專利名稱：吞噬的分析方法
技術領域：
本發明涉及程序性細胞死亡或凋亡領域，尤其涉及凋亡細胞被其它細胞迅速吞噬的現象。本發明提供用于測定凋亡細胞吞噬的分析方法和材料。這些分析可用于確定影響凋亡細胞吞噬并具有潛在藥理學活性的化學物質。本發明的分析可適用于用多孔板進行的培養基和高通量篩選。
在組織發育和維持過程中，大量細胞歷經程序性死亡或凋亡。在脊椎動物和無脊椎動物中都可觀察到。例如，在線蟲C.elegans中，131個細胞經歷程序性死亡(Lui和Hengartner(1997)1997國際蠕蟲會議，摘要371)。凋亡細胞的裂解是潛在有害的，引起內容物可能引起對周圍組織的毒性損傷。因凋亡細胞被其他細胞吞噬并隨之降解，因此可避免這種有害作用。在哺乳動物中，吞噬細胞為專業性或半專業性吞噬細胞，如嗜中性細胞或吞噬細胞，或吞噬細胞為死亡細胞的鄰近細胞。
程序性細胞死亡或凋亡的關鍵特性之一，是死亡細胞被吞噬細胞識別并吞噬的速度(Sayill,J.等，今日免疫學，14:131-136,1993)。凋亡觸發一系列獨特的事件，如細胞表面磷脂酰絲氨酸表達，DNA片段化或梯子化和膜結合的細胞片段又稱凋亡小泡和小體的釋放(Cohen,J.J.等免疫學綜述年刊，10:267-293,1992.；Kerr J.F.R.等，英國癌癥雜志，26:239,1972.)。凋亡細胞和小體通過識別磷脂酰絲氨酸和其它針對凋亡物質的表面的獨特的未確定的配體的不同受體而被吞噬(Savill,J.S.等，臨床研究雜志，83:865-875,1989,；Fadok,V.A.等，免疫學雜志,148:2207-2216,1992。Savill,J.等，自然，343:170-173,1990.)。通過此種方式，含有潛在發炎因子的凋亡細胞被半專業性吞噬細胞或巨噬細胞系的鄰近細胞迅速清除而不引起炎癥反應(Fadok,V.A.等，臨床研究雜志，101:890-898,1998)。
凋亡的過程與多種人類疾病相關，包括癌癥，自身免疫疾病，多種神經變性疾病，如肌萎縮側索硬化，遺傳性慢性舞蹈病，和老年性癡呆，中風，心肌梗塞和艾滋病(Thompson,CB,科學267,pp1456-1462)。因此，對凋亡機制和控制該機制的基因的研究贏得愈來愈多的關注，人們力圖發展對這些疾病的新的治療方法。
某些疾病與吞噬凋亡小體造成的損傷相關。這樣的疾病包括自身免疫疾病如系統性紅斑狼瘡(Herrmann,M.等，風濕性關節炎，41:1241-1250,1998。),AIDS(Zocchi,M.R.等，AIDS,11:1227-1235,1997.)，急性肺侵染(Cox,G.等，美國呼吸雜志，細胞分子生物學，12:232-237,1995)和過敏反應(Ying,S.等，美國醫生聯合會會刊，109:42-50,1997)。很明顯，通過藥物對凋亡細胞吞噬的調節是未來治療的方向。
脊椎動物中凋亡細胞的吞噬作用是非常復雜的過程，目前尚不清楚死亡細胞產生的信號是如何被吞噬細胞接收并傳導的。
在雌雄同體的線蟲中觀察到凋亡細胞的迅速吞噬，該蠕蟲提供了研究吞噬過程的有效手段。例如，在線蟲中鑒別的影響吞噬的6個基因，ced-1,ced-2,ced-5,ced-6,ced-7和ced-10。本發明的單獨選中ced-6進行特別的研究。已知ced-6在染色體Ⅲ的圖譜靠近線蟲的daf-4(Lui和Hengartner(1997)；Lui和Hengartner(1996)東海岸蠕蟲會議摘要128)。此項工作表明來自此區的兩個粘粒，F56D2和F43F12可挽救線蟲ced-6(n1813)吞噬缺失。來自F56D2的10kbXhoⅠ的亞克隆具有拯救活性，同時攜帶ced-6基因。
本發明者鑒別了線蟲ced-6的2個人類同源物，(hlced-6和h2ced-6)，h2ced-6是h1ced-6的剪切變體，因此作為線性陰性模型。兩種同源物都存在于人細胞系THP-1中。hCED-6和線蟲CED-6之間有驚人的序列同源性。hCED-6具有磷脂酰酪氨酸結合區，從氨基酸11-氨基酸190，如圖4所示，說明與酪氨酸激酶信號傳導通路有關。
H1CED-6和h2CED-6蛋白和它們編碼核酸可用于進行本文的分析，鑒定作為促進凋亡細胞吞噬作用的信號傳導通路的抑制劑或增強劑的化合物。特別地，它們在鑒別h1CED-6和h2CED-6的抑制劑或增強劑，或其轉錄的抑制劑或增強劑過程中有效。這些抑制劑或增強劑可作為有用的治療劑用于對前述的疾病的治療。
本發明的第一方面提供了一種能夠表達h1CED-6或h2CED-6表達載體，該載體包括編碼圖4或圖5的氨基酸序列或與圖4或圖5的氨基酸相比僅僅發生生物功能保守性的變化的氨基酸序列的脫氧核苷酸序列。
本文定義的術語“生物功能”指調節或影響凋亡細胞吞噬作用的能力。“保守的”氨基酸變化是那些雖然比野生型人CED-6蛋白的生物功能水平高或低，但可保持生物功能的變化。這些保守的變化包括一個或更多氨基酸插入或缺失或一個或更多氨基酸被其它氨基酸或具有相似化學特性的酸取代。使氨基酸發生保守性變化的方法為本領域技術人員所熟知。
在一個優選的實施方案中，表達載體為包括圖2或圖3所示的從轉錄起始密碼子到轉錄終止密碼子的脫氧核苷酸序列和任意的包括圖2或圖3中所示的脫氧核苷酸序列的載體。
在一個尤其優選的實施方案中，本發明的表達載體包括編碼報告基因的核苷酸序列，h1CED-6或h2CED-6的表達可導致該報告基因的表達。此報告基因可置于h1ced-6或h2ced-6的3’或5’端，可作為與h1CED-6或h2CED-6的融合蛋白表達。合適的報告基因是可以表達熒光產物如綠色熒光蛋白(GFP)基因。其它適當的報告基因有酶，如β-半乳糖苷酶或熒光素酶，這些酶能過作用于底物產生可檢測的產物，例如熒光產物或發光產物。根據本發明表達產物的例子有分別在圖29和10中顯示的pGA3103和pGA3104。
在另一個優選的實施方案中，本發明的表達載體在h1CED-6和h2CED-6蛋白的氨基和/或羧基末端表達表位標簽。例如質粒pBAD/HisA-h1ced-6，其序列如

圖17中所示。
上述的表達載體不僅包括編碼h1CED-6和h2CED-6或其功能變體的序列，還包括可操作的與核酸相連的調節序列，如能影響DNA片段表達的啟動子區。術語“可操作的連接”指一種并列的關系，其中描述的組分允許序列以預期的方式發揮功能。
表達所需的調節元件包括與RNA多聚酶結合，指導轉錄起始的適當水平和的啟動子序列和與核糖體結合的翻譯起始序列。例如，細菌表達載體可包括啟動子如lac啟動子和翻譯起始的核糖體結合序列和起始密碼子AUG。相似的，真核表達載體可包括RNA聚合酶Ⅱ的異源或同源啟動子，下游聚腺苷酸化信號，起始密碼子AUG，和核糖體脫離的終止密碼子。這些載體可從商業渠道獲得或運用本領域熟知的方法裝配描述的序列。用于表達載體的啟動子序列包括ΔHSP,CMV,SV40,EF-1α,UbC,SG,RSV,TRE/minCMV,HSV TK,5’,LTR和QBISP136增強的CMV。
本文描述的表達載體的實施例為質粒，但也可為病毒或噬菌體載體。這些載體通常具有一個復制起點和一或更多選擇標記物如抗生素抗性的基因。尤其優選本發明的表達載體適于哺乳動物細胞轉染，從而為載體提供相應的選擇標記。
本發明的第二方面提供了用上述的表達載體轉染的哺乳動物細胞系。轉染哺乳動物細胞的方法眾所周知。該細胞系可在單層培養或懸浮培養中生長。適當的細胞系為成纖維細胞系或上皮細胞系如COS1,BHK21,L929,pc12,CV1,SWISS3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。也可用原代細胞系如人皮膚FIBs，皮膚角質形成細胞，白細胞，單核細胞，淋巴細胞，樹突細胞或巨噬細胞。在本發明的吞噬分析中，尤其優選表達h1CED-6和h2CED-6的哺乳動物專業性或半專業性吞噬細胞，如鼠巨噬細胞系J774或人單核細胞系THP1(見實施例3和圖6)。以上兩種細胞系可作為單核細胞系，因單核細胞系能分化為本發明分析所用的巨噬細胞。
本發明第三方面提供了測定化合物為促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的增強劑或抑制劑的方法，該方法包括使轉染有上述的h1ced-6或h2ced-6的哺乳動物細胞暴露給凋亡顆粒，在化合物存在或缺失時測定顆粒的吞噬速率。待測化合物優選在凋亡顆粒前加入。
適當的凋亡顆粒是發生凋亡并視需要而定在血清中調理的細胞，如嗜中性粒細胞，淋巴細胞，紅細胞，或樹突細胞。適于形成凋亡顆粒的細胞包括細胞系L929和PC12。一種特別優選用作凋亡顆粒的細胞系是生長因子依賴的鼠細胞系Ba/F3。它們可在標準培養基中生長如實施例5所述，可在生長因子IL-3缺失適當時間(例如約20小時)時生長，誘導凋亡。細胞凋亡狀態可用，例如，BoeringherMannheim(布魯塞爾，比利時)的膜聯蛋白/碘化丙啶標記的試劑盒測定。如果約20％膜聯蛋白陽性，而不少于5％碘化丙啶陰性，則認為細胞為早期凋亡的。
PC12細胞系可在神經生長因子缺失的標準培養基中生長誘導凋亡。
除上述細胞外，凋亡顆粒可為非活物質，如染料標記的乳膠顆粒。帶有一個氨基或羧基的0.1μM,1μM,4μM和10μM顆粒可購自Sigma-Aldrich,Bornem，比利時，或Molecular Probes,Eugene，美國。
