專利名稱：疏水性多組分肝素結合物,其制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及不溶于水但溶于特定有機溶劑的疏水性多組分肝素結合物，其制備方法及其應用。具體地，本發明涉及通過將聚合物和疏水物質與肝素共價結合而制備的疏水性多組分肝素結合物，其制備方法和應用，所述結合物作為抗血栓形成劑來用于治療病人。
背景血管壁的血栓抗性需要能夠兼容血小板和血漿凝固系統的內皮內層(endothelial lining)。不同于人造血管材料，在凝固過程中內皮內層不誘導絲氨酸蛋白酶活性。然而，當血液的凝固性增加時，內皮使凝血酶和其它可能的凝固因子失活。通常，已知凝血酶的嵌入點(inflow site)是在內皮細胞的表面(B.Awbrey等.J.Biol.Chem.，254，4092-4095，1979)，并且已知內皮細胞上的葡糖胺多糖層也存在凝血酶結合位點。有報道稱如果這些凝血酶結合位點結合了酶例如絲氨酸蛋白酶，則這些酶在血清中被抗凝血酶III滅活(C.Busch等.，J. Clin.Invest.，69，726-729，1982；M.Dryjski等.，Thromb.Res.，32，355-363，1983)。
報道了在肝素分子中存在抗凝血酶結合的類似結構(J.A.Marcum等.，J.Clin.Invest.，74，341-350，1984；J.A.Marcum等.，Biochem.Biophys.Res.Comm.，126，365-372，1985)后，將肝素引入進或引入到固體物質表面以產生內皮樣血栓抗性性能的方法已被開發并商業化。通過使用肝素等已獲得內皮樣血栓抗性性能的人造表面可廣泛用于醫療技術的開發。
這些研究中，開發了各種使用肝素來提高大分子表面的血液兼容性的方法。Grode等通過氰尿酰氯和輻射接枝合成了肝素-硅橡膠(Grode等.，J.Biomed.Mater.Res.Symp.，3，77-84，1972)。Merrill等也合成了聚乙烯醇，其通過戊二醛交聯共價結合到肝素上(Merrill等.，J.Appl.Physiol.，29，723-728，1970)。Eriksson和Gillerg開發了交聯的肝素單體，其中通過肝素交聯和陽離子表面活性劑，帶負電荷的肝素被吸收在聚丙烯表面(Eriksson和Gillerg，J.Biomed.Mater.Res.，1，301-312，1967)。
Goosen和Sefton合成了肝素化的苯乙烯-丁二烯-苯乙烯高彈體(Goosen和Sefton，Thromb.Res.，20，543-554，1980)。以及，Miyura等設計了通過將肝素固定在瓊脂糖或多羥基甲基丙烯酸酯來延長血漿再鈣化的方法(Miyura等.，J.Biomed.Mater.Res.，14，619-630，1980)。
Jacobs等合成了肝素和前列腺素E1的共價結合絡合物(Jacobs等.，J.Biomed.Mater.Res.，23，611-630，1989)。上述肝素絡合物通過二氨基末端的聚乙烯氧化物固定在尿烷上，這一固定的絡合物對抑制凝血酶形成非常有效。Hennink等開發了肝素和人血清白蛋白的共價結合絡合物(Hennink等.，Thromb.Res.，29，1-13，1983)。該絡合物增加了與血液接觸的大分子表面的血液兼容性。
Nagaoka等報道了固定在大分子表面的聚乙烯氧化物(PEO)親水間隔臂(spacer)通過吸收血液蛋白和動態排斥抑制血小板粘附的動物試驗結果(Nagaoka等.，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs.，10，76-78，1987)。固定在肝素化表面的間隔臂對血小板粘附的抑制作用被Kim和Ebert證實(Kim和Ebert，Thromb Res.，26，43-57，1982)。他們證實固定的肝素的抗凝活性依照間隔臂的長度而增加。
同樣，Tay等提出1)長的間隔臂如PEO等使肝素與抗凝血酶III和凝血酶結合更容易；2)由聚乙烯醇末端基團連接的肝素比由肝素大分子非末端單元上的氨基連接的肝素更易接近；3)表面上的肝素單元阻止抗凝血酶III與凝血酶的增加(Tay等.，Biomaterials，10，11-15，1989)。
Schmer通過使用間隔臂如二氯硫化碳或碳二亞胺將肝素共價結合到瓊脂糖上(Schmer，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs.，18，321-324，1972)，這一間隔臂固定的肝素具有提高的與抗凝血酶III結合的能力。Danishefsky和Tzeng通過使用氨乙基間隔臂制備了肝素-瓊脂糖大分子(Danishefsky和Tzeng，Thromb.Res.，4，237-246，1974)。Park等通過使用PEO間隔臂將肝素固定在biomer上，他們報道了這類間隔臂的長度至少為3,400道爾頓以優化固定的肝素的抗凝活性(Park等.，J.Biomed.Mater.Res.，22，977-992，1988)。同樣，將肝素固定在間隔臂表面以優化抗凝活性和增加間隔臂的表面密度(Lin等.，J.Biomed.Mater.Res.，25，791-795，1991；Piao等.，Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs.，38，638-643，1992)。。
同樣，使用肝素的間隔臂系統也用于合成共聚物。合成了三嵌段共聚物例如PEO-PDMS-肝素和PDMS-PEO-肝素(Grainger等.，J.Biomed.Mater.Res.，22，231-249，1988)。包被在鏈段聚氨基甲酸酯表面上的上述三嵌段共聚物即使在低流動性下也能增加非血栓形成能力(nonthrombogenicity)。Vulic等報道了聚氨基甲酸酯-PEO-肝素的合成方法(Vulic等.，J，Polym，Sci，A，Polym.Chem.，26，381-391，1988)，其是溶劑澆鑄表面方法的改良方法。根據該方法，涂布是容易的，但合成肝素與聚氨基甲酸酯或聚乙二醇的絡合物卻不容易。并且，在合成過程中，它存在低效和需要大量溶劑以抑制肝素交聯的問題。
為克服前述和其他缺點，我們，本發明的發明人，開發了含肝素和疏水性大分子的肝素絡合物的合成方法，其中，肝素先與具有多官能團的大分子結合，然后與疏水物質結合。結果得到合成的不溶于水但溶于有機溶劑的疏水性多組分肝素結合物。最終，通過驗證該疏水性多組分肝素結合物能容易地涂布到所有含有大分子或金屬的醫療器械表面，并具有高的抗血栓形成活性，本發明得以實現。
發明摘要本發明的目的是提供不溶于水但溶于特定有機溶劑的疏水性多組分肝素結合物，其制備方法及其應用。


圖1b是用疏水性多組分肝素結合物包被的玻璃的圖片，表明用本發明的疏水性多組分肝素結合物改性的玻璃的血小板粘附實驗的結果。
圖2是表明血管導管的血液兼容性試驗結果的圖片，該血管導管表面用本發明的疏水性多組分肝素結合物改性。
(a)對照導管，(b)用疏水性多組分肝素結合物包被的導管。
優選實施方案的詳細描述為實現這些目標，本發明提供了疏水性多組分肝素結合物，其中肝素與大分子和疏水物質結合。
本發明也提供了一種制備疏水性多組分肝素結合物的方法。
本發明還提供了疏水性多組分肝素結合物作為涂層劑用于所有醫療器械和人造器官表面改性的應用。
在下文中，詳細描述了本發明。
本發明提供了疏水性多組分肝素結合物，其中肝素與大分子和疏水物質結合。
本發明的疏水性多組分肝素結合物是結合以包含多官能團的大分子的肝素，其中肝素和大分子的結合率可以被控制，并且肝素官能團中的胺基用于結合大分子。
肝素有羧基、羥基、磺酸基和胺基作為官能團。除胺基外的所有官能團處于抗血栓形成的活性位點，所以當這些官能團用于結合大分子時，這些肝素-大分子結合物將失去它們的抗血栓形成活性。
合成的大分子、蛋白質、生物聚合物和它們的混合物可用作含有前述多官能團的大分子。對于合成的大分子，可以使用聚二烯、聚烯、多炔、聚丙烯酸和它的衍生物、聚α-取代的丙烯酸和它的衍生物、聚乙烯醚類、聚乙烯醇、聚乙烯鹵化物、聚苯乙烯和它的衍生物、多氧化物類、聚醚、聚酯、聚碳酸酯類、聚酰胺類、聚氨基酸類、聚脲類、聚氨基甲酸酯類、聚亞胺類、聚硫化物類、多磷酸鹽、聚硅氧烷類、聚倍半硅氧烷類、聚雜環類、纖維素和它的衍生物、多糖及它們的共聚物或衍生物。對于蛋白質，可以使用魚精蛋白、多熔素、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和它的衍生物或共聚物。和，對于生物高聚物，可以使用多糖、明膠、骨膠原、藻酸鹽、透明質酸、藻酸、角叉菜聚糖、軟骨素、果膠脫乙酰殼多糖(pectin chitosan)和它的衍生物或共聚物。除上述提及的之外，所有含有多官能團的大分子均可使用。
本發明的疏水性多組分肝素結合物是通過將肝素和含有多官能團的大分子結合，然后又結合疏水物質來制備。結果，通過結合含有多官能團的許多大分子，肝素分子形成結合物，疏水物質結合于多官能團上。這樣，不參與結合的許多官能團能與疏水物質反應。最終，本發明的疏水性多組分肝素結合物具有疏水性，因為肝素結合了疏水大分子。
本發明的疏水性多組分肝素結合物不溶于水中，但溶于特定有機溶劑中，例如四氫呋喃和DMAC(二甲基乙酰胺)。這樣，本發明的疏水性多組分肝素結合物可以用溶劑蒸發的方法很容易地合成，并且通過浸涂或噴霧方法它們也能很容易地涂布到大分子或金屬表面。并且，對于臨床應用，由于它們的水不溶性，可穩定使用本發明的疏水性多組分肝素結合物。
本發明的疏水性多組分肝素結合物中的肝素即使被基質包被后仍保留它的抗血栓形成活性，因此它可以抑制可能出現在包被基質表面的血液凝固。因此，本發明的疏水性多組分肝素結合物提高了包被表面的抗血栓形成作用。另一方面，肝素含有很多陰離子，這樣當增加表面的水吸收能力時，顯著降低了包被表面的摩擦系數。因此，通過用本發明的疏水性多組分肝素結合物涂布來改性它們的表面，可提高與血液接觸的人造器官和醫療器械例如導管或插管的質量，從而使血栓引起的副作用最小化。
本發明還提供了一種疏水性多組分肝素結合物的制備方法，包括如下步驟1)大分子的活化步驟2)肝素與活化的大分子結合的步驟3)疏水物質與結合肝素的大分子官能團的結合步驟。
然而已有的方法是合成三嵌段共聚物，其中肝素與聚氨基甲酸酯和聚乙二醇結合，本發明的方法包括多步驟過程，包括接枝共聚物的合成，其中肝素與大分子和疏水物質結合。根據本發明，大分子本身不需要具有疏水性。疏水性多組分肝素結合物的結構不同于三嵌段共聚物的結構。三嵌段共聚物具有肝素結合于PEG-聚氨基甲酸酯鏈末端的形式，但是本發明的疏水性多組分肝素結合物具有含有多官能團的大分子與肝素本身結合，然后疏水物質與大分子官能團結合的形式。
作為第一步中的大分子，可使用合成的大分子、蛋白質、生物高聚物和它們的混合物。特別是，優選含有多官能團的大分子。可以使用聚二烯、聚烯、多炔、聚丙烯酸和它的衍生物、聚α-取代的丙烯酸和它的衍生物、聚乙烯醚類、聚乙烯醇、聚乙烯鹵化物、聚苯乙烯和它的衍生物、多氧化物類、聚醚、聚酯、聚碳酸酯類、聚酰胺類、聚氨基酸類、聚脲類、聚氨基甲酸酯類、聚亞胺類、聚硫化物類、多磷酸鹽、聚硅氧烷類、聚倍半硅氧烷類、聚雜環類、纖維素和它的衍生物、多糖及它們的共聚物或衍生物作為合成的大分子，和魚精蛋白、多熔素、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和它的衍生物或共聚物可用作蛋白質。另外，作為生物高聚物，可以使用多糖、明膠、骨膠原、藻酸鹽、透明質酸、藻酸、角叉菜聚糖、軟骨素、果膠脫乙酰殼多糖和它的衍生物或共聚物。此外，所有含有多官能團的大分子均可使用。
為活化上述大分子，在本發明的優選實施方案中，通過使用N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)活化大分子的羧基(COOH)，同樣，也可使用1-乙基-3-二甲基氨丙基-碳二亞胺氫氯化物(EDC)或4-對-疊氮水楊基酰氨基-丁胺(ASBA)。
在步驟2中，優選肝素的分子量為1,000-1,000,000道爾頓，可用相同的方法使用重組肝素、肝素衍生物和肝素類似物。通過使用羥基、胺基、硫醇基和疊氮基形成的共價鍵用于肝素與活化大分子的結合。優選共價鍵為非降解鍵例如酰胺鍵和氨基甲酸乙酯鍵，或可降解鍵例如酯鍵和酐鍵。
在步驟3中，優選與大分子結合的疏水物質的水溶性少于100mg/ml，并具有至少一個官能團。十八胺(ODA)，鏈烷胺(alkanoic amine)，膽汁酸，甾醇或鏈烷酸可用作疏水物質，可使用所有具有官能團和疏水性的其他物質。通過使用羥基、羧基、胺基、硫醇基和疊氮基形成的共價鍵用于使疏水物質與結合了肝素的大分子的官能團相結合。優選上述共價鍵是非降解鍵例如酰胺鍵和氨基甲酸乙酯鍵(urethane bond)，或可以是可降解鍵例如酯鍵和酐鍵本發明還提供了疏水性多組分肝素結合物的應用。如上述所提及，本發明的疏水性多組分肝素結合物能通過溶劑蒸發方法很容易地合成，并且它們也能通過浸涂或噴霧方法很容易地涂布到大分子或金屬表面。對于臨床應用，本發明的疏水性多組分肝素結合物由于它們的水不溶性而能被穩定地使用。
本發明的疏水性多組分肝素結合物包被的基質具有高的抗血栓形成活性，因為它能抑制血液凝固，并具有顯著降低包被表面的摩擦系數并增加表面的水吸收能力的性能。
因此，通過用本發明的疏水性多組分肝素結合物包被來改性它們的表面可改進人造器官和醫療器械例如與血液接觸的導管或插管，并通過使用本發明的疏水性多組分肝素結合物可最小化由血栓引起的副作用。
然而，可以理解，考慮在本公開的基礎上，那些本領域的技術人員可以在本發明的精神和范圍內進行修改和改進。實施例1肝素、聚丙烯酸和十八胺結合物的合成<1-1>聚丙烯酸的活化5g聚丙烯酸(在下文中表示為“PAA”)加入到250ml N，N-二甲基甲酰胺(在下文中表示為“DMF”)中并溶解，隨后在冰浴中冷卻。向上述混合溶液中，迅速加入溶解了15.5g N，N-二環己基碳二亞胺(在下文中表示為“DCC”)的25ml DMF溶液。在向上述混合物中迅速加入含8.7gN-羥基琥珀酰亞胺(在下文中表示為“HOSU”)的25ml DMF溶液后，經5分鐘攪拌后，DCC被活化。隨著反應的進行，N，N-二環己基脲(在下文中表示為“DCUrea”)逐漸生成并沉淀。反應24小時后，通過用0.2μm孔徑膜過濾除去DCUrea，并將混合溶液于5℃放置12小時，之后，用與上述相同的方式過濾并完全去除少量的殘留DCUrea。通過室溫蒸發溶劑，去除DMF。向上述溶液中，加入500ml甲醇并攪拌5小時，此后用0.2μm膜過濾除去未反應的DCC和HOSU殘余物。室溫下真空干燥6小時除去甲醇，最終得到8.7g白色粉末。<1-2>肝素-聚丙烯酸-十八胺結合物(肝素/PAA/ODA＝1∶1∶20，摩爾比)的合成將0.11g在上述實施例<1-1>中得到的活化的PAA溶解在100mlDMF中，5分鐘內向其中加入含有0.3g肝素的50ml蒸餾水。反應開始后30分鐘內，產生了沉淀—肝素和活化的PAA結合的中間產物，并且溶液變渾濁。5小時后，將含0.13g十八胺(在下文中表示為“ODA”)的350ml THF溶液5分鐘內逐漸加入到該溶液中，室溫放置反應5小時。通過上述步驟，開始產生白色沉淀并且在反應后30分鐘內完成該生成過程。反應完成后，400ml THF和蒸餾水通過室溫蒸發溶劑被從該溶液中除去，并通過用纖維素酯膜和丙酮作為溶劑經透析除去未反應的殘留ODA。隨后，用水替代丙酮并用0.45μm過濾膜過濾，以除去未反應的殘留肝素。將以上得到的白色沉淀真空干燥12小時。結果得到0.45g白色粉末。<1-3>肝素-聚丙烯酸-十八胺結合物(肝素/PAA/ODA＝1∶5∶100，摩爾比)的合成將0.55g在上述實施例<1-1>中得到的活化的PAA溶解在100ml DMF中，5分鐘內向其中加入含有0.3g肝素的50ml蒸餾水。反應開始后30分鐘內，產生了沉淀—肝素和活化的PAA結合的中間產物，并且溶液變渾濁。5小時后，將含0.67g ODA的350ml THF溶液5分鐘內緩慢加入到該溶液中，室溫放置反應5小時。通過上述步驟，產生白色沉淀并且在30分鐘內完成該生成過程。反應完成后，400ml THF和蒸餾水通過室溫蒸發溶劑被從上述溶液中除去，并通過用纖維素酯膜和丙酮作為溶劑經透析除去未反應的殘留ODA。隨后，用水替代丙酮溶劑并用0.45μm膜過濾，以除去未反應的肝素。將從此步驟得到的白色沉淀真空干燥12小時，得到1.1g白色粉末。<1-4>肝素-聚丙烯酸-十八胺結合物(肝素/PAA/ODA＝1∶10∶200，摩爾比)的合成將1.11g在上述實施例<1-1>中得到的活化的PAA溶解在100ml DMF中，5分鐘內向其中加入含有0.3g肝素的50ml蒸餾水。反應開始后30分鐘內，產生了沉淀—肝素和活化的PAA結合的中間產物，并且溶液變渾濁。5小時后，將溶解了1.35g ODA的350ml THF溶液5分鐘內逐漸加入到該溶液中，室溫放置反應5小時。最后，產生白色沉淀并且在30分鐘內完成該生成過程。反應完成后，400ml THF和蒸餾水通過室溫蒸發溶劑被從該混合溶液中除去，并同樣通過用纖維素酯膜和丙酮作為溶劑經透析除去未反應的ODA。隨后，用水替代丙酮溶劑并經0.45μm膜過濾除去未反應的肝素。將從此步驟得到的白色沉淀真空干燥12小時，得到2.0g白色粉末。實施例2肝素、魚精蛋白和脫氧膽酸結合物的合成<2-1>脫氧膽酸的活化11.8g脫氧膽酸(在下文中表示為“DOCA”)溶解在100ml DMF中，然后在冰浴中冷卻。向該混合溶液中迅速加入溶解了7.4g DOC的25mlDMF溶液。攪拌5分鐘，DCC被活化并向其中迅速加入溶解了4.14gHOSU的25ml DMF溶液。隨著反應的進行，DCUrea逐漸沉淀。反應24小時后，用0.2μm膜過濾除去DCUrea，并于5℃下放置該溶液12小時，之后通過與上述相同的方式過濾來完全除去少量的殘留DCUrea。100ml乙腈加入到DMF經室溫蒸發溶劑除去的反應液中，產生白色固體沉淀。經0.2μm膜過濾，隨后室溫下真空干燥5小時獲得該白色固體沉淀，得到12.5g活化的DOCA。<2-2>疏水魚精蛋白(魚精蛋白-DOCA)的合成將0.5g魚精蛋白溶解在50ml蒸餾水中，并向其中逐漸加入含有0.27g在上述實施例<2-1>中獲得的活化的DOCA的50ml DMF溶液。室溫放置該溶液5小時，同時進行了結合反應。通過在室溫下蒸發溶劑從上述混合溶液中除去DMF和蒸餾水，之后用100ml蒸餾水洗滌溶液三次以除去未反應的魚精蛋白，并得到白色固體沉淀。用100ml甲醇洗滌固體沉淀。通過用0.45μm膜過濾除去未反應的活化的DOCA后，通過真空干燥得到白色粉末。利用在100ml，1.0重量％乙醛溶液和在100ml，50％甲醇溶液中進行1小時封閉反應除去未反應的殘留魚精蛋白氨基酸殘基。反應完成后，用蒸餾水洗滌三次除去未反應的乙醛并真空干燥，得到0.55g DOCA部分偶合魚精蛋白的疏水魚精蛋白(魚精蛋白-DOCA)。<2-3>魚精蛋白-DOCA的酯化將0.5g上述實施例<2-2>中得到的活化的魚精蛋白-DOCA溶解在80ml DMF中，并立即加入含有1.5g DCC的10ml DMF溶液。攪拌5分鐘，DCC被活化并向其中加入含有0.84g HOSU的10ml DMF。隨著反應進行，少量DCUrea沉淀。室溫反應24小時后，DCUrea通過用0.2μm膜過濾除去，DMF也通過室溫下蒸發溶劑從上述溶液中除去。用100ml甲醇洗滌從那里獲得的白色粉末兩次，并用0.2μm膜過濾，以得到白色固體。室溫下真空干燥該固體5小時。結果，得到0.45g通過酯化活化的疏水魚精蛋白(魚精蛋白-DOCA)。<2-4>肝素-魚精蛋白-DOCA結合物的合成將0.5g在上述實施例<2-3>中得到的活化的魚精蛋白-DOCA溶解在100ml DMF溶液中，并加入含有0.92g肝素的50ml蒸餾水。反應開始后30分鐘內，通過縮合反應化合的沉積物被沉淀，沉積物在30分鐘內產生完全。反應繼續進行5小時，通過室溫下蒸發溶劑從上述反應溶液中除去蒸餾水和DMF，從而得到白色粉末。通過用纖維素酯膜和甲醇作為溶劑經透析除去未反應的活性魚精蛋白-DOCA。用水替代甲醇，用0.45μm膜過濾，除去未反應的肝素。將從那里得到的白色沉淀在室溫下真空干燥12小時，最后得到1.05g白色粉末。實施例3肝素、魚精蛋白和甘氨膽酸結合物的合成<3-1>甘氨膽酸的活化將9.3g甘氨膽酸(在下文中表示為“GOCA”)溶解在100ml DMF中，加入含6.6g DCC的25ml DMF溶液，攪拌5分鐘，DCC被活化并向其中加入溶解了3.7gHOSU的25ml DMF溶液。隨著酯化反應的進行，DCUrea逐漸出現并緩慢沉淀。室溫反應24小時后，用0.2μm膜過濾除去DCUrea，并進一步將溶液在5℃放置12小時以使其余的DCUrea沉淀。用上述同樣的方式除去剩余量的沉淀的DCUrea。室溫下將溶液濃縮至15ml，并向其中加入100ml乙腈以沉淀白色固體。通過用0.2μm膜過濾該固體獲得白色粉末，隨后真空干燥5小時。最后，得到7.0g活化的GOCA。<3-2>疏水魚精蛋白(魚精蛋白-GOCA)的合成將0.5g魚精蛋白溶解在50ml蒸餾水中，并向其中緩慢加入含有0.31g在上述實施例<3-1>中獲得的GOCA的50ml DMF溶液。室溫下進行結合反應5小時后，將該混合溶液進行溶劑蒸發以除去蒸餾水和DMF。然后，用100ml蒸餾水洗滌溶液三次。結果，除去未反應的魚精蛋白并得到白色固體沉淀。用100ml甲醇洗滌獲得的沉淀并用0.45μm膜過濾，以除去未反應的活性GOCA。通過將其真空干燥得到白色粉末。將上述白色粉末加入含1.0重量％乙醛的100ml，50％甲醇溶液中1小時，在期間進行封閉反應。從中徹底去除殘留的未反應的魚精蛋白氨基酸殘基。反應完成后，用蒸餾水洗滌溶液三次，并真空干燥。最后，得到0.6g其中GOCA部分結合魚精蛋白的疏水魚精蛋白-GOCA。<3-3>魚精蛋白-GOCA的酯化將0.5g在上述實施例<3-2>中得到的魚精蛋白-GOCA溶解在80mlDMF中，并立即加入含有1.5g DCC的10ml DMF溶液。在攪拌5分鐘期間，DCC被活化，并另外加入溶解了0.84g HOSU的10ml DMF溶液。隨著反應進行，少量DCUrea沉淀。室溫反應24小時后，用0.2μm膜過濾該溶液以去除DCUrea，并通過室溫下蒸發溶劑以除去DMF。用100ml甲醇洗滌從那里獲得的白色粉末兩次，并用0.2μm膜過濾，得到白色固體沉淀。通過將其室溫下真空干燥5小時，得到0.4g通過酯化活化的疏水魚精蛋白-GOCA。<3-4>肝素-魚精蛋白-GOCA結合物的合成將0.5g在上述實施例<3-3>中獲得的活化的魚精蛋白-DOCA溶解在100ml DMF中，并與溶解了0.78g肝素的50ml蒸餾水混合5分鐘。反應開始后30分鐘內，通過縮合反應得到的沉淀，并在30分鐘內完全產生過程。室溫反應5小時后，上述溶液通過蒸發溶劑除去蒸餾水和DMF。用纖維素酯膜和甲醇作為溶劑經透析從獲得的白色粉末中去除未反應的活性魚精蛋白-GOCA。用水替代甲醇，并用0.45μm膜過濾溶液，以除去未反應的肝素，得到白色沉淀。在室溫下真空干燥沉淀12小時，最后得到0.9g白色粉末。實施例4肝素、多熔素和DOCA結合物的合成<4-1>多熔素和DOCA結合物的合成將1.0g多熔素(在下文中表示為“PLL”)溶解在50ml蒸餾水中，緩慢加入溶解了0.98g活化的DOCA的50ml DMF溶液。結合反應進行5小時后，溶液在室溫下進行溶劑蒸發，以除去蒸餾水和DMF。用100ml蒸餾水洗滌溶液三次以除去未反應的PLL，導致生成白色固體沉淀。用100ml甲醇洗滌固體沉淀，并用0.45μm膜過濾以除去未反應的活性DOCA。將該沉淀進一步真空干燥以得到白色粉末。將白色粉末加入到含1.0重量％乙醛的100ml，50％甲醇溶液中1小時，在期間進行封閉反應。結果，除去了殘留的未反應的PLL氨基酸殘基。反應完成后，通過用蒸餾水洗滌三次除去未反應的乙醛，并進一步真空干燥，得到1.5g其中DOCA部分結合PLL的疏水PLL-DOCA。<4-2>PLL-DOCA的酯化將1.0g在上述實施例<4-1>中得到的PLL-DOCA溶解在80ml DMF中，然后緩慢加入含有2.0g DCC的10ml DMF溶液。攪拌5分鐘，DCC開始被活化，再加入含有1.12gHOSU的10ml DMF溶液。隨著反應進行，產生少量的DCUrea。室溫反應24小時后，用0.2μm膜過濾溶液以去除DCUrea，并在室溫下蒸發溶劑以除去DMF。用100ml甲醇洗滌從那里獲得的白色粉末兩次，并用0.2μm膜過濾，以得到白色固體沉淀。在室溫下真空干燥沉淀5小時。結果，獲得0.9g通過酯化活化的PLL-DOCA。<4-3>肝素-PLL-DOCA結合物的合成將0.7g在上述實施例<4-2>中得到的活化的PLL-DOCA溶解在100ml DMF中，并在5分鐘內加入溶解了0.95g肝素的50ml蒸餾水。反應開始后30分鐘內，開始產生通過縮合反應化合的沉淀，并在30分鐘內完全產生過程。室溫反應5小時后，蒸發溶劑以除去蒸餾水和DMF，得到白色粉末。用纖維素酯膜和甲醇作為溶劑經透析除去未反應的活性PLL-DOCA。然后，用水替代甲醇，并用0.45μm膜過濾該溶液以除去未反應的肝素，得到白色沉淀。在室溫下真空干燥沉淀12小時，最后得到1.1g白色粉末。實施例5肝素、PLL和GOCA結合物的合成<5-1>PLL和DOCA(PLL-GOCA)結合物的合成將1.0g PLL溶解在50ml蒸餾水中，向其中緩慢加入溶解了0.98g在上述實施例<3-1>中獲得的活化的GOCA的50ml DMF溶液。室溫進行結合反應5小時后，將溶液在室溫下進行溶劑蒸發，以除去蒸餾水和DMF。然后，用100ml蒸餾水洗滌剩余溶液三次以除去未反應的PLL，得到白色固體沉淀。用100ml甲醇洗滌上述固體沉淀，并用0.45μm膜過濾以除去未反應的活性GOCA，并進一步真空干燥。結果，得到白色粉末。通過在含1.0重量％乙醛的100ml，50％甲醇溶液中進行1小時封閉反應來除去未反應的殘留在PLL中的氨基酸殘基。反應完成后，用蒸餾水洗滌溶液三次以除去未反應的乙醛。通過將其真空干燥，得到1.5g其中GOCA部分結合PLL的疏水PLL-GOCA。<5-2>PLL-GOCA的酯化將1.5g在上述實施例<5-1>中得到的PLL-GOCA溶解在100ml DMF中，然后迅速加入溶解了1.45g DCC的10ml DMF溶液。攪拌5分鐘，DCC被活化。此外，加入溶解了1.67g HOSU的10ml DMF溶液。隨著反應進行，產生少量的DCUrea。室溫反應24小時后，用0.2μm膜過濾除去DCUrea，并在室溫下蒸發溶劑以除去DMF。用100ml甲醇洗滌獲得的白色粉末兩次，并用0.2μm膜過濾，得到白色固體。然后，在室溫下真空干燥白色固體5小時，最后得到1.3g通過酯化活化的PLL-GOCA。<5-3>肝素-PLL-GOCA結合物的合成將1.0g在上述實施例<5-2>中得到的活化的PLL-GOCA溶解在100mlDMF中，然后在5分鐘內加入含有0.95g肝素的50ml蒸餾水。反應開始后30分鐘內，開始產生通過縮合反應化合的沉淀，溶液變渾濁。該產生過程在30分鐘內完成。反應5小時后，將溶液在室溫蒸發溶劑以除去蒸餾水和DMF，得到白色粉末。用纖維素酯膜和甲醇作為溶劑經透析從白色粉末中除去未反應的活性PLL-GOCA。然后，用水替代甲醇，并通過用0.45μm膜過濾溶液除去未反應的肝素。將從那里獲得的白色沉淀在室溫下真空干燥12小時，得到1.6g白色粉末。實施例6疏水性多組分肝素結合物的分析<6-1>用FT-IR譜進行結構分析為分析按照上述方式合成的疏水性多組分肝素結合物的結構，檢查FT-IR譜(紅外光譜，Perkin Elmer Ltd.)。結果，對于在實施例<1-3>中合成的肝素/PAA/ODA結合物，C＝O雙鍵，酰胺鍵在紅外光譜170cm-1范圍很顯著，肝素的羥基在3500cm-1范圍，ODA的甲基在波長2800-2900cm-1范圍也都很顯著。<6-2>疏水性多組分肝素結合物的涂層將1.0ml共溶劑(THFN，N-二甲基乙酰胺，1∶1體積/體積％)加入到25mg在實施例<1-3>中合成的疏水性多組分肝素結合物中，直到總的濃度達到2.5重量％，然后在40℃用超聲波處理溶液1小時，得到透明溶液。在25℃由聚氨基甲酸酯制備的血管導管(直徑2.5cm，長度5cm)和玻璃(0.5cm×0.5cm)的表面每個使用浸涂法用上述溶液涂層。將用疏水性多組分肝素結合物涂層的導管和玻璃在室溫下干燥30分鐘，隨后在室溫下真空干燥5小時，完全除去殘留溶劑。盡管玻璃或導管的涂層表面有點模糊，但沒有觀察到沉淀現象。<6-3>涂層的多組分肝素結合物在水溶液中的剝離檢測將各自用與上述實施例<6-2>相同的方法，用來自上述實施例<1-3>的疏水性多組分肝素結合物涂布的玻璃和導管放到裝有10ml PBS(pH＝7.5，I＝0.15)的falcon試管中，并在37℃、100rpm震蕩12小時。當反應完成時，加入藍色(azure)A溶液(10mg/ml水)，完成染色反應(H.J.Conn，“Biological Stains”，The Williams和Wilkins.，MD，96-105頁，1961)。結果，在染料溶液中未檢測顏色變化。因此，可以證實如果肝素/PAA/ODA，本發明的疏水性多組分肝素結合物被用作涂層材料，它們對材料如玻璃或其它高聚物具有很高的粘附度，而在水溶液中卻無由于膨脹而產生的剝離現象。<6-4>藍色A試驗將在上述實施例<6-3>中檢測了剝離的玻璃或導管浸入5ml藍色A溶液(10mg藍色A/ml水)，隨后將溶液在室溫放置5小時，隨著時間的推移，用疏水性多組分肝素結合物涂布的材料表面顯示顏色改變，5小時后，染料溶液變為深紫色。同時，其他沒有被疏水性多組分肝素結合物涂布的材料未顯示顏色改變。基于這些事實，可以確定疏水性多組分肝素結合物已穩固粘附到材料表面，同時保留了肝素特有的特性和抗血栓形成活性。<6-5>接觸角分析將用與上述實施例<6-2>相同的方式，用疏水性多組分肝素結合物(2.5重量％)涂布的導管(5cm)和未涂布的導管浸入10ml蒸餾水中，室溫放置5分鐘。結果，用本發明的疏水性多組分肝素結合物涂布的導管觀察到水擴散。另一方面，未涂布的導管的水擴散降低盡管它的水接觸角增加。<6-6>血小板粘附試驗對于血小板粘附試驗，從兔子身上分離出血小板缺乏的血漿(在下文中表示為“PPP”)。更具體地，用乙醚麻醉重2.5-3.0kg的新西蘭兔(Sunrise Scientific Co.)，然后，用心臟穿孔法，用50ml注射器抽出36ml血液。事先在注射器中放入4ml 3.8％的檸檬酸鈉以防止血液凝固。將血液在4℃以1440rpm離心10分鐘，得到新鮮兔子的PPP。血漿中的血小板濃度用Coulter記數器(Coulter electronics Ltd，UK)測定，優選血小板濃度為4.2×105細胞/μl。分離出的PPP在制備后3小時內用于試驗。
用本發明的疏水性多組分肝素結合物(2.5重量％)涂布的玻璃(0.5×0.5cm)和未涂布的對照玻璃放入每個含有1ml分離的新鮮兔子PPP的試管中，放置在37℃攪拌水浴中1小時。1小時后，從每個管中去除PPP，玻璃用PBS洗三次已徹底除去PPP。為了固定血小板，每一上述玻璃用3ml 2.5％戊二醛處理4小時，然后，根據如下步驟用乙醇(EtOH)水溶液洗滌。步驟15ml 50％乙醇1小時，步驟25ml 80％乙醇1小時，和步驟35ml 100％乙醇1小時。用液氮處理每個除去乙醇的玻璃，隨后凍干6小時。用SEM觀察每一玻璃以檢查血小板粘附。結果，確認同對照玻璃相比，用本發明的疏水性多組分肝素結合物涂布的玻璃的血液兼容性大幅度提高。<6-7>血液凝固試驗對于血液凝固試驗，分離小鼠的全血。具體地，用乙醚麻醉重250-300g的Sprague-Dawley鼠(Korea Biolink)，然后，用心臟穿刺法，用50ml注射器取3.6ml血。事先在注射器中放入0.4ml 3.8％的檸檬酸鈉以防止血液凝固。血液取出后馬上用于試驗。
用25mg根據上述實施例<3-1>合成的疏水性多組分肝素結合物涂布的血液導管和其他未涂布的導管浸入上述制備的小鼠全血中1小時，然后，用1st蒸餾水輕柔地洗滌，然后馬上照相。結果，在浸泡1小時后，用本發明的疏水性多組分肝素結合物涂布的導管顯示根本沒有血液成分的凝集，而未涂布的對照導管有很強的血液成分凝集。
工業實用性如上所示，本發明的疏水性多組分肝素結合物只溶解在特定的有機溶劑中，并且通過溶劑蒸發、浸涂或噴霧的方法，它們能被很容易地涂布到大分子或金屬表面上。同時，該結合物不溶于水，所以在涂布后它們能穩定地用于臨床治療。而且，本發明的疏水性多組分肝素結合物在涂布于基質上后，保留了它們原有的抗血栓形成活性的特性。更準確地說，結合物通過抑制涂布表面的血液凝固提高了涂布表面的抗血栓形成活性。同樣，本發明的疏水性多組分肝素結合物通過降低涂布表面的摩擦系數和增加涂布表面的水吸收能力而導致涂布基質變得充分濕潤。因此，本發明的疏水性多組分肝素結合物作為抑制血栓的副作用并改善接觸血液的人造器官和醫療器件例如導管、插管等的表面的涂層劑是非常有用的。
那些本領域的技術人員可以理解在上述說明書中公開的概念和具體實施方案易于作為修改或設計實現本發明的相同目的的其他實施方案的基礎。那些本領域的技術人員也可以理解這類等同的實施方案未脫離如后附的權利要求所闡明的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.疏水性肝素結合物，其中大分子和疏水物質與肝素結合。
2.如權利要求1中所述的疏水性肝素結合物，其中疏水性肝素結合物是疏水性多組分肝素結合物，其中大分子和疏水物質被多重結合。
3.如權利要求1中所述的疏水性肝素結合物，其中大分子選自合成的大分子、蛋白質、生物高聚物和它們混合物。
4.如權利要求3中所述的疏水性肝素結合物，其中合成的大分子選自聚二烯，聚烯，聚乙炔，聚丙烯酸和它的衍生物，聚α-取代的丙烯酸和它的衍生物，聚乙烯醚類，聚乙烯醇，聚乙烯鹵化物，聚苯乙烯和它的衍生物，多氧化物類，聚醚，聚酯，聚碳酸酯類，聚酰胺類，聚氨基酸類，聚脲類，聚氨基甲酸酯類，聚亞胺類，聚硫化物類，多磷酸鹽，聚硅氧烷類，聚倍半硅氧烷類，聚雜環類，纖維素和它的衍生物，和它們的共聚物或衍生物。
5.如權利要求3中所述的疏水性肝素結合物，其中蛋白質是選自魚精蛋白、多熔素、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和它們的衍生物或共聚物。
6.如權利要求3中所述的疏水性肝素結合物，其中生物高聚物選自多糖、明膠、骨膠原、藻酸鹽、透明質酸、藻酸、角叉菜聚糖、軟骨素、果膠脫乙酰殼多糖和它們的衍生物或共聚物。
7.如權利要求1中所述的疏水性肝素結合物，其中疏水物質具有多于一個的反應官能團并且結合大分子后水溶性低于100mg/ml。
8.如權利要求7中所述的疏水性肝素結合物，其中疏水物質選自十八胺(ODA)，鏈烷胺，膽汁酸，甾醇，鏈烷酸和它們衍生物。
9.如權利要求1中所述的疏水性肝素結合物，其中肝素選自重組肝素，肝素衍生物和肝素類似物。
10.一種制備權利要求1的疏水性肝素結合物的方法，其包含下述步驟1)將大分子與肝素結合；2)將疏水物質與結合以肝素的大分子的官能團相結合。
11.如權利要求10中所述的制備方法，其中權利要求10步驟(1)中肝素和大分子的結合是利用效應物的共價鍵結合，所述效應物選自羥基，羧基，胺基，硫基和疊氮基。
12.如權利要求10中所述的制備方法，其中權利要求10步驟(2)中大分子和疏水物質的結合是利用效應物的共價鍵結合，所述效應物選自羥基，羧基，胺基，硫基和疊氮基。
13.如權利要求10中所述的制備方法，其中步驟(1)和步驟(2)的共價鍵選自非降解鍵如酰胺鍵和氨基甲酸乙酯鍵，和可降解鍵例如酯鍵和酐鍵。
14.一種涂層劑，其在用權利要求1的疏水性肝素結合物來改性人造器官和醫療器械表面中是有用的。
全文摘要
本發明提供了不溶于水但溶于有機溶劑的疏水性肝素結合物，其制備方法及其應用。具體地，本發明提供了通過使肝素與聚合物和疏水物質共價結合而制備的疏水性肝素結合物。本發明的疏水性肝素結合物保留良好的抗血栓形成作用，并且由于其疏水性而不溶于水，因此它們能有效地用作改性醫療器件表面的涂層劑。
文檔編號C08B37/00GK1455687SQ00819986
公開日2003年11月12日 申請日期2000年11月3日 優先權日2000年10月24日
發明者邊榮魯, 文炫兌 申請人:韓國美大富歷壽株式會社