優(you)選(xuan)的，所述轉(zhuan)基因(yin)水稻植株的鑒(jian)定引物如seq?id?no.2~5所示。

13、一種調控水(shui)稻(dao)(dao)(dao)種子(zi)活力的(de)方法，所(suo)(suo)(suo)述方法包括在水(shui)稻(dao)(dao)(dao)中過表達轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi) osrav1基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，從而提高種子(zi)活力。利用crispr/cas9基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)編輯技(ji)術，獲得水(shui)稻(dao)(dao)(dao) osrav1基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)敲除轉(zhuan)基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)水(shui)稻(dao)(dao)(dao)植株，其種子(zi)活力就會(hui)降(jiang)低(di)，所(suo)(suo)(suo)述水(shui)稻(dao)(dao)(dao)轉(zhuan)錄(lu)因(yin)(yin)(yin)(yin)子(zi) osrav1基(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)的(de)核(he)酸序列如seq?idno.1所(suo)(suo)(suo)示。

14、水稻中過量表達表達  osrav1基因的方法，包括(kuo)如下步驟：

15、（1）以(yi)日本晴cdna為模板，設計同源重組(zu)引物，利用高保真酶(mei)擴增 osrav1編碼區(qu)序列(lie)；

16、（2）將（1）中獲(huo)得的純化產物，克隆到pb1301ubinos-osrav1-3ha載體，獲(huo)得重(zhong)組質粒；

17、（3）將（2）帶有 osrav1編碼(ma)區片段(duan)的質粒轉化農桿(gan)菌 eha105感受(shou)態細胞，侵(qin)染水稻種(zhong)子愈傷(shang)組(zu)織，通過(guo)潮霉素(su)篩選獲得(de)轉基因水稻植株；

18、（4）步(bu)驟（3）中引物序列為(wei):

19、hm-f:?gcttctgcgggcgatttgtgt（seq?id?no.2）

20、hm?-r:?ggtcgcggaggctatggatgc（seq?id?no.3）

21、（5）利(li)用(yong)qrt-pcr鑒定(ding)轉(zhuan)基因(yin)植株，引物為 osrav1-f:?gtggagccgattcgtgagggag（seq?idno.4）， osrav1-r:?cgtcgacggttgccaggttgtt（seq?idno.5）

22、水稻中(zhong)敲除 osrav1基(ji)因(yin)的方法，包(bao)括(kuo)如下(xia)步驟(zou)：

23、靶(ba)向敲除(chu)水稻轉錄因(yin)(yin)子 osrav1基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的方法，采用(yong)crispr/cas9基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)編輯技術，選取 osrav1基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的靶(ba)點序(xu)列以(yi)及相應(ying)的上游引物和下(xia)游引物，先后(hou)構建中間載(zai)體(ti)和最終載(zai)體(ti)；將最終載(zai)體(ti)侵(qin)染水稻愈傷組(zu)織，獲得水稻 osrav1基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的敲除(chu)轉基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)水稻植株，即完成水稻 osrav1基(ji)(ji)(ji)因(yin)(yin)的靶(ba)向敲除(chu)。 

24、（1）所述的靶點序(xu)列(lie)為 osrav1基因的第一外(wai)顯(xian)子上的一段長度為20np的片段，靶點序(xu)列(lie)為gctcgtccacggacaagctg（seq?id?no.6）。 

25、（2）所述上(shang)游引(yin)物(wu)的(de)核苷酸(suan)序列(lie)為(wei)(wei)ggacatccgtccgtactggggtag（seq?id?no.7），所述下游引(yin)物(wu)的(de)核苷酸(suan)序列(lie)為(wei)(wei)aaacgcttcggtatgacgagcctg（seq?id?no.8）。

26、（3）中(zhong)間載(zai)體的構建(jian)方(fang)法(fa)包括以(yi)下(xia)步驟(zou)：1.利用限(xian)制性(xing)內切酶(mei)aari對中(zhong)間載(zai)體sk-grna進行酶(mei)切；2.將上下(xia)游引(yin)物等比例混合后，100℃變性(xing)5分鐘(zhong)，室溫冷卻后形成帶有粘性(xing)末端(duan)的片(pian)段；3.通(tong)過(guo)t4連接酶(mei)，將酶(mei)切后的sk-grna載(zai)體和帶有粘性(xing)末端(duan)的片(pian)段進行連接，轉化(hua)大腸桿菌 dh5α感受(shou)態細胞，得到(dao)含有目標片(pian)段的中(zhong)間載(zai)體sk-grna- osrav1。

27、（4）最(zui)(zui)終載(zai)(zai)(zai)(zai)體的(de)構建(jian)方法包(bao)括以(yi)下步驟：1.利用限制性(xing)內切酶 kpni和 bamhi對(dui)最(zui)(zui)終載(zai)(zai)(zai)(zai)體?pc1300-cas9進(jin)行酶切，形成(cheng)帶有粘性(xing)末(mo)(mo)端(duan)的(de)載(zai)(zai)(zai)(zai)體；2.將(jiang)上(shang)述步驟獲得的(de)中(zhong)間載(zai)(zai)(zai)(zai)體sk-grna- osrav1用限制性(xing)內切酶 kpni和 bglii進(jin)行酶切，并回收片段(duan)；3.將(jiang)帶有粘性(xing)末(mo)(mo)端(duan)的(de)pc1300-cas9載(zai)(zai)(zai)(zai)體和上(shang)述片段(duan)進(jin)行連接，轉化大腸桿菌 dh5α感受態(tai)細胞(bao)，通過測序(xu)檢測獲得含有靶點序(xu)列(lie)的(de)最(zui)(zui)終載(zai)(zai)(zai)(zai)體pc1300-cas9-grna- osrav1。

28、（5）將（4）構建成(cheng)功(gong)的最終載體轉(zhuan)化農桿菌 eha105感受態細(xi)胞(bao)，侵染(ran)水稻愈(yu)傷組(zu)織，通(tong)過潮霉素和pcr篩選獲得轉(zhuan)基因水稻植(zhi)株。 

29、（6） osrav1測(ce)序特異性引物(wu) osrav1-f：atccgtccgtactggggtag；（seq?id?no.9）和 osrav1-r：gcttcggtatgacgagcctg（seq?id?no.10）。對上(shang)述轉基因水稻植(zhi)株(zhu)進(jin)行(xing)測(ce)序篩選，最(zui)終獲得(de)了缺失(shi)5個(ge)(ge)堿基“acaag”的突變體(ti)株(zhu)系(xi) osrav1-1和插(cha)入1個(ge)(ge)堿基“g”的突變體(ti)株(zhu)系(xi) osrav1-2（圖1）。

30、有益效果

31、本發(fa)(fa)明的(de) osrav1基因(yin)及(ji)其(qi)編(bian)碼蛋白可(ke)用于調(diao)控水稻(dao)種子耐貯性和(he)(he)萌發(fa)(fa)期耐鹽(yan)性。在種子經過人工老化處理(li)后，過表達(da)種子發(fa)(fa)芽率(lv)(lv)顯(xian)著大于野生型(xing)，而敲(qiao)除(chu)株(zhu)系則(ze)相反。在ck處理(li)中，過表達(da)株(zhu)系的(de)根(gen)長和(he)(he)干重(zhong)(zhong)顯(xian)著大于野生型(xing)；在0.5%?nacl鹽(yan)土處理(li)中，兩個(ge)過表達(da)株(zhu)系成(cheng)苗率(lv)(lv)分別(bie)提(ti)高(gao)了68.54%和(he)(he)133.90%，根(gen)長、芽長、根(gen)干重(zhong)(zhong)和(he)(he)芽干重(zhong)(zhong)也顯(xian)著大于野生型(xing)，而敲(qiao)除(chu)株(zhu)系則(ze)相反。因(yin)此(ci)，本發(fa)(fa)明可(ke)以用來解決種子貯藏后萌發(fa)(fa)活力下(xia)降的(de)問題，提(ti)高(gao)水稻(dao)直(zhi)播(bo)過程成(cheng)苗率(lv)(lv)和(he)(he)鹽(yan)脅(xie)迫耐受性，具有廣闊的(de)應用前(qian)景(jing)。