為使所述的分析適于高通量的化合物篩選，優選凋亡顆粒攜帶某種可探測的標記，則當該顆粒被轉染的哺乳動物細胞吸收時，非常明顯，可量化。發明者發現可通過用包括報告基因的表達載體穩定轉染包含凋亡顆粒的細胞，從而實現上述目的。一個特別合適的報告基因編碼β-半乳糖苷酶，它能裂解熒光底物熒光素雙-b-D-吡喃型半乳糖苷為可用標準熒光探測設備檢測的熒光化合物。其它熒光底物也可用于β-半乳糖苷酶。質粒pcDNA3.1/HIS/lacZ，表達β-半乳糖苷酶且適于轉染用作凋亡顆粒的細胞，例如Ba/F3，如圖11所示。其它合適的報告基因是編碼熒光蛋白如綠色熒光蛋白或能產生發光信號如熒光素酶的蛋白的基因。質粒pEGFP-N3或pEGFP-C2(Clontech)，適于轉染GFP到用作凋亡顆粒的細胞，如圖7,8,26和27所示。Promega的質粒“PGL對照”適于轉染編碼熒光素酶的基因到用作凋亡顆粒的細胞如Ba/F3細胞。“PGL對照”的DNA序列如圖19所示。
優選對凋亡顆粒的報告基因的選擇由轉染的哺乳動物細胞報告基因的存在控制。例如，在轉染h1或h2ced-6的哺乳動物細胞核凋亡細胞中相同報告基因的存在，因信號重疊而不被優選，盡管這種情況不多。
更優選可檢測多種化合物，測其為促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的增強劑或抑制劑。化合物可為任意化學式，聚合體或單體。例如檢測的化合物可為基因組DNA,cDNA,RNA,PNA,蛋白或多肽，氨基酸，核苷或核苷酸。化合物可為已知生物或藥理活性的，未知活性的已知化合物或在化合物組合庫中存在的新分子。
當任何化合物的存在導致凋亡顆粒被轉染的哺乳動物細胞吞噬的量減少或不發生吞噬時，應檢測細胞的生存力。活細胞的存在確認吞噬的缺乏緣于所測化合物對吞噬活性的影響而非其非特異性毒性。
進一步的，任何經上述分析鑒定為凋亡細胞吞噬的抑制劑或增強劑的化合物，都將進一步檢測該影響是否通過CED-6介導。鑒定一種化合物為凋亡細胞吞噬的抑制劑或增強劑后，可通過進行上述的吞噬分析，但哺乳動物細胞未轉染h1ced-6或h2ced-6。如果該化合物在為轉染的細胞中能誘導與轉染h1ced-6的細胞相同的表型，說明該化合物不一定通過CED-6或CED-6信號傳導通路發揮作用。
相似的，如果一種上述分析鑒定為凋亡細胞吞噬的抑制劑的化合物，通過鑒定暴露給該化合物的未轉染的哺乳動物細胞的表型確認其作用是否通過CED-6或CED-6信號傳導通路。向野生型表型的恢復意味著反應通過CED-6或CED-6信號傳導通路。
本發明第四方面提供確定用于檢測一種化合物是否為促進吞噬凋亡細胞的信號傳導通路的的促進物或抑制劑的方法，該方法包括下列步驟(1)向哺乳動物細胞顯微注射包括圖4或圖5所示的氨基酸序列或與圖4或圖5所示的氨基酸序列僅有功能的保守性的氨基酸改變的序列的人CED-6蛋白，和(2)將步驟1制備的哺乳動物細胞暴露給凋亡顆粒，在化合物存在和缺失時測量顆粒被細胞的吞噬速率。
優選的，向哺乳動物細胞顯微注射包括h1Ced-6或h2CED-6和報告基因的融合蛋白，報告基因可為上述的任意報告基因。優選的融合蛋白通過表達圖9或28所示的質粒的GFP和h1ced-6編碼序列獲得。
上述所有的周轉染的哺乳動物細胞系分析的特征和實施方案可用于上述的以h1Ced-6或h2CED-6或其融合蛋白顯微注射的細胞。
本發明第五方面提供用于檢測一種化合物是否為促進吞噬凋亡細胞的信號傳導通路的的促進物或抑制劑的方法，該方法包括下列步驟(1)向哺乳動物細胞顯微注射或轉染表達圖2或圖3所示的核苷酸序列的所有或部分反義的RNA的載體；(2)將步驟1制備的哺乳動物細胞暴露給凋亡顆粒，在化合物存在和缺失時測量顆粒被細胞的吞噬速率。
優選的，該反義RNA包括能與圖2或圖3所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列，雜交的嚴格性條件高于2×SSC；0.1％SDS；25℃到50℃。
上述所有用轉染的哺乳動物細胞系的分析的所有優選的特點和實施方案可應用到反義RNA注射的細胞系。
優選用于上述分析的轉染的哺乳動物細胞轉染h1ced-6或h2ced-6。因h2ced-6被視為h1ced-6的顯性的隱性形式，具有相反的生物學作用，細胞對轉染的選擇取決于希望鑒別作為凋亡細胞吞噬的抑制劑或增強劑的化合物。例如轉染h1ced-6的細胞特別適合鑒別凋亡細胞吞噬的抑制劑，而轉染h2ced-6的細胞特別適合鑒別增強劑。
因此闡明本發明也涉及根據本文描述的任意分析方法，鑒定為促進凋亡細胞吞噬信號傳導通路的抑制劑或增強劑的任何化合物。
h1ced-6和h2ced-6的核苷酸序列分別如圖2和3所示。此外，編碼可變剪接h2CED-6的cDNAs和從h2ced-6重組h1ced-6的插入片段根據布達佩斯條約于1998年6月8日保藏于比利時微生物協調保藏中心(BCCM)分子生物學實驗室-質粒保藏(LMBP)B9000,Gent，比利時，保藏號分別為3868和3869。
從使用T2或T7引物可從存放物種獲得序列(可用一個或同時用2個引物，在不同的實際插入位點)。引物可購自Clontech(～1227和～1228)，序列如下T7引物5’(TAATACGACTCACTATAGGGAGA)3’T3引物5’(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)3’在發展基于過表達或低表達人CED-6蛋白的哺乳動物細胞的分析之外，本發明者鑒定h1CED-6的表位并制備了它有用的抗體。
本發明第六方面包括具有圖4所示的氨基酸序列的人Ced-6蛋白片段，其中片段包括氨基酸序列HRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。制備包括上述一或更多表位的抗體。按實施例6描述的方法獲得抗體制備物，它們的特異性如實施例7使用WesternBlots證實(圖20到25)。
上述的抗體可用于在與吞噬細胞過表達或低表達人Ced-6相關的患者中診斷疾病的方法。特別地，本文提供一種方法用于診斷在個體中與吞噬細胞過表達或低表達人Ced-6的相關的疾病，包括(a)從個體獲得吞噬細胞的樣品；(b)暴露吞噬細胞給如上所述的抗體制備物；(c)定量測量任何在抗體和Ced-6蛋白間形成的免疫復合物的存在；并(d)與使用來自對照個體的吞噬細胞形成的免疫復合物比較形成的免疫復合物的量。
上述的抗體可進一步用于測定一種化合物是促進凋亡細胞吞噬信號傳導通路的抑制劑或增強劑的分析。特別地，本文提供一種方法，用于測定一種化合物是否為促進凋亡細胞吞噬信號轉到通路的抑制劑或增強劑，該方法包括(a)暴露轉染如上所述的表達載體哺乳動物細胞給待測化合物；(b)暴露哺乳動物細胞給上述的一種抗體制備物；(c)定量測量在抗體和細胞表達的蛋白見形成的任何免疫復合物的存在；并(d)與未暴露給化合物的、如步驟(a)描述的轉染的哺乳動物細胞中探測的免疫復合物的量比較探測的免疫復合物的水平。
在上述方法中，哺乳動物細胞可選自COS1,BHK21,L929,CU1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361,COS1細胞尤其優選。哺乳動物細胞也可為人皮膚FIB，人角質形成細胞，白細胞，單核細胞，淋巴細胞，樹突細胞或巨噬細胞。優選專業性吞噬細胞如鼠巨噬細胞細胞系J774或人單核細胞細胞系THP-1。
本發明抗體的其它應用包括h1CED-6的純化和與CED-6相互作用的蛋白的鑒別，則信號傳導通路可特征化，還包括探測hCED-6的過表達或低表達、細胞內定位或翻譯后修飾，表位作圖和活化位點和在適當載體或稀釋劑中包括所述抗體的藥理學組合物的鑒定。
本發明第七方面包括一種用于診斷與在個體的吞噬細胞中人CED-6過表達或低表達相關的疾病的方法，該方法包括(a)從個體獲得吞噬細胞樣品，(b)從吞噬細胞分離RNA，(c)從RNA制備cDNA，(d)在cDNA中進行一級PCR反應，(e)在一級PCR反應的反應產物上進行二級(嵌套式)PCR，(f)通過分析一級和二級PCR的產物定性和定量測量人ced-6 RNA的存在，并(g)將在一級和二級PCR中形成的反應產物與使用對照個體的吞噬細胞形成的反應產物比較產物的量和類型。
優選的，使用本文定義的h1ced-6或h2ced-6的序列衍生的引物或從cDNA產生使用的載體的衍生的引物進行PCR。特別地，所述一級PCR可用具有以下核苷酸序列的引物1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gatctactaggtactggag二級PCR可用具有以下核苷酸序列的引物1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag本文描述的分析方法，由本發明者改進用于測定是否化合物為人CED-6的增強劑或抑制劑，可通用于鑒定在任何機制下影響凋亡細胞吞噬的化合物，而不僅涉及人CED-6或由其充當組分的信號傳導通路。
Liu等。(Liu,Y.等，美國免疫學家協會，1:1999)描述了一種鑒定影響凋亡細胞吞噬的化合物，其中不同濃度的化合物加入到吞噬細胞，隨后向吞噬細胞中接入凋亡細胞。為量化凋亡細胞的吞噬，作者對吞噬的顯微量化，其中對凋亡細胞的吸收由電子顯微鏡顯示，并用光學顯微鏡計數計算的每塊玻片的最少細胞(Sayill,J.S.Wyllie,A.H.Henson,J.E.Walport,M.J.Henson,P.M.Haslett,C.,J Clin Inyest,83:865-875,1989)。
已知用于量化凋亡細胞吞噬的技術不容易對化合物進行高物料通過量篩選潛在的藥物學活性。主要因為已知的分析技術依賴于在暴露給檢測化合物時，對攝取凋亡細胞的吞噬細胞的比例顯微計數。但是，本發明克服該缺點，因它們可在多孔分析板中進行，并提供不需顯微鏡的探測系統。
因此，本發明進一步提供一種方法，鑒定一種化合物是否為凋亡細胞吞噬的增強劑或抑制劑，它包括a)在待測化合物存在或缺失時，向穩定轉染能產生非顯微鏡探測的信號的報告基因凋亡的哺乳動物細胞暴露哺乳動物專業性或半專業性吞噬細胞，
b)去除未被吞噬細胞吞噬的任何凋亡細胞并c)探測任何來自吞噬細胞的報告基因的信號；其中在化合物存在時與化合物缺失時的任何信號差異說明化合物是凋亡細胞吞噬的增強劑或抑制劑。
通常，在上述方法中優選先將吞噬細胞與所測化合物溫育，然后加入凋亡細胞。適當的溫育時間為15-30分鐘。
使用本發明的方法的適當的吞噬細胞為鼠J774細胞或人THP-1細胞，如本文所述。這些細胞為單核細胞系，但在加入凋亡細胞前經培養使之分化為巨噬細胞。
用于上述方法的凋亡細胞可為凋亡的嗜中性細胞，凋亡的淋巴細胞或凋亡的紅細胞。凋亡細胞可任選通過暴露給血清進行調理。優選的凋亡細胞為貼壁細胞系L929或PC12和，本文描述的生長因子依賴的鼠細胞系Ba/F3。
運用上述方法穩定轉染報告基因到凋亡細胞。運用報告基因會遇到的一個特別問題是在有效死亡的凋亡細胞中基因的表達，比完全活細胞中弱很多。如果或細胞處于加入到吞噬細胞的凋亡顆粒中，不充分洗未吞噬的顆粒，來自活細胞的信號會掩蓋來自凋亡吞噬的細胞的任何信號。雖然可以隨后洗滌，本發明者改進了一種特別的實施方案避免此問題。
特別地，它包括使用表達在細胞中轉換低的蛋白，優選酶的報告基因，則活細胞和凋亡顆粒具有約相同的蛋白濃度或酶活性。從而克服了上述的缺點。幾種可能的報告蛋白和底物在熒光探針和研究化學藥品手冊，P.Haugland編(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)中都有描述。本發明者還發現β-半乳糖苷酶(lacZ)是特別合適的報告基因。此酶相對低更新，細胞和凋亡顆粒具有相對相同量的活性。此外存在幾種適于β-半乳糖苷酶的底物(見Molecular Probes,Eugene，或USA)，本發明者使用上述的FDG。它使發展一種高物料通過量篩選改變凋亡顆粒吞噬的化合物成為可能。
本發明的方法使用的吞噬細胞可為野生型細胞或轉基因或突變細胞。突變的細胞與野生型相比，可減少或增加吞噬活性。轉基因細胞可穩定轉染表達時影響凋亡細胞吞噬活性的速率的基因。例如，哺乳動物細胞轉染上述的h1ced-6或h2ced-6，優選使用任何在描述或附圖中提到的載體。
在本發明的另一實施方案中，吞噬細胞可轉染編碼細胞表面抗原CD36的DNA。運用磷脂酰絲氨酸受體或玻聯蛋白受體的人巨噬細胞吞噬凋亡細胞需要CD36的表達。(Fadok V.A.等，免疫學雜志1998 Dec1.161(11):6250-7)。轉染可采用本文描述的任何方法進行，優選使用包括編碼如圖31所示的CD36的DNA序列的載體或圖31的完整載體。
本發明的方法都在多孔板中進行，因此特別適合中-高通量篩選。在一個優選的實施方案中，使用96孔板，但本發明也可使用其它數的孔板，包括但不限于6,12,24,384,864,1536孔板。
本發明的所有方法需要對量化凋亡細胞吞噬的信號在待測化合物存在時進行探測。本發明的方法的關鍵特點在于該信號(也稱示值)使用非視覺探測方法檢測。本文使用的術語‘非視覺探測方法’指任何檢測一種不需人眼包括顯微鏡視覺檢查的信號的方法。非視覺探測系統的運用是主要的優點，超越已知的需要對細胞通過眼睛進行視覺檢查檢測凋亡細胞被吞噬細胞的吸收的篩選方法。
為能在吞噬分析的高-中物料通過量篩選中對凋亡細胞進行非視覺探測，報告基因必須能產生可被自動平板計數器，如victor2(Wallac,Turku，芬蘭)檢測的信號。最優選檢測熒光信號的自動平板計數器。
通過產生自動多孔板計數器讀數的信號，可進行量化測量，從而能夠一次估價多種化合物的作用，并比較化合物的作用。
需進一步指出，待測化合物可為上述的任何類型的化合物，當特定的化合物導致吞噬細胞降低或消失的信號，將檢測吞噬細胞的活力，從而排除化合物的非特異性毒性原因。
在以下非限制性的實施例中，參考下1從EST,RACE和集落雜交獲得的2416bp的共有序列的結構(見實施例1)。序列如下裝配，以aa159394為模板，引物如多重序列所示。rcc代表逆轉的補足物。在多種序列中可見ced-6和hced-6；pGA101由集落雜交挑選。
圖2示h1ced-6的共有DNA序列(2416bp)。啟示和終止密碼子為黑體并下劃線。可變剪接區也下劃線。
圖3示h2ced-6的可變剪接的DNA序列。啟示和終止密碼子為黑體并下劃線。
圖4示h1CED-6的氨基酸序列。殘基數304，分子量34.4kDa。可變剪接區也下劃線。
圖5示h2CED-6的氨基酸序列，可變剪接區。
圖6示對實施例3中描述的嵌套式PCR產物的凝膠分析；泳道分別為(1)100bp標記物，(2)初級活嗜中性細胞，(3)初級凋亡嗜中性細胞，(4)初級巨噬細胞，(5)與凋往嗜中性細胞作用的初級巨噬細胞，(6)J774,(7)COS-1,(8)THP-1圖7示實施例4和8中使用的包括報告基因GFP的Clonetech載體pEGFP-N3的DNA序列；圖8示pEGFP-N3的質粒圖譜；圖9示圖4和8中使用的質粒pGA3104的DNA序列，在pEGFP-N3的多克隆位點包括h1ced-6；圖10示質粒pGA3104的質粒圖譜；圖11示用于穩定轉染Ba/F3細胞的可從商業渠道獲得的質粒pcDNA3.1/His/LacZ的DNA序列(見實施例4)；圖12示熒光強度，當β-半乳糖苷酶與熒光底物熒光素-b-D-吡喃型半乳糖苷(FDG)反應時，熒光強度作為轉染的細胞百分比；
圖13示FDG濃度對實施例5的分析的讀數的影響；圖14示溫育時間對實施例5的分析的讀數的影響；圖15示Ba/F3細胞培養中血清濃度對實施例5的分析的影響；圖16示用于產生多克隆抗體的在h1CED-6中的表位的定位；圖17示實施例7所用的質粒pGA1028的DNA序列(pBAD/HisA/-hced-6)；圖18示pGA1028的質粒圖譜；圖19示適于轉入Ba/F3細胞的報告基因熒光素酶的商業質粒pGL2的DNA序列；圖20到25示實施例7中免疫引跡的結果。在所有圖中，泳道如下泳道1預染色的SDS-PAGE低分子量標準(Bio Rad-Hercules,CA,USA)，泳道2pBAD/His A(Invitrogen,Leek,The Netherlands)泳道3pGA1028(pBAD/HisA/-h1CED-6)圖20示用針對實施例7中鑒定的表位EP 990044的抗體和對照抗體Anti-Xpress抗體(Invitrogen,Leek,The Netherlands)和鼠Ig，辣根過氧化物酶聯的完整抗體(綿羊)染色的凝膠(ECL Western印跡檢測試劑和分析系統，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)圖21示用如實施例7描述的對表位990044的抗體和免疫血清染色的凝膠；
圖22示用如實施例7中鑒定的表位990045的抗體和如圖20描述的對照抗體染色的凝膠；圖23示如實施例7中描述的表位990045和免疫血清染色染色的凝膠；圖24示如實施例7中描述的表位990046和對照抗體染色的凝膠；圖25示如實施例7中描述的表位990046和免疫血清染色的凝膠圖26示如實施例8所用的包括報告基因GFP的商業Clonetech載體pEGFP-C2的DNA序列；圖27示pEGFP-C2的質粒圖譜；圖28示如實施例8所用的質粒pGA3103的DNA序列，其中在pEGFP-C2的多克隆位點包括h1ced-6；圖29示pGA3103的質粒圖譜；圖30示來自轉染MOCK(轉染的陰性對照)，pEGFP-N3,pGA3103和pGA3104的COS-1細胞的細胞裂解物；與一抗或未與一抗溫育的Ba/F3細胞的有效免疫共沉淀的對照裂解物；來自EGF刺激的A431細胞的陽性對照裂解物的Western印跡；，使用抗-磷脂酰酪氨酸抗體。印跡A用鼠單抗IgG2檢測細胞裂解物中酪氨酸-磷脂酰化的蛋白；印跡B用抗綠色熒光蛋白的多克隆抗體探查；印跡C用h1Ced-6的兔抗血清探查。H1CED-6的分子量為34435.39；GFP的分子量為26886.32；融合蛋白GFP-CED-6或CED-6-GFP的分子量為62385.95；圖31示質粒pGA1058的DNA序列，其中包括編碼細胞表面受體CD36的DNA序列插入導pEGFP-N3的多克隆位點；圖32示pGA1059的質粒圖譜；圖33示在IL3撤退后膜聯蛋白和碘化丙啶陽性細胞在Ba/F3細胞中的細胞群體中百分比；圖34示溫度對FDF溫育的影響，活的和凋亡的Ba/F3細胞加入巨噬細胞細胞系J774中。吞噬分析后，FDG(10μM)在4℃，20℃溫育1小時，在37℃溫于10和20分鐘。
實施例1用ced-6序列(圖2hced-6的共有區DNA序列)對公共區域數據庫(EST,Genbank,EMBL,Swissport和PIR)的廣泛研究顯示了在蛋白的羧基末端區的某些ESTS的統計學顯著的同源物(AA443368,AA431995,R33389,R53881)。一種Est(T48513)顯示與PTB區的羧基端和帶電區的起始區同源。Marathonready 5’RACE分析，cDNA結腸腺癌庫來自Clontech。RACE和測序中運用的引物的位置如圖1所示。通過隨后的克隆和序列分析，獲得額外的序列信息。運用此額外的序列信息，在數據庫中搜索，揭示額外的EST，使我們得以構建約2400bp的共有序列。該序列可通過集落雜交和額外的RACE產物測序進一步擴大和變化。
實施例2RNA印跡人多種組織Northern(MTN-1,Clontech)，每泳道分別包括來自8種不同人組織(心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎和胰腺)的2mg聚腺苷酸化RNA和MTN-Ⅱ人多種組織Northern，每泳道分別包括來自脾，胸腺，前列腺，睪丸，卵巢，小腸，結腸和外周白細胞的的2mg聚腺苷酸化RNA，根據生產商說明進行雜交，在0.1×SSC，0.2％SDS在55℃洗。同樣來自Clontech，檢測人癌癥細胞系(黑色素瘤G361，肺癌A549，結腸癌SW480，伯基特氏淋巴瘤Raji，淋巴母細胞白血病Molt-4，慢性髓細胞性白血病62,Hela S3和原髓細胞性白血病HL60)的聚腺苷酸化RNA。
HCED-6在正常人組織和癌細胞中的表達模式經Northern印跡如表1所示A)人多種組織Northern(MTN)印跡B)人多種組織Northern(MTN)印跡ⅡC)人癌細胞系多組織Northern(MTNTM)印跡。
表ⅠA) B) C) 實施例3在吞噬細胞系中CED-6(h1CED-6)及其剪接變體(h2CED-6)的檢測細胞系THP-1(美國典型培養物保藏中心ATCC號TIB-202)，一種人單核細胞細胞系，可使用PMA(Sigma-Aldrich,St-Louis,MO,USA)使之分化為巨噬細胞，細胞在標準條件下、含2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES,1mM丙酮酸鈉，0.05mM β-巰基乙醇的RPMI1640培養基中培養。(藥物均購自gibcoBRL，Life Technologies,Merelbeke,Belgium)。
依據生產商說明，或略作改動，使用Rneasy mini試劑盒(Westburg,Leusden,the Netherlands)從此細胞系分離RNA。
依據生產商說明，或略作改動，使用Ready-To-Go T-primed第一鏈試劑盒(Pharmacia Biotech Piscataway,NJ,USA)產生第一鏈cDNA。
產生的cDNA在PCR步驟中用于產生DNA片段，使用引物oGA131:5’-CGCAAGGATCCCCATGAACCGTGCTTTTAGCAGGAAG-3’445-10934-13R:5’-GATCTACTAGGTACTGGAG-3’,PCR使用TaKaRa ex Taq試劑盒(Takara Shuzo Co.,LTD,Shiga，日本)進行，依據生產商說明，或略作改動，質粒pGA1025，包括h1ced-6基因，用作陽性對照。
小結PCR產生第一鏈cDNA，使用Ready-To-Go T-primed第一鏈試劑盒，得到的第一鏈cDNA包括完整的cDNA，其它材料為0.4μloGA131(100pmol/μl),0.4μl 445-10934-13R(100pmol/μl),0.5μl exTaq 5U/μl,65.7μl水。
對陽性對照進行PCR，包括10μl緩沖液exTaq 10×,10μl dNTP混合exTaq 10×,0.4μl oGA131(100pmol/μl),0.4μl 445-10934-13R(100pmol/μl),2μl pGA1025,76.2μl水。
PCR程序 2μl每個PCR反應產物和1μl陽性對照PCR反應的產物用于進行嵌套式PCR，采用下列引物
oGA131同上oGA1415’-GCGGATGGTACCGTCGACTGCTGATACTTGAGTTATTCTCAG-3’PCR使用TaKaRa ex Taq試劑盒(Takara Shuzo Co.,LTD,Shiga，日本)進行，依據生產商說明，或略作改動。
主要混合物5μl緩沖液exTaq 10×,5μl dNTP混合exTaq 10×,0.2μl oGA131(100pmol/μl),0.2μl oGA141(100pmol/μl),0.5μl exTaq 5U/μl,37.1μl水。
程序 根據標準方法對10μl嵌套式PCR產物進行凝膠分析(分子克隆實驗指南，Sambrook等，1989,CSHL出版社)。
在初級活嗜中性細胞，初級凋亡嗜中性細胞，初級巨噬細胞，與凋亡嗜中性細胞相互作用的初級巨噬細胞，鼠單核細胞細胞系J774和COS-1細胞中重復上述步驟。結果如圖6所示。顯著的，僅在細胞系THP-1中能測得h1ced-6和其剪接變體h2ced-6(見圖6的泳道8)。
實施例4人CED-6的穩定細胞系J774鼠單核細胞腫瘤細胞系(Morland和Kaplan,1978，實驗細胞學研究.115:53-61；Morland和Kaplan,1978,實驗細胞學研究.115:63-72 ATCC登記號TIB67，又稱為J774.1)在DMEM中培養，加glutamaxI,10％myclone血清(均購自GIBCoBRL,LifeTechnologies,Merelbeke，比利時)，電穿孔法轉染質粒pEGFP-N3(Clonetech,Palo Alto,CA,USA)，(圖7和8)，模擬轉染，pGA3104,h1CED-6/GFP融合物(圖9和10)，鮭魚精子DNA；陰性對照。
電穿孔用Easyject Plus電穿孔系統(Equibio Ltd,Immunosource,Halle-Zoersel，比利時)，按以下步驟3×106細胞置于800μl細胞培養基中，加入30μg DNA.EasyjectPlus電穿孔儀設為雙脈沖電壓I=750V，電容I=25μF，電阻I=99R，脈沖間延遲=0電壓I=150V，電容I=1500μF，電阻I=99R,Optipulse任選每3500μl電穿孔的細胞接種到175cm2培養瓶中，G418抗性選擇(400μg/ml)(Duchefa,Haarlem,The Netherlands)72小時。獲得并檢測GFP表達的克隆的亞克隆。
實施例5吞噬作用分析制備吞噬細胞穩定轉染pEGFPn3或pGA3104或pGA1058的單核細胞細胞系J774以1×105密度接種在黑色96孔板中37℃,5％CO2，進行吞噬分析前培養36小時。
凋亡細胞的制備穩定轉染β-半乳糖苷酶作為報告基因的生長因子依賴的細胞系Ba/F3,用作凋亡細胞的源。轉染Ba/F3的適當質粒為pcDNA3.1/His/LacZ，如圖11所示。Ba/F3細胞為IL-3依賴的鼠克隆(Palacios和Steinmetz,1985，細胞41:727-734；Palacios等，1984，自然309:126-131)，在加glutamazI,10％FCS,1％抗生素(均購自GIBCOBRL,ibid.)，10％WEHI-3培養物的上清中培養。
WEHI-3(ATCC號:TIB-68)在培養基RPMI 1640,glutamaxI,1O％FCS,3.6μlβ-巰基乙醇/升中生長，產生IL-3。
Ba/F3細胞在相互作用分析兩天前傳代(指數生長期)，Ba/F3細胞(5×106細胞/ml)在無生長因子IL-3條件下培養20小時，而后進行分析。凋亡的Ba/F3細胞使用膜聯蛋白/碘化丙啶標記試劑盒(Boeringher Mannheim,Brussels，比利時)檢測。如20％膜聯蛋白陽性而少于5％的碘化丙啶陰性，Ba/F3細胞為早期凋亡。加有生長因子IL-3的Ba/F3細胞用作陰性對照。膜聯蛋白/碘化丙啶檢測的結果如圖33所示。
向吞噬細胞加入凋亡細胞200μl Ba/F3細胞(1×107細胞/ml)加入到含穩定轉染的J774和陰性對照的孔中，37℃溫育，時間從20分鐘到5小時，之后從所有孔中去除凋亡細胞。吞噬細胞在PBS緩沖液(GIBCOBRL,ibid)中洗3次，注意不要移去細胞。
讀數J774細胞吞噬的凋亡小體檢測通過檢測Ba/F3細胞中表達的β-半乳糖苷酶而實現。檢測采用熒光底物，熒光素雙-b-D-吡喃型半乳糖苷(FDG)(Molecular Probes,Eugene,OR，美國)。向孔中加入10μM FDG，黑暗中室溫溫育1小時。FDG因β-半乳糖苷酶活性水解為FMG和熒光素，在標準平板計數器計數，480mm激發光，520mm發射光，適當敏感度，檢測綠色熒光。
為校準之目的，熒光讀數依賴于不同Ba/F3濃度。作為細胞濃度的熒光讀數如圖12所示。
進一步的實驗運用不同FDG濃度，不同分析的溫育時間，不同分析的溫度和Ba/F3培養基中血清的濃度。結果分別如圖13,14,15和34。
化合物篩選上述的吞噬分析用于篩選化合物，判斷其影響凋亡細胞被專業性吞噬細胞吞噬的水平。所測化合物可加到檢測孔中，約30分鐘，后加入Ba/F3細胞。因為分析的多孔板形式，及自動熒光讀數使用標準設備，該分析典型適合高物料通過量的化合物篩選。
當任何化合物的存在導致無熒光或與未暴露給化合物的吞噬細胞相比，熒光減弱，則應對該孔中的細胞進行活力檢測，實用商業試劑如Live/Dead Viability/Cytotoxicity試劑盒(MolecularProbes,Eugene,USA)。該試劑盒提供兩種顏色熒光細胞活性分析，對活和死細胞同時用兩種探針確定，鈣黃綠素AM和溴化乙啶同型二聚體。從而測定細胞活力的雙參數，細胞內酯酶活性和質膜完整性。該試劑盒適于熒光多孔板掃描儀。活細胞的存在將確認熒光的缺失緣于化合物對吞噬活性的影響，而非僅非特異性的毒性。
進一步的，任何經本分析鑒定為凋亡細胞吞噬的抑制劑或增強劑的化合物，將進一步檢測此作用通過CED-6的調節。當化合物鑒定為凋亡細胞吞噬的增強劑時，通過進行如上述的用為轉染h1ced-6或h2ced-6的J774細胞進行吞噬細胞分析。如果化合物能在J774細胞中誘導與轉染hced-6的細胞中相同的表型，說明化合物不一定通過CED-6或CED-6信號傳導通路作用。
相似的，如果化合物鑒定為凋亡細胞吞噬的抑制劑時，通過檢測暴露給化合物的轉染的J774的表型，確認該作用通過CED-6或CED-6信號傳導通路作用。對野生型表型的逆轉說明反應通過CED-6信號傳導通路。
實施例6抗人CED-6得多克隆抗體多克隆抗體在兔中培養，抗下列ced-6表位EP990044 H2N-NRA FSR KKD KTC CONH2EP990045 H2N-CFL GST EVE QPK GTE CONH2EP990046 H2N-CTR NGT QPP PVP SRS T CONH2這些表位在ced-6蛋白中的定位如圖16所示。
多克隆抗體通過Eurogentec Bel(Herstal，比利時)制備，按照下列步驟第0天去免疫前血清，第一次免疫接種第14天第二次免疫接種第28天第三次免疫接種第38天采血樣(取血2ml)第56天第4次免疫第66天采血樣(取血2+20ml)第80天完成取血實施例7Western印跡檢測抗體在TOP10感受態細胞中轉化質粒pGA1028(pBAD/His A-hCED-6)(見圖17和18)。用pBAD/His轉化相同的大腸桿菌細胞作為陰性對照。pBAD/His A和大腸桿菌TOP10購自Invitrogen(Leek,TheNetherlands)。
使用pBAD-載體表達系統，它為一種已知的高效表達系統。當阿拉伯糖存在時，pbAD的表達開始，而缺乏阿拉伯糖時，pBAD轉錄水平極低。根據生產商說明進行先導表達，其中阿拉伯糖的量不同，確定蛋白的最高表達所需的阿拉伯糖的量。方法依據生產商(Invitrogen,Lekk,The Netherlands)。用同樣方法進行大量表達。
蛋白的純化在轉化pGA1028的大腸桿菌細胞中進行5ml裂解緩沖液(10ml TE 1×pH9,0.5mg./ml溶菌酶，0.1mg/ml DNAse,100μl 1M CaCl2400μl蛋白酶抑制劑25×)加入到50ml誘導表達的培養物沉淀物，沉淀在裂解緩沖液中重懸。重懸物在冰上放置30分鐘，超聲3次，每次5秒(高密度)，隨后重懸物經過3個凍融循環(液氮-42℃)，在37℃放置30分鐘。重懸物以最大轉速離心5分鐘。沉淀包括不可溶部分和hCED-6融合蛋白，在1ml 2M尿素中重懸，1200rpm振搖5分鐘。重懸物以最大轉速離心5分鐘，上清用于凝膠電泳和Western印跡。25μl上清和25μl預混SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳樣品緩沖液(Bio Rad-Hercules,CA，美國)混合。
來自陰性對照的蛋白不純化。pBAD/His轉化的大腸桿菌如下制備，沉淀1ml誘導的大腸桿菌培養物，沉淀在1ml預混SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳樣品緩沖液(Bio Rad-Hercules,CA，美國)中重懸。重懸物用于PAGE凝膠電泳。
制備的樣品加入到凝膠樣品煮沸5分鐘，加樣前置于冰上。向制備的凝膠TrisHCl,4-15％(Bio Rad-Hercules,CA，美國)50μl加樣孔加25μl樣品，電泳依照生產商說明進行。使用MiniTransBlot electrophoresis cell(Bio Rad-Hercules,CA，美國)將膠上的蛋白轉到硝酸纖維素膜(Trans-blot Transfermedim,Bio Rad-Hercules,CA，美國)，依照生產商說明進行(BioRad-Hercules,CA，美國)。
根據抗體的供應商和檢測試劑盒進行Western印跡。一抗，兔的免疫血清或免疫前血清在PBST(1.44g/L KH2P04,90g/LNaCl,7.75g/L Na2HPO4.7H20,0.1％Tween)中按1/2000稀釋。二抗抗兔，辣根過氧化物酶偶聯的完整抗體(donkey)在PBST(0.1％)中按1/4000稀釋(ECL Western印跡檢測試劑和分析系統，AmershamPharmacia Biotech，UK,England)。
溫育按生廠商說明進行，稍做改動。第一抗體在PBST而不是在TBST中溫育過夜。抗體的檢測根據生產商的教導進行(ECL Western印跡檢測試劑和分析系統，Amersham PharmaciaBiotech,UK,England)。在ECL試劑盒檢測，根據生產商的教導刮去和再標記膜。
根據生產商的教導進行抗HisA抗體(Invitrogen,Leek，荷蘭)的Western印跡，同時有對照抗體。以1/5000稀釋在PBST(0.1％)(Invitrogen,Leek，荷蘭)中抗-Xpress抗體用作第一抗體。二抗小鼠Ig，辣根過氧化物酶偶聯的全長抗體(來源于綿羊)，以1/4000稀釋于PBST中(0.1％)(ECL Western印跡檢測試劑和分析系統，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)。
實驗中抗體染色依據依照生產商說明進行(ECL Western印跡檢測試劑和分析系統，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)。
結果如圖20到25所示。
實施例8H-CED-6與酪氨酸磷酸化蛋白免疫共沉淀抗h1CED-6的3個表位的抗體用于Western印跡，檢測CED-6與酪氨酸磷酸化蛋白的相互作用，鑒定CED-6相互作用蛋白。
轉染質粒pGA3103(見圖26-29)和pGA3104(見圖7-10)轉染175cm2方瓶中的COS-1細胞(1×107細胞)。陰性對照MOCK和pEGFP-N3。調查全長人ced-6(處于GFP閱讀框中，N端和C端融合，內部控制)。COS-1細胞用脂質轉染胺Plus試劑(GIBCO-BRL)轉染。下附LifeTechnologies的方法，體積如表2所示。
MOCK轉染的蛋白為轉染的陰影對照。向細胞中僅加入DNA的溶劑而不加DNA。DNA的溶劑為TE緩沖液，pH=8:1M Tris(ICN)ph=8和0.5 M EDTA(Merck-Belgolabo)pH=8溶于水中。
表2 175cm2方瓶中脂質轉染胺轉染(Life Technologies)COS-1細胞
磷酸化的Ba/F3細胞的IL-3受體的β-鏈作為磷酸化的陽性對照。
使用毛地黃毒苷制備COS-1細胞裂解物(盡量輕柔，不要破壞相互作用)，向裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑(蛋白酶抑制劑，優選混合物或pefablock)。
以低嚴緊型毛地黃毒苷為基礎的緩沖液10ml bidi中毛地黃毒苷的緩沖液1％毛地黃毒苷(Serva 19551，分子量1229.3)SERVA2％母液=250mg溶于12.5ml10mM三羥乙基胺pH7.8(Sigma-Aldrich；Bornem,Belgium 10×母液100mM=185.7mg溶于10ml pH7.8(5ml稀釋為50ml)O.15M NaCl(MW 58.44) 87.66 mg/ml2mM EDTA(Titriplex Ⅲ) 分子量372.24)(Darmstadt，德國)7.444mg每10ml200U/ml抑酶肽-Trazilol(Sigma-Aldrich,Bornem,Belgium)1mg=11TIU=9900KU200x母液10mg溶于2ml PBS中=49500KU(10ml中含50μl)1mM Pefabloc(Merck,Darmstadt，德國)2.4mg每10ml細胞的裂解轉染細胞在falcon中Dulbeccco氏PBS(GIBCOBRL)洗2次刮細胞，沉淀在300μl裂解緩沖液中重懸所有操作在4℃進行制備物4000rpm離心，上清轉移到新管中預清除蛋白G瓊脂糖CL-4B珠(Amersham Pharmacia,Roosendaal,theNetherlands)以凍干的添加劑形式提供。這些添加物可在中性pH洗去，由乙醇替代裂解緩沖液。
50％v/v蛋白G瓊脂糖懸液吸取1ml 50/50/v/v蛋白G瓊脂糖并以最高轉速離心5秒鐘，隨后在等體積裂解緩沖液中重懸。洗3次。
向300μl裂解液中加入50μl蛋白G瓊脂糖CL-4B珠(AmershamPharmacia,ibid.)，作用1小時。
4℃14000rpm離心10秒，上清轉入新管。
免疫共沉淀COS-1裂解物加入5μl抗-綠色熒光蛋白(GFP)多克隆兔抗(Immunosource,Halle-Zoersel，比利時)凍干形式溶于100μl蒸餾水中，-20℃凍存。
Ba/F3裂解物5號加入5μl抗IL-3受體的β-鏈的兔抗(Vander heyden J.,Devos R.,Plaetinck G.,Fache I.,Fiers W.,Tavernier J.1991.運用系列單克隆抗體對鼠IL-5受體復合物的鑒定，該復合物與鼠IL-3受體的關系。免疫學雜志。147:3412-3418)Ba/F3裂解物6號不加抗體樣品在4℃溫育4小時和24小時(過夜)，旋轉加入50μl蛋白A珠，4℃溫育1小時樣品4℃3000rpm離心3分鐘珠子重懸在800μl裂解緩沖液中，倒轉幾次或旋轉幾分鐘，4℃3000rpm離心3分鐘。重復3此，最后用毛細管去除清洗緩沖液珠子在20μl SDS加樣緩沖液(含巰基)中重懸。
裂解液7號=EGF-刺激的A431細胞裂解液(抗磷酸酪氨酸)(Upstate Biotechnology,Cat.No.12-302)2.5μl β-巰基乙醇加入到煮沸的100μl裂解液和樣品中。
樣品離心3000rpm，3分鐘(4℃),SN加到SDS PAGE中，使用預染的SDS-PAGE低分子量標準(BioRad cat.no161-0305)Western印跡細胞裂解物轉移到硝酸纖維素膜上轉移緩沖液=4BmM Tris，39 mM甘氨酸，20％甲醇，pH9.2(5.82g Tris,2.93g甘氨酸，200ml甲醇，溶于1升水中)封閉緩沖液1×PBS,0.1％Tween,5％奶粉，溫育過夜抗磷酸酪氨酸標記Gel(cat.05-321,Upstate Biotechnology):1μg/ml 3小時，PBS 0.1％Tween洗2次，每次5分鐘蛋白顯色，使用1:4000山羊抗鼠辣根過氧化物酶(cat.No RPN2108,Amersham Pharmacia biotech)二抗，室溫1小時。
PBS 0.1％Tween洗膜2次，每次5分鐘，封閉液洗膜2次，每次5分鐘，水洗膜2次，每次5分鐘。
ECL Western印跡分析系統ECL Western印跡檢測試劑購自Amersham PharmaciaBiotech(cat.no RPN 2108)。
ECL檢測試劑盒檢測后洗去結合抗體并重標記膜ECL檢測試劑盒檢測后洗去結合抗體并重標記膜。每次免疫檢測后，膜在4℃保鮮膜中保持濕潤。
膜浸入剝離緩沖液中(100mM β-巰基乙醇，2％SDS,62.5mM Tris-HCl pH6.7)，50℃溫育30分鐘，偶爾攪拌。
膜在PBS，0.1％Tween中洗2×10分鐘，室溫下使用大體積洗膜緩沖液。
膜在封閉緩沖液中室溫封閉1小時。
使用抗綠色熒光GFP免疫檢測，用抗人CED-6重復結果所有細胞裂解物的Western印跡用抗磷酸酪氨酸，抗-綠色熒光蛋白(GFP)或抗CED-6的兔血清標記，如圖30印跡(A),(B)和(C)。抗磷酸酪氨酸染色的，一條49和74KD間的條帶出現在專染GFP和CED-6的融合蛋白的COS-1細胞裂解物中，而在對照COS-1細胞裂解物中不出現。抗-GFP和抗-CED-6的Western印跡也染色相同的49和74KD間的條帶。
結論融合蛋白CED-6-GFP和GFP-CED-6都為酪氨酸磷酸化的。它們的分子量為62385.95，表明在49和74KD間的條帶為抗磷酸酪氨酸，抗綠色熒光蛋白(GFP)和抗-CED-6的陽性染色。
實施例9穩定細胞系用人細胞表面受體CD36轉染。
J774鼠單核細胞腫瘤細胞系通過電穿孔用質粒pGA1058轉染，如圖31和32所示。方法如實施例4轉染人ced-6描述的。
轉染的細胞系用作使用實施例5方法的吞噬分析的陽性對照。
實施例10從PC12產生凋亡顆粒。
PC-12細胞系(ATCC號:CRL-1712)(Mesner P.W.,Winters T.R.,Green S.H.，(1992)細胞生物學雜志.119:1669-1680)趨于成團生長。加入神經生長因子β(50ng/ml終濃度，Sigma)，PC-12細胞分化為神經元細胞。神經生長因子撤除5天后，誘導神經元大鼠PC12細胞程序性細胞死亡。細胞在含2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES和1mM丙酮酸鈉，10％馬血清，5％胎牛血清的RPMI1640(Life Technologies)中培養。
這些細胞可使用上述的膜聯蛋白/PI試劑盒檢測其凋亡特性。
序列表本文如圖所示的核苷酸和氨基酸序列對應下列SEQ ID NOs。
SEQ ID NO:1圖1SEQ ID NO:2圖2SEQ ID NO:3圖3SEQ ID NO:4圖4SEQ ID NO:5圖5SEQ ID NO:6圖7SEQ ID NO:7圖9SEQ ID NO:8圖11
SEQ ID NO:9 圖17SEQ ID N0:10圖19SEQ ID N0:11圖26SEQ ID N0:12圖28SEQ ID N0:13圖31
序列表<110>DEVGEN NV<120>吞噬分析方法<130>SCB/50784/023<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2416<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(430)..(1344)<400>1ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgctaaattc gcttggccgg gtccaccttc 60tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct ctattctgag 120gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt 180tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagctgg acgctgcagc 240tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaactgat 300agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagctatata aagtcaagtg tccattttct 360ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtcgtgga actgaacatt tatttggctg 420atcctcatc atg aac cgt gct ttt agc agg aag aaa gac aaa aca tgg atg 471Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met1 5 10cat aca cct gaa gct tta tca aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag 519His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys15 20 25 30ttt ctt ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg 567Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val35 40 45aga gat gct gta agg aaa cta aag ttt gca aga cat atc aag aaa tct 615Arg Asp Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser50 55 60gaa ggc cag aaa att cct aaa gtg gag ttg caa ata tca att tat gga 663Glu Gly Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly65 70 75gta aaa att cta gaa ccc aaa aca aag gaa gtt caa cac aat tgc cag 711Val LVs Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val Gln His Asn Cys Gln
80 85 90ctt cat aga ata tct ttt tgt gca gat gat aaa act gac aag agg ata759Leu His Arg Ile Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr Asp Lys Arg Ile95 100 105 110ttc act ttc ata tgc aaa gat tct gag tca aat aaa cat ttg tgc tat807Phe Thr Phe Ile Cys Lys Asp Ser Glu Ser Ash Lys His Leu Cys Tyr115 120 125gta ttt gac agc gaa aag tgt gct gaa gag atc act tta aca att ggc855Val Phe Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly130 135 140caa gca ttt gac ctg gca tac agg aaa ttt cta gaa tca gga gga aaa903Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys145 150 155gat gtt gaa aca aga aaa cag atc gca ggg tta caa aaa aga atc caa951Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln160 165 170gac tta gaa aca gaa aat atg gaa ctt aaa aat aaa gta caa gat ttg999Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln Asp Leu175 180 185 190gaa aac caa ctg aga ata act caa gta tca gca cct cca gca ggc agt1047Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser195 200 205atg 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ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga 1504tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt 1564tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg 1624tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt 1684tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat 1744gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg 1804acagatstca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac 1864staatgccac aaggtcacta atttctagca ggtaasatta taaggatata aattccaata 1924staaaccaaa tgtatttags gtatttatta gtaaatgcaa ggtgatgtta gttatgatca 1984gttatactct aaatatttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat 2044ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa 2104gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca 2164gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactsct 2224cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc 2284tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg 2344taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aaaaaaaaaa 2404aaaaaactcg ag 2416<210>2<21l>304<212>蛋白質<213>人類<400>2Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr1 5 10 15Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu20 25 30Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val Arg Asp35 40 45Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser Glu Gly50 55 60Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly Val Lys65 70 75 80Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val Gln His Asn Cys Gln Leu His85 90 95Arg Ile Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr Asp Lys Arg Ile Phe Thr100105 110Phe Ile Cys Lys Asp Ser Glu Ser Asn Lys His Leu Cys Tyr Val Phe115 120 125Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly Gln Ala130 135 140Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Val145 150 155 160Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln Asp Leu165 170 175Glu Thr Glu Ash Met Glu Leu Lys Ash Lys Val Gln Asp Leu Glu Ash180 185 190Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser Met Thr195 200 205Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe Ser Pro210 215 220Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln Pro Pro225 230 235 240Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Leu Phe Gly Ala245 250 255Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro Pro Asp260 265 270Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met Gly Leu275 280 285Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser Arg Cys290 295 300<210>3<211>2278<212>DNA<213>人類<220><221>CDS<222>(430)..(1206)<400>3ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgctaaattc gcttggccgg gtccaccttc 60tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct ctattctgag 120gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt 180tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagctgg acgctgcagc 240tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaactgat 300agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagctatata aagtcaagtg tccattttct 360ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtcgtgga actgaacatt tatttggctg 420atcctcatc atg aac cgt gct ttt agc agg aag aaa gac aaa aca tgg atg 471Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met1 5 10cat aca cct gaa gct tta tca aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag 519His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Prc Tyr Asn Ala Lys15 20 25 30ttt ctt ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg 567Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val35 40 45aga gat gct gta agg aaa cta aag ttt gca aga cat atc aag aaa tct 615Arg Asp Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser50 55 60gaa ggc cag aaa att cct aaa gtg gag ttg caa ata tca att tat gga 663Glu Gly Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly65 70 75gta aaa att cta gaa ccc aaa aca aag gct gaa gag atc act tta aca 711Val Lys Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr80 85 90att ggc caa gca ttt gac ctg gca tac agg aaa ttt 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gca gca gat 1095Leu Phe Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp210 215 220ttc cct cca gat att caa tca aaa tta gat gag atg cag gag ggg ttc 1143Phe Pro Pro Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe225 230 235aaa atg gga cta act ctt gaa ggc aca gta ttt tgt ctc gac ccg tta 1191Lys Met Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu240 245 250gac agt agg tgc tga catcaagaac aagaaatcct gattcatgtt aaatgtgttt 1246Asp Ser Arg Cys255gtatacacat gtcatttatt attattactt taagataggt attattcatg tgtcaatgtt 1306tttgaatatt ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga 1366tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt 1426tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg 1486tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt 1546tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat 1606gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg 1666acagatatca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac 1726ataatgccac aaggtcacta atttctagca ggtaaaatta taaggatata aattccaata 1786ataaaccaaa tgtatttaga gtatttatta gtaaatgcaa ggtgatgtta gttatgatca 1846gttatactct aaatstttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat 1906ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa 1966gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca 2026gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactact 2086cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc 2146tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg 2206taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aaaaaaaaaa 2266aaaaaactcg ag 2278<210>4<211>258<212>蛋白質<213>人類<400>4Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr1 5 10 15Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu20 25 30Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val Arg Asp35 40 45Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser Glu Gly50 55 60Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly Val Lys65 70 75 80Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly85 90 95Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys100 105 110Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln115 120 125Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln Asp Leu130 135 140Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser145 150 155 160Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe165 170175Ser Pro Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln180 185 190Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Leu Phe195 200 205Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro210 215 220Prc Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met225 230 235 240Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser245 250 255Arg Cys<210>5<211>5619<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述pGA3104-a構建物包括直隆到載體pEGFP-N3多克隆位點的hlced-6cDNA<400>5gatccccatg aaccgtgctt ttagcaggaa gaaagacaaa acatggatgc atacacctga 60agctttatca aaacatttca ttccctataa tgcaaagttt cttggcagta cagaagtgga 120acagccaaaa ggaacagaag ttgtgagaga tