專利名稱：聚乙二醇醛衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及聚乙二醇醛，并涉及制備和使用該衍生物的方法，例如在多肽與其它生物分子的聚乙二醇化(pegylation)中。
聚乙二醇是直鏈或支化的聚醚，可以以各種分子量獲得。PEG的結構為HO-(CH2-CH2-O)n-H，其中n表示PEG中環氧乙烷單元的重復數。
PEG和PEG衍生物已經用于改性多種生物分子。當連接到這類分子上時，PEG提高它們的溶解度并增大它們的尺寸，但對期望的性質僅有很小的影響。有利地，與生物分子結合的PEG在體內可以表現出增加的保留和延遲的新陳代謝。
已經為這些應用開發了多種PEG衍生物。這些PEG衍生物例如描述在US5,252,714、US5,672,662、US5,959,265、US5,990,237、US6,340,742中。
已經將兩種通用方法用于PEG的官能化(1)通過一系列反應將終端羥基基團改變為更具活性的官能團和/或(2)PEG在受控條件下與雙官能化合物反應，以使雙官能化合物的官能團之一與PEG聚合物反應而另一個官能團保持活性。在大多數情況下，必須進行若干步驟以獲得期望的PEG衍生物。期望的PEG衍生物經常以低收率生產并且需要復雜的純化過程進行分離。而且，PEG衍生物可能表現出對所關注的生物分子的非特異性連接，這會導致多個PEG連接到單一生物分子上和/或PEG在活性位點上的連接。多重PEG連接會在聚乙二醇化(pegylated)的生物分子的純化中引起困難。多重PEG連接和/或活性位點上的聚乙二醇化也會導致生物分子活性降低。
因此，提供適合與各種其它分子(包括多肽和其它含α-氨基的生物分子)結合的改良的PEG衍生物會是有利的。仍然需要提供能以高收率和高純度生產并能結合用以提供具有改善的性能的生物分子的PEG衍生物。
以下更詳細地描述本發明的這些和其它目的。
本發明的化合物是聚乙二醇的醛衍生物，具有通式(I)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1是封端基團，X是O或NH，Y選自 Z是氨基酸的側鏈，m為1至17，n為10至10000，p為1至3。
本發明還提供了式(II)的化合物 其中R1、m、n和p定義如上。
本發明的另一優選實施方案提供了一種式(VIII)的雙官能聚乙二醇醛化合物 其中R1、m、n和p定義如上。
本發明還提供了式(IX)的中間化合物R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定義如上。
本發明進一步提供了式(X)的中間化合物
其中R1、m、n和p定義如上。
還提供了式(XI)的中間化合物 其中每個m、n和p相同或不同并定義如上。
本發明進一步提供了一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(IX)的化合物以生成式(I)的聚乙二醇醛R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO (I)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定義如上。
如果本發明涉及“制備方法”，也是指“制備過程”。
本發明還提供了一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(X)的化合物以生成式(II)的聚乙二醇醛 其中R1、m、n和p定義如上。
本發明提供了一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(XVII)的化合物以生成式(VIII)的聚乙二醇醛
其中m、n和p定義如上。
本發明提供了多種化合物和化學中間體以及可用于涉及多肽和其它生物分子的聚乙二醇化的方法。本發明提供了一種新的聚乙二醇醛化學結構。
本發明的化合物是聚乙二醇的醛衍生物，具有通式(I)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1是封端基團，X是O或NH，Y選自 Z是氨基酸的側鏈，m為1至17，n為10至10000，p為1至3。
此處所用的R1“封端基團”是任何適宜的化學基團，取決于優先選擇，其對其它化學部份是通常無活性或者通常活性的。上式的終端醛基使其能夠容易地共價連接到所關注的化學部份上，例如連接到多肽的α-氨基上。選擇R1封端基團以允許或防止雙官能度地(例如通過共價鍵)連接到所關注的第二化學部份上。
在封端基團對其它化學部份通常無活性的情形中，R1是相對惰性的。如果R1是相對惰性的，那么所得聚乙二醇醛的結構是單官能的，并因此僅與一個所關注的化學部份共價鍵連。適宜的通常無活性的R1封端基團包括氫、羥基、低級烷基、低級烷氧基、低級環烷基、低級鏈烯基、低級環烯基、芳基和雜芳基。
此處所用的術語“低級烷烴”是指含1至7個、優選1至4個碳原子的取代或未取代的、直鏈或支化的烷基基團，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基以及類似物。
術語“低級烷氧基”是指通過氧原子鍵連的以上定義的低級烷基，低級烷氧基的例子為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基以及類似物。
術語“低級環烷基”是指含3至7個、優選4至6個碳原子的取代或未取代的環烷基基團，例如，環丙基、環丁基、環戊基、環己基或環庚基。
此處所用的術語“低級鏈烯基”是指含2至7個、優選2至5個碳原子的取代或未取代的、直鏈或支化的鏈烯基基團，例如乙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基以及類似物。
術語“低級環烯基”是指含4至7個碳原子的取代或未取代的環烯基基團，例如環丁烯基、環戊烯基、環己烯基以及類似物。
術語“芳基”是指苯基或萘基，其為未取代的或可由鹵素、低級烷基、低級烷氧基、三氟甲基、羥基、羧酸、羧酸酯、硝基、氨基或苯基單-或多-取代，特別是由鹵素、低級烷基、低級烷氧基、三氟甲基、羥基、硝基、氨基和苯基取代。
術語“雜芳基”是指含一個或多個選自N、S和O的雜原子的5-或6-員雜芳香族基團。
優選的通常無活性的R1封端基團包括甲氧基、羥基或芐氧基。尤其優選的R1封端基團是甲氧基。當R1是甲氧基時，有時將醛及相關化合物稱為“mPEG”化合物，其中m代表甲氧基。
如果R1封端基團與其它化學部份是通常活性的，那么R1是能與一些其它官能團例如肽和蛋白質中的胺和/或巰基反應的官能團。在這種情形下，R1可以是與那些需要強的催化劑或極不切實際的反應條件來進行反應的基團相比，能容易地與其它分子上的親電或親核基團反應的官能團。如果R1是相對活性的，那么聚乙二醇醛是雙官能的并由此可以與兩個化學部份共價鍵連。
適宜的通常活性的R1封端基團的例子包括鹵素、環氧化物、馬來酰亞胺、正吡啶基二硫化物(orthopyridiyl disulfide)、甲苯磺酸酯、異氰酸酯、水合肼、氰尿酰鹵、N-琥珀酰亞胺氧、磺基-N-琥珀酰亞胺氧、1-苯并三唑氧、1-咪唑氧、p-硝基苯氧、和 術語“鹵素”是指氟、氯、溴或碘。
優選的通常活性的R1封端基團為 這種R1基團被用來生成在聚乙二醇醛的兩端都帶有醛基的聚乙二醇醛。因此，所得聚乙二醇醛在兩端都表現出鍵連特性。然而，應理解這些雙官能化合物無需完全對稱，并且式中第一m、n和/或p和第二m、n和/或p可以相同或不同。然而優選化合物是對稱的，即所述兩個m具有相同的值、兩個n具有相同的值且兩個p具有相同的值、在本發明的化合物中X是O或NH。X優選是O。而且，Y選自 其中Z是氨基酸的側鏈。
在本發明中，m為1至17。在一個優選實施方案中，m為1至14。更優選m為1至7，更進一步優選m為1至4。最優選m為1。
在Y基團具有如下通式的情形中
Y基團表現出通過肽鍵與氨基酸成鍵。因此，當單個甘氨酸用作氨基酸時，該通式形成簡單如下的特定結構 當Z是CH3時，則氨基酸為丙氨酸。如果Z為CH2OH，則氨基酸為絲氨酸。
顯然，正如可從對以下各種氨基酸結構的分析所能理解的，當采用更多并且不同的氨基酸時，更復雜的結構也是可能的。優選僅用一種氨基酸。
丙氨酸 精氨酸天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸甘氨酸谷氨酰胺 谷氨酸組氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 賴氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 色氨酸酪氨酸 纈氨酸在本發明中，n為10至10000。在本發明的一個優選實施方案中，n為20至5000。優選地，n為從50至2500，甚至更優選n為從75至1000。最優選n為從100至750。
在本發明中，p為1至3。優選p為3。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
本發明包括但不限于下式II-VI的化合物的式I的化合物
優選R1封端部份是相對活性的，優選甲氧基、羥基和芐氧基。
本發明優選的化合物落在以上A組的范圍內。因此，本發明提供了一種式(II)的化合物 其中R1、m、n和p定義如上。
在一個優選的實施方案中，R1是甲氧基、m為1且n為100至750。更優選地，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
本發明的另一個優選實施方案提供了一種式(VIII)的雙官能聚乙二醇醛化合物 其中m、n和p定義如上。
在一個優選實施方案中，R1是甲氧基、m為1且n為100至750。更優選地，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
本發明也提供了可以轉化為上述本發明的聚乙二醇醛化合物的多種化學中間體。這些中間體包括式(IX)的化合物R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定義如上。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
本發明進一步提供了式(X)的化合物 其中R1、m、n和p定義如上。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
還提供了式(XI)的中間化合物
其中每個m、n和p相同或不同并定義如上。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
本發明的化合物可以用公知的試劑和方法，通過任何適宜的方法制備。然而，本發明提供了一種制備聚乙二醇醛的具體方法，包括水解式(IX)的化合物以生成式(I)的聚乙二醇醛R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定義如上。優選地，水解是酸催化的。適宜的催化用酸包括三氟乙酸、鹽酸、磷酸、硫酸和硝酸。優選該酸為三氟乙酸。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
式(II)的聚乙二醇醛化合物也可以通過任何適宜的方法制備。然而，作為例子，可如下制備式(II)的聚乙二醇醛化合物首先，干燥聚乙二醇。接著，使聚乙二醇與醋酸的鹵代衍生物反應。所得反應混合物水解生成PEG羧酸。另外，產物PEG羧酸也可以在干燥步驟后，從PEG的直接氧化得到。接著，用醛二乙縮醛的胺衍生物處理PEG羧酸生成PEG縮醛胺，其與鹵代羧酸反應生成式的聚乙二醇醛。然后收集并純化聚乙二醇醛產物。
可用任何適宜的方法收集和純化聚乙二醇醛產物。作為例子，可用二氯甲烷萃取聚乙二醇醛產物。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾并真空干燥收集產物PEG醛。
由此本發明提供了一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(X)的化合物以生成式(II)的聚乙二醇醛 其中R1、m、n和p定義如上。
式(X)的化合物可以通過使式(XII)的化合物與式(XIII)的化合物反應制備R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH(XII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIII)另一種制備PEG酸或PEG羧酸的方法是直接氧化法。在這種情形中，可以使用氧化劑例如在釩酸銨或Jone試劑(CrO3和H2SO4)存在下的HNO3、CrO3或K2Cr2O7/H2SO4。
式(XII)的化合物可以通過水解式(XIV)的化合物制備R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XIV)其中R3是支化或未支化的C1-C4烷基。
式(XIV)的化合物可以通過使式(XV)的化合物與式(XVI)的化合物反應得到R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH (XV)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是鹵素。優選R2是溴或氯。適宜的式(XVI)化合物包括溴乙酸叔丁酯、溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、氯乙酸叔丁酯、氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯。適用于此反應步驟，即用來代替式(XVI)的其它試劑，例如為在叔丁醇鉀、堿金屬氫化物例如氫化鈉或萘基鉀(potassium naphtalide)存在下的溴乙酸叔丁酯、溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、氯乙酸叔丁酯、氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯。式(XVI)化合物優選為溴乙酸叔丁酯。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
式(III)-(VI)的化合物(也分別標識為組B-E)同樣可以用任何適宜的方法制備。然而，作為例子可以采用以下反應方案制備(III)-(VI)(組B-E)的化合物。
如上對聚乙二醇醛的論述，雙官能聚乙二醇醛可通過任何適宜的方法制造。本發明提供了一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(XVII)的化合物以生成式(VIII)的聚乙二醇醛 其中m、n和p定義如上。
式(VI)的化合物可以通過使式(XVIII)的化合物與式(XIX)的化合物反應制備HOOC-(CH2)m-O-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH (XVIII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIX)式(XVIII)化合物可以通過水解式(XX)的化合物得到
R3OOC-(CH2)m-CH2CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XX)其中R3為支化或非支化的C1-C4烷基。
式(XX)的化合物可以通過使式(XXI)的化合物與式(XVI)的化合物進行反應來制備HO-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH (XXI)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是鹵素。
可將以上論述的本發明的聚乙二醇醛組合物采用任何適宜的方法用于衍生多種分子，包括生物分子。
本發明的PEG醛化合物對于肽和其它生物分子的聚乙二醇化是N-終端位點特異性的。本發明的PEG醛與生物分子或蛋白質的N-終端α-氫基結合，在PEG與生物分子或蛋白質之間形成穩定的次級胺連接。
使用本發明的PEG醛聚乙二醇化的生物分子表現出PEG連接的數量和位置的可重復性，從而使得純化方案較不復雜。這種位點特異性聚乙二醇化能形成這樣的結合，即其中聚乙二醇化位點遠離生物分子或肽鍵連到細胞受體的位點，使得聚乙二醇化的生物分子、蛋白質或肽保持其很多或全部生物活性。本發明的PEG醛能與任何含α-氨基的生物分子反應。
取決于所選擇的聚乙二醇醛，聚乙二醇可以共價鍵連到生物分子的一端(單官能聚乙二醇醛)或兩端(雙官能聚乙二醇醛)。
如所述的，本發明的聚乙二醇醛可用于N-終端位點特異性聚乙二醇化。位點特異性N-終端連接形成了聚乙二醇化的多肽，避免了單一多肽的交聯和多重衍生。為形成這種位點特異性共價連接，可以任何采用適宜的反應條件。通常，反應混合物的pH對于活化待聚乙二醇化的多肽的α-氨基酸而言足夠酸性。典型地，pH為約5.5至約7.4，優選約6.5。
因此，一種將聚乙二醇分子連接到多肽上的方法包括使至少一種式(XXII)的多肽與式(I)的聚乙二醇醛分子反應以制備式(XXIII)的化合物
NH2B (XXII)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-NHB(XXIII)式(I)中R1、X、Y、Z、m、n和p定義如上；式(XXIII)中聚乙二醇醛分子與所提供的多肽的N-終端氨基鍵連。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
式(XXII)的化合物可以是任何多肽，包括干擾素-α、干擾素-β、consensus interferon、紅細胞生長素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(包括IL-2、IL-10、IL-12)以及集落刺激因子。
式(XXII)的化合物也可以是免疫球蛋白，例如lgG、lgE、lgM、lgA、lgD、其亞型及其片段。術語“抗體”或“抗體片段”是指多克隆和單克隆抗體、完整的免疫球蛋白或抗體或與目的抗原結合的免疫球蛋白分子的任何功能片段。該抗體片段的例子包括Fv(可變片段)、單鏈Fv、互補決定簇(CDR)、VL(輕鏈可變區)、VH(重鏈可變區)、Fab(抗原結合片段)、F(ab)2’，及其任何組合或能與目的抗原結合的免疫球蛋白肽的其它任何官能團。
如所述的，可以任何期望的方式制備聚乙二醇化的化合物。應當選擇有利于α-氨基位點特異性聚乙二醇化的條件，例如pH。
通常，可以通過以1∶1至1∶100的摩爾比添加式(XXII)的化合物和PEG試劑使多肽與本發明的聚乙二醇化合物聚乙二醇化。然后可將反應濃縮物置于室溫或4攝氏度、pH為5.5至9.0的硼酸鹽、磷酸鹽或tri緩沖液中約.5至24小時。PEG試劑與肽/蛋白質的摩爾比通常為1∶1至100∶1。肽/蛋白質的濃度通常為1至10mg/ml。緩沖液的濃度通常為10至500mM。
可以任何期望的方式分離和純化聚乙二醇化的化合物。作為例子，所得反應混合物可用平衡緩沖液(20mM Tris，pH 7.5)稀釋，然后將所得化合物加到Q-Sepharose柱上。在將混合物加到QA柱上之后，用平衡緩沖溶液洗滌用75M的NaCl洗脫、用200mM的NaCl洗脫、用1M NaCl洗脫、再用1M HOAC+1M NaCl和0.5NaOH再生。通過使用反相HPLC，可以從混合物中的其它副產物中分離并分出N-終端單聚乙二醇化的產物。然后可用基質輔助激光脫附/飛行質譜的離子化時間(Matrix AssistedLaser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry)(MALDI-TOF)確認收集的每種產物。
在本發明聚乙二醇化方法的一個優選實施方案中，式(XXII)的多肽與式(II)的聚乙二醇醛分子反應以制備式(XXIV)的化合物NH2B (XXII)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CHO(II)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-NHB(XXIV)式(II)中R1、m、n和p定義如上；式(XXIV)中聚乙二醇醛分子與多肽的N-終端氨基連接。
在優選實施方案中，p是3、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是2、R1是甲氧基、m為1且n為100至750；或p是1、R1是甲氧基、m為1且n為100至750。
本發明化合物用途的其它說明披露在共同提交的美國專利申請中，即2002年7月24日提交、美國序列號No.60/398,195、題為“聚乙二醇化的T20多肽”；2002年7月24日提交、美國序列號No.60/398,190、題為“聚乙二醇化的T1249多肽”以及2003年1月10日提交、美國序列號No.60/439,213、題為“聚乙二醇化的T20多肽”，此處將其全文引入作為參考。
本發明進一步提供了一種將聚乙二醇分子連接到多肽上的方法，包括使式(XXII)的多肽與式(VIII)的聚乙二醇醛分子反應以制備式(XXV)的化合物
NH2B(XXII) 式(VIII)中每個m、n和p相同或不同并且定義如上；式(XXV)中聚乙二醇醛分子與多肽的N-終端氨基鍵連。
在優選實施方案中，p是3、m為1且n為100至750；或p是2、m為1且n為100至750；或p是1、m為1且n為100至750。
可以任何期望的方式使用聚乙二醇化的多肽。然而，適宜的是通過與制藥上可接受的的賦形劑混合，將其用于制備藥物組合物。這些藥物組合物可以是單位劑量的形式。它們可以是可注射的溶液或懸浮液、透皮給藥裝置或任何其它期望的形式。
以下實施例旨在進一步描述本發明。這些實施例僅用于說明而不希望以任何方式限制本發明的范圍。
實施例實施例1.PEG醛化合物的制備將50至100ml甲苯中的5克PEG(分子量1000至60000道爾頓)通過回流共沸干燥1至3小時，接著除去20至30ml甲苯。將所得溶液冷卻至室溫，然后將在20-50ml絕對叔丁醇與20-50ml甲苯中的叔丁醇鉀(過量1至10摩爾)加入該PEG溶液。隨后在氬氣氛中在室溫下攪拌所得混合物兩小時。
用注射器將溴乙酸叔丁酯(過量1至10摩爾)加入反應中，在氬氣氛中在室溫下攪拌反應混合物過夜。取決于所期望的式(XVI)中定義的“m”基團的大小，可用另一種乙酸(例如丙酸、丁酸等)的鹵代衍生物代替溴乙酸叔丁酯。
然后通過旋轉蒸發濃縮反應溶液，通過加入乙醚使剩余物沉淀。濾出并在真空中干燥沉淀產物PEG羧基叔丁酯。
然后將PEG羧基叔丁酯(4g)溶解在50-100ml 1N氫氧化鈉中，在室溫下攪拌溶液過夜。加入1至6N鹽酸調節混合物的pH至2.5至3.0，并用二氯甲烷萃取混合物。然后將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并沉淀到乙醚中。通過過濾和在真空下干燥收集產物PEG羧酸。
然后將PEG羧酸(3g)溶解在無水二氯甲烷(20-30ml)中，隨后加入4-氨基丁醛二乙縮醛(過量1-5摩爾)、1-羥基苯并三唑(過量1-5摩爾)和二環己基碳二亞胺(過量1-5摩爾)。取決于式(XIII)中定義的“p”基團的期望的大小，可用另一種醛二乙縮醛的胺衍生物，例如3-氨基丙醛二乙縮醛或2氨基乙醛二乙縮醛，代替4-氨基丁醛二乙縮醛。
在氬氣氛中在室溫下攪拌所得混合物過夜。將反應混合物過濾、濃縮、用2-丙醇與乙醚(1∶1)的混合物沉淀。真空干燥PEG縮醛產物過夜。
然后將PEG縮醛產物溶解在10-200ml 1-90％的CF3COOH中，在室溫下攪拌溶液過夜。加入1N NaOH溶液調節混合物的pH值至6.0，然后加入氯化鈉(10重量％)，再加入1N NaOH溶液調節混合物的pH值至7.0。隨后用二氯甲烷萃取混合物。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和真空干燥收集產物PEG醛。
實施例2.mPEG10k-丁醛的制備以下代表制備本發明mPEG10k-丁醛(mPEG10k-butanoaldehyde)的總體反應方案
mPEG10k-丁醛的反應方案 首先，將300ml甲苯中的分子量為10000道爾頓的羧甲基PEG(30.0g，3mmol)通過回流共沸干燥2小時，接著除去100ml甲苯。將所得溶液冷卻至室溫，然后將在20ml絕對叔丁醇與20ml甲苯中的叔丁醇鉀(0.68g，6mmol)加入PEG溶液(1)。在氬氣氛中在室溫下攪拌所得混合物兩小時。
用注射器將溴乙酸叔丁酯(1.00ml，6.75mmol)加入反應中，在氬氣氛中在室溫下攪拌反應混合物過夜。然后通過旋轉蒸發濃縮反應溶液，加入乙醚使剩余物沉淀。濾出并在真空中干燥沉淀的產物。產量28g。NMR(d6-DMSO)1.40ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.96ppm(s，2H，-O-CH2-COO-)。
接著，將mPEG10k羧甲基叔丁酯(20g)溶解在200ml 1N氫氧化鈉中，在室溫下攪拌溶液過夜(2)。加入6N鹽酸調節混合物的pH至2.5，并用二氯甲烷(50ml、40ml和30ml)萃取混合物。然后將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和在真空下干燥收集產物m-PEG10k-羧甲基酸。產量18g。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH-)。
然后將mPEG10k-羧甲基酸(3g，0.3mmol)溶解在無水二氯甲烷(20ml)中，隨后加入4-氨基丁醛二乙縮醛(50mg，0.3mmol)、1-羥基苯并三唑(40mg，0.3mmol)和二環己基碳二亞胺(80mg，0.39mmol)(3)。在氬氣氛中在室溫下攪拌所得混合物過夜。將反應混合物過濾、濃縮、用2-丙醇與乙醚(1∶1)的混合物沉淀。真空干燥mPEG10k丁醛二乙縮醛產物過夜。產量2.7g。NMR(d6-DMSO)1.07-1.12ppm(t，6H，-(-O-CH2-CH3)2)；1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。
最后，將mPEG10k丁醛二乙縮醛(5g，0.5mmol)溶解在50ml 10％CF3COOH中，在室溫下攪拌溶液過夜(4)。加入1N NaOH溶液調節混合物的pH值至6.0，然后加入氯化鈉(10重量％)，再加入1N NaOH溶液調節混合物的pH值至7.0。隨后用二氯甲烷萃取混合物。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并沉淀到乙醚中。通過過濾和真空干燥收集產物mPEG10k-丁醛(5)。產量4.1g。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。
實施例3.mPEG10k-縮醛醛的制備通過將按照實施例1中的步驟制備的mPEG10k-醛二乙縮醛(1g，分子量10000)溶解在10ml 80％三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制備mPEG10k-縮醛醛。在氬氣氛中在室溫下攪拌反應溶液過夜。然后滴加1N NaOH到反應溶液中直到獲得6.0的pH值。接著，將NaCl(10重量％)加到以上溶液中，然后加入1N NaOH調節pH至6.95±0.05。接著用二氯甲烷萃取溶液。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和真空干燥收集產物mPEG10k-縮醛醛。產量0.85g(85％)。
實施例4.mPEG10k-丙醛的制備通過將按照實施例1中的步驟制備的mPEG10k-丙醛乙縮醛(2g，分子量10000)溶解在20ml 80％三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制備mPEG10k-丙醛。在氬氣氛中在室溫下攪拌反應溶液過夜。然后滴加1N NaOH到反應溶液中直到獲得6.0的pH值。接著，將NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入1N NaOH調節pH至6.95±0.05。接著用二氯甲烷萃取溶液。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和真空干燥收集產物mPEG10k-丙醛。產量1.8g(90％)。
實施例5.PEG20k-二丁醛的制備通過將按照實施例1中的步驟制備的PEG20k-二丁醛二乙縮醛(3.1g，分子量20000)溶解在20ml 80％的三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制備PEG20k-二丁醛。在氬氣氛中在室溫下攪拌反應溶液過夜。然后滴加1NNaOH到反應溶液中直到獲得6.0的pH值。接著，將NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入0.1N NaOH調節pH至6.95±0.05。接著用二氯甲烷萃取溶液。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和真空干燥收集產物PEG20k-二丁醛。產量2.5g(81％)。
實施例6.mPEG20k-丁醛的制備通過將按照實施例1中的步驟制備的mPEG20k-丁醛二乙縮醛(3.0g，分子量20000)溶解在30ml 80％的三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制備PEG20k-丁醛。在氬氣氛中在室溫下攪拌反應溶液過夜。然后滴加1N NaOH到反應溶液中直到獲得6.0的pH值。接著，將NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入1N NaOH調節pH至6.95±0.05。接著用二氯甲烷萃取溶液。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和真空干燥收集產物mPEG20k-丁醛。產量2.5g(83.3％)。
實施例7.mPEG20k-丁醛的制備通過將按照實施例1中的步驟制備的mPEG20k-丁醛二乙縮醛(14.7g，分子量20000)溶解在200ml 10％的三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制備PEG20k-丁醛。在氬氣氛中在室溫下攪拌反應溶液過夜。然后滴加1N NaOH到反應溶液中直到獲得6.0的pH值。接著，將NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入0.1N NaOH調節pH至6.95±0.05。接著用二氯甲烷萃取溶液。將有機層用硫酸鈉干燥、過濾、濃縮并用乙醚沉淀。通過過濾和真空干燥收集產物mPEG20k-丁醛。產量13.1g(89％)。
權利要求
1.一種式(I)的化合物R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO (I)其中R1是封端基團，X是O或NH，Y選自 Z是氨基酸的側鏈，m為1至17，n為10至10000，以及p為1至3。
2.權利要求1所述的化合物，其中R1選自鹵素、環氧化物、馬來酰亞胺、正吡啶基二硫化物、甲苯磺酸酯、異氰酸酯、水合肼、氰尿酰鹵、N-琥珀酰亞胺基氧、磺基-N-琥珀酰亞胺基氧、1-苯并三唑基氧、1-咪唑基氧、p-硝基苯基氧、和
3.權利要求1所述的化合物，具有式(III)
4.權利要求1所述的化合物，具有式(IV)
5.權利要求1所述的化合物，具有式(V)
6.權利要求1所述的化合物，具有式(VI)
7.權利要求1所述的化合物，具有式(II) 其中R1是封端基團，m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
8.權利要求7所述的化合物，其中p為3。
9.權利要求7所述的化合物，其中p為3，R1是甲氧基，m為1且n為100至750。
10.一種式(VIII)的化合物 其中m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
11.一種式(IX)的化合物R1-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)其中R1是封端基團，X是O或NH，Y選自 Z是氨基酸的側鏈，m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
12.一種式(X)的化合物 其中R1是封端基團，m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
13.一種式(XI)的化合物 其中m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
14.一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(IX)的化合物以生成式(I)的聚乙二醇醛R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1是封端基團，X是O或NH，Y選自 Z是氨基酸的側鏈，m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
15.一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(X)的化合物以生成式(II)的聚乙二醇醛 其中R1是封端基團，m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
16.權利要求15所述的方法，其中式(X)的化合物通過使式(XII)的化合物與式(XIII)的化合物反應制備R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH(XII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIII)
17.權利要求16所述的方法，其中式(XII)的化合物通過水解式(XIV)的化合物制備R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XIV)其中R3是支化或未支化的C1-C4烷基。
18.權利要求17所述的方法，其中式(XIV)的化合物通過式(XV)的化合物與式(XVI)的化合物的反應制備R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH(XV)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是鹵素。
19.一種制備聚乙二醇醛的方法，包括水解式(XVII)的化合物以生成式(VIII)的聚乙二醇醛 其中m為1至17，n為10至10000，且p為1至3。
20.權利要求19所述的方法，其中式(VIII)的化合物通過式(XVIII)的化合物與式(XIX)的化合物的反應制備HOOC-(CH2)m-O-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH (XVIII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIX)
21.權利要求20所述的方法，其中式(XVIII)化合物通過水解式(XX)的化合物制備R3OOC-(CH2)m-CH2CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XX)其中R3為支化或非支化的C1-C4烷基。
22.權利要求21所述的方法，其中式(XX)的化合物通過式(XXI)的化合物與式(XVI)的化合物的反應來制備HO-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH(XXI)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是鹵素。
全文摘要
本文提供了聚乙二醇醛化合物。還提供了制備和使用這類化合物的方法以及化學中間體。
文檔編號C08G65/331GK1671769SQ03817649
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月16日 優先權日2002年7月24日
發明者C-Y·王 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司