背景技術：

1、胞(bao)(bao)外(wai)基質(zhi)(zhi)(extracellular?matrix，ecm)和(he)ecm蛋白在(zai)生(sheng)長(chang)、傷口愈合、細(xi)胞(bao)(bao)遷移和(he)分化等(deng)過程中(zhong)發(fa)揮重要的(de)(de)生(sheng)理作用。此(ci)外(wai)，在(zai)疾病狀態下，ecm的(de)(de)組成(cheng)發(fa)生(sheng)變(bian)化并且(qie)先(xian)前的(de)(de)觀(guan)察表(biao)明胞(bao)(bao)外(wai)基質(zhi)(zhi)(ecm)蛋白的(de)(de)這(zhe)些變(bian)化在(zai)癌癥進(jin)展和(he)轉移中(zhong)、在(zai)心血管疾病中(zhong)和(he)在(zai)纖維化中(zhong)發(fa)揮重要作用。需要靶向(xiang)ecm蛋白的(de)(de)新(xin)的(de)(de)分子，以用于成(cheng)像(xiang)和(he)靶向(xiang)疾病狀態。

技術實現思路

1、本公開(kai)內(nei)容(rong)的(de)(de)一些方面(mian)提(ti)供(gong)了與細胞(bao)因(yin)子偶聯的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)ecm納(na)米(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)，其可用于(yu)將細胞(bao)因(yin)子靶向至腫(zhong)(zhong)瘤(liu)微環(huan)境，以刺激針(zhen)對(dui)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)的(de)(de)局部免疫應答(da)。本文(wen)中認識到數個參數影響效力(li)(li)，包(bao)括提(ti)高(gao)納(na)米(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)對(dui)腫(zhong)(zhong)瘤(liu)ecm的(de)(de)親和(he)(he)力(li)(li)、ecm靶標(biao)的(de)(de)表達水(shui)平和(he)(he)遞(di)送途徑(全身(shen)性或(huo)瘤(liu)內(nei))。本文(wen)中所(suo)述的(de)(de)親和(he)(he)力(li)(li)提(ti)高(gao)的(de)(de)納(na)米(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)提(ti)供(gong)了優(you)于(yu)現(xian)有技術抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(包(bao)括“親本njb2”抗(kang)(kang)(kang)體(ti))的(de)(de)顯著優(you)勢。親本納(na)米(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)njb2對(dui)纖(xian)(xian)連(lian)蛋(dan)白的(de)(de)eiiib結構域具(ju)有特異性，所(suo)述纖(xian)(xian)連(lian)蛋(dan)白的(de)(de)eiiib結構域在疾病部位例(li)如腫(zhong)(zhong)瘤(liu)、轉(zhuan)移瘤(liu)和(he)(he)纖(xian)(xian)維化等中顯示出選擇性表達。本文(wen)中所(suo)述的(de)(de)親和(he)(he)力(li)(li)提(ti)高(gao)的(de)(de)納(na)米(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)保留了其對(dui)eiiib的(de)(de)特異性。

2、在一(yi)個方面中，本公(gong)開內容(rong)提供了與纖(xian)連蛋(dan)白的eiiib結構域特異性結合并(bing)且包(bao)(bao)含(han)(han)以下的納米抗(kang)體：a)互補決定區(complementarity-determining?region，cdr)1，其包(bao)(bao)含(han)(han)g(s/r/i/n)tfsh(n/s/y/k)ag(g/s)；b)cdr2，其包(bao)(bao)含(han)(han)(g/r)(i/v)(s/r/g/n)s(d/a/y)gni(n/s)；和c)cdr3，其包(bao)(bao)含(han)(han)nirg(s/t)yg(n/s)tyy(s/r)r，其中所述納米抗(kang)體不(bu)包(bao)(bao)含(han)(han)seq?id?no：1。

3、在一些(xie)實(shi)施方(fang)案中(zhong)，納米抗體(ti)包含：a)cdr1，其選自

4、gstfshnagg(seq?td?no：54)，gstfshsagg(seq?td?no：57)，gstfshyagg(seq?idno：107)，gstfshkagg(seq?id?no：106)，grtfshnagg(seq?id?no：105)，gstfshnags(seq?idno：104)，gitfshnagg(seq?id?no：103)，grtfshsagg(seq?id?no：63)和gntfshsagg(seq?idno：102)；

5、b)cdr2，其選自

6、gissdgnin(seq?id?no：55)，girsdgnin(seq?id?no：58)，gigsdgnin(seq?id?no：59)，gissagnin(seq?id?no：60)，rissdgnin(seq?id?no：108)，ginsygnin(seq?id?no：109)，gigsagnin(seq?id?no：62).girsdgnis(seq?id?no：101)和gvrsdgnin(seq?id?no：61)；；

7、以(yi)及c)cdr3，其選(xuan)自

8、nirgsygntyysr(seq?id?no：56)，nirgtygntyysr(seq?id?no：100)，

9、nirgsygntyyrr(seq?id?no：99)和nirgsygstyysr(seq?id?no：98)。

10、在一些實施方(fang)案中，納米抗體(ti)包含cdr1、cdr2和cdr3，a)所述cdr1、cdr2和cdr3分別(bie)包含：

11、gstfshsagg(seq?id?no：57)，girsdgnin(seq?id?no：58)

12、和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)；(b)所(suo)述cdr1、cdr2和cdr3分別包含(han)：

13、gstfshsagg(seq?id?no：57)，

14、gigsdgnin(seq?id?no：59)和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)；(c)所(suo)述cdr1、cdr2和cdr3分別(bie)包含：

15、gstfshsagg(seq?id?no：57)，gissagnin(seq?id?no：60)

16、和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)；(d)所述cdr1、cdr2和cdr3分別包含(han)：gstfshsagg(seq?id?no：57)

17、gigsagnin(seq?id?no：62)和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)；(e)所述cdr1、cdr2和cdr3分別包含：

18、gstfshsagg(seq?id?no：57)，gvrsdgnin(seq?id?no：61)

19、和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)；或(huo)f)所述(shu)cdr1、cdr2和cdr3分(fen)別包含：grtfshsagg(seq?id?no：63)，

20、girsdgnin(seq?id?no：58)和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)。

21、在一些實施(shi)方案中(zhong)，納米抗(kang)體包(bao)含(han)cdr1、cdr2和(he)cdr3，所述cdr1、cdr2和(he)cdr3分別(bie)包(bao)含(han)

22、gstfshsagg(seq?id?no：57)，girsdgnin(seq?id?no：58)

23、和nirgsygntyysr(seq?id?no：56)。

24、在一些實施(shi)方案中，納米抗體還包含(han)框(kuang)(kuang)架(jia)(jia)1，所述框(kuang)(kuang)架(jia)(jia)1包含(han)：

25、a)qvqlvetggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：64)；b)

26、qvqlvgtggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：68)；c)

27、rvqlvetggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：85)；d)

28、qvrlvetggglvqaggslrlscavs(seq?id?no：86)；e)

29、rvqlvetggglvqaggslrlscavs(seq?id?no：66)；f)

30、qvqlvetggglvqaggslrlscavs(seq?id?no：71)；g)

31、qvqlvetrgglvqaggslrlscavs(seq?id?no：72)；h)

32、qvqlvetegglvqaggslrlscaas(seq?id?no：70)；i)

33、rvqlvetegglvqaggslrlscaas(seq?id?no：87)；j)

34、qvrlvetggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：88)；k)

35、qvqlveaggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：73)；l)

36、qvqlvetrgglvqaggslrlscaas(seq?id?no：89)；m)

37、rvqlvetrgglvqaggslrlscaas(seq?id?no：90)；或n)

38、qvqlvgtggglvqaggslrlscavs(seq?id?no：91)

39、在一些實施方(fang)案中，納米抗體包(bao)含框架1，所述框架1包(bao)含：a)

40、rvqlvetggglvqaggslrlscavs(seq?id?no：66)；b)

41、qvqlvetrgglvqaggslrlscavs(seq?id?no：72)；c)

42、qvqlvetggglvqaggslrlscavs(seq?id?no：71)；d)

43、qvqlvetegglvqaggslrlscaas(seq?id?no：70)；e)

44、qvqlvetggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：64)；或f)

45、qvqlveaggglvqaggslrlscaas(seq?id?no：73)。

46、在一些實施(shi)方案中，納(na)米抗(kang)體還包(bao)含框架(jia)4，所(suo)述(shu)框架(jia)4包(bao)含：a)

47、wgqgtqvtvss(seq?id?no：65)；b)wgqgiqvtvss(seq?id?no：69)；c)

48、wsqgtqvtvss(seq?id?no：92)；d)wgqrtqvtvss(seq?id?no：97)；e)

49、wgrgaqvtvss(seq?id?no：93)；f）wgqgaqvtvss(seq?id?no：67)；g)

50、wgqgtqvtvfs(seq?id?no：94)；h)wgqgtrvtvss(seq?id?no：95)；或i)

51、ggqgtqvtvfs(seq?id?no：96)。

52、在一些實(shi)施方案中(zhong)，納米抗體包(bao)含(han)框架(jia)(jia)4，所述框架(jia)(jia)4包(bao)含(han)：a)

53、wgqgaqvtvss(seq?id?no：67)；b)wgqgtqvtvss(seq?id?no：65)；或(huo)c)

54、wgqgiqvtvss(seq?id?no：69)。

55、在一些實施方案(an)中，納米抗體包含(han)seq?id?no.2至53中任一者的氨基(ji)酸(suan)(suan)序(xu)列。在一些實施方案(an)中，納米抗體包含(han)seq?id?no：3的氨基(ji)酸(suan)(suan)序(xu)列。

56、在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，納(na)(na)米抗(kang)體(ti)(ti)(ti)與(yu)載(zai)物(wu)分(fen)子(zi)(zi)(zi)(cargo?molecule)綴合。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，載(zai)物(wu)分(fen)子(zi)(zi)(zi)與(yu)納(na)(na)米抗(kang)體(ti)(ti)(ti)的n端(duan)或(huo)(huo)c端(duan)連接(jie)。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，載(zai)物(wu)分(fen)子(zi)(zi)(zi)是分(fen)子(zi)(zi)(zi)成(cheng)像探針、藥(yao)物(wu)、毒素、抗(kang)體(ti)(ti)(ti)、細(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)(zi)(zi)、酶(mei)(例(li)如，ecm修(xiu)(xiu)飾(shi)酶(mei))、car細(xi)胞(bao)(bao)例(li)如car-t細(xi)胞(bao)(bao)、放射性(xing)同(tong)位素、蛋白質或(huo)(huo)納(na)(na)米粒(li)。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，納(na)(na)米抗(kang)體(ti)(ti)(ti)與(yu)載(zai)體(ti)(ti)(ti)連接(jie)或(huo)(huo)與(yu)載(zai)體(ti)(ti)(ti)締合。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，載(zai)體(ti)(ti)(ti)是納(na)(na)米粒(li)。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，載(zai)體(ti)(ti)(ti)還包含載(zai)物(wu)分(fen)子(zi)(zi)(zi)。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，載(zai)物(wu)分(fen)子(zi)(zi)(zi)選自(zi)藥(yao)物(wu)、毒素、抗(kang)體(ti)(ti)(ti)、細(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)(zi)(zi)、核酸、sirna、shrna、經修(xiu)(xiu)飾(shi)mrna、dna、寡核苷酸、crispr?cas9試劑和成(cheng)像探針。在(zai)一(yi)(yi)(yi)(yi)些(xie)實施方(fang)案(an)(an)中(zhong)(zhong)，載(zai)物(wu)分(fen)子(zi)(zi)(zi)是選自(zi)il-2、il-6、il-8、il-10、il-12、il-15、il-18、tnf、lfng、ifnb、ifna和趨化因(yin)子(zi)(zi)(zi)或(huo)(huo)其突變體(ti)(ti)(ti)的細(xi)胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)(zi)(zi)。

57、在一(yi)個方面(mian)中(zhong)，本公開(kai)內容提(ti)供(gong)了藥物組合物，其包含本公開(kai)內容的納(na)米抗體以(yi)及(ji)可藥用(yong)載體。

58、在一個方面中，本公(gong)(gong)開內(nei)容提(ti)供了包含編碼本公(gong)(gong)開內(nei)容納米抗(kang)體(ti)的(de)核酸(suan)序(xu)列的(de)核酸(suan)。本公(gong)(gong)開內(nei)容還(huan)提(ti)供了包含本公(gong)(gong)開內(nei)容核酸(suan)的(de)載(zai)體(ti)和包含本公(gong)(gong)開內(nei)容核酸(suan)或(huo)載(zai)體(ti)的(de)細胞。本公(gong)(gong)開內(nei)容還(huan)提(ti)供了用(yong)于產生納米抗(kang)體(ti)的(de)方法，其包括(kuo)(i)在適于允許表達納米抗(kang)體(ti)的(de)條件下培養包含本公(gong)(gong)開內(nei)容的(de)核酸(suan)或(huo)載(zai)體(ti)的(de)細胞，和(ii)回收所表達的(de)納米抗(kang)體(ti)。

59、在一個方面中，本公(gong)開內容(rong)提供了治療與纖連(lian)蛋(dan)白例如含(han)eiiib的(de)纖連(lian)蛋(dan)白相關(guan)的(de)疾病或病癥的(de)方法，其(qi)包括(kuo)向有此需要的(de)對象施用有效(xiao)量的(de)本公(gong)開內容(rong)的(de)納米抗體或藥物組(zu)合物。

60、在一個方(fang)(fang)面中，本公開內(nei)容提供了方(fang)(fang)法，其包括向患有與纖(xian)連蛋白相關的(de)(de)疾病或病癥的(de)(de)對象施用有效量的(de)(de)與載物(wu)分子(zi)綴(zhui)合的(de)(de)本公開內(nei)容的(de)(de)納米抗體，以(yi)將載物(wu)分子(zi)遞送至病變組織的(de)(de)胞(bao)外基質。

61、在(zai)(zai)一些(xie)實(shi)施(shi)方案中，該方法包括在(zai)(zai)對象中確定纖連(lian)蛋白(bai)的eiiib結構域的存(cun)在(zai)(zai)或不(bu)存(cun)在(zai)(zai)，以及確定對象是否患(huan)有與纖連(lian)蛋白(bai)相關的疾病或病癥。

62、在一些實施方案(an)中(zhong)，該(gai)方法包括通過隨時間推(tui)移測量纖連蛋白(bai)的(de)eiiib結構域的(de)存在或(huo)(huo)不(bu)存在來追(zhui)蹤(zong)與纖連蛋白(bai)相關(guan)的(de)疾病或(huo)(huo)病癥的(de)進展。

63、在(zai)(zai)(zai)一(yi)些實(shi)施方案中(zhong)(zhong)(zhong)，該方法包括(kuo)在(zai)(zai)(zai)第一(yi)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)點(dian)和第二(er)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)點(dian)測量從對象中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)離的(de)(de)組(zu)織樣(yang)品中(zhong)(zhong)(zhong)纖(xian)(xian)連蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)eiiib結構域的(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)(zai)或(huo)不存(cun)在(zai)(zai)(zai)，并基于在(zai)(zai)(zai)第一(yi)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)點(dian)和第二(er)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)點(dian)纖(xian)(xian)連蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)eiiib結構域的(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)(zai)或(huo)不存(cun)在(zai)(zai)(zai)的(de)(de)變化來確(que)定(ding)疾(ji)病(bing)或(huo)病(bing)癥(zheng)(zheng)向晚(wan)(wan)期(qi)階(jie)段的(de)(de)進(jin)(jin)展，其中(zhong)(zhong)(zhong)i)當纖(xian)(xian)連蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)eiiib結構域以較高水(shui)(shui)平存(cun)在(zai)(zai)(zai)于來自第二(er)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)點(dian)的(de)(de)分(fen)離的(de)(de)組(zu)織樣(yang)品中(zhong)(zhong)(zhong)時(shi)(shi)(shi)，疾(ji)病(bing)或(huo)病(bing)癥(zheng)(zheng)已進(jin)(jin)展至晚(wan)(wan)期(qi)階(jie)段，和ii)當纖(xian)(xian)連蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)eiiib結構域以較低水(shui)(shui)平存(cun)在(zai)(zai)(zai)于來自第二(er)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)點(dian)的(de)(de)分(fen)離的(de)(de)組(zu)織樣(yang)品中(zhong)(zhong)(zhong)時(shi)(shi)(shi)，疾(ji)病(bing)或(huo)病(bing)癥(zheng)(zheng)已消退至較不晚(wan)(wan)期(qi)階(jie)段。

64、在(zai)一些(xie)(xie)實(shi)施方(fang)案中(zhong)，疾病(bing)或(huo)病(bing)癥(zheng)是(shi)癌(ai)(ai)(ai)癥(zheng)、心(xin)血管疾病(bing)、炎性障礙或(huo)纖維化。在(zai)一些(xie)(xie)實(shi)施方(fang)案中(zhong)，癌(ai)(ai)(ai)癥(zheng)是(shi)轉移性癌(ai)(ai)(ai)癥(zheng)。在(zai)一些(xie)(xie)實(shi)施方(fang)案中(zhong)，癌(ai)(ai)(ai)癥(zheng)是(shi)黑(hei)素(su)瘤、乳腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)或(huo)胰腺(xian)癌(ai)(ai)(ai)。

65、在一(yi)些實施方案中，施用是靜脈(mo)內(nei)(nei)、瘤(liu)內(nei)(nei)、皮下、肌內(nei)(nei)、皮內(nei)(nei)、腹(fu)膜內(nei)(nei)、鼻內(nei)(nei)、氣管內(nei)(nei)、鞘內(nei)(nei)、顱內(nei)(nei)、腹(fu)膜內(nei)(nei)、經直腸、經鼻或經口(kou)。

66、在一些(xie)方(fang)面中，提供了納(na)米(mi)抗體細(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)融合(he)蛋(dan)白，其(qi)包含與(yu)細(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)融合(he)的特(te)異性結合(he)纖連蛋(dan)白的eiiib結構域的納(na)米(mi)抗體。在一些(xie)實施方(fang)案中，細(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)選自il-2、il-6、il-8、il-10、il-12、il-18、tnf、ifn-γ、ifn-β、趨化(hua)因(yin)子(zi)和ifn-α及(ji)其(qi)突變體。

67、在(zai)一(yi)些(xie)實施(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)細(xi)(xi)胞因子(zi)融合蛋(dan)白(bai)包含與細(xi)(xi)胞因子(zi)融合的(de)至少兩個(ge)納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)。在(zai)一(yi)些(xie)實施(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)細(xi)(xi)胞因子(zi)融合蛋(dan)白(bai)包含與細(xi)(xi)胞因子(zi)融合的(de)2至25個(ge)納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)。在(zai)一(yi)些(xie)實施(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)包括同(tong)一(yi)納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)的(de)多個(ge)拷貝。在(zai)一(yi)些(xie)實施(shi)方(fang)(fang)案中(zhong)(zhong)(zhong)，納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)包含至少2個(ge)不同(tong)的(de)納(na)米(mi)(mi)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)。

68、在一些(xie)實(shi)施(shi)(shi)方(fang)案(an)中(zhong)，納米抗(kang)(kang)體細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)融合(he)蛋白包含(han)與(yu)納米抗(kang)(kang)體融合(he)的(de)(de)至少(shao)兩個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)。在一些(xie)實(shi)施(shi)(shi)方(fang)案(an)中(zhong)，至少(shao)兩個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)與(yu)納米抗(kang)(kang)體的(de)(de)末(mo)端(duan)端(duan)部(bu)連接。在一些(xie)實(shi)施(shi)(shi)方(fang)案(an)中(zhong)，至少(shao)兩個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)是相同的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)。在一些(xie)實(shi)施(shi)(shi)方(fang)案(an)中(zhong)，至少(shao)兩個(ge)細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)是兩個(ge)不同的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子(zi)。

69、在一(yi)些實施方案中，納(na)米抗體細胞因子(zi)融合蛋(dan)白還包(bao)含白蛋(dan)白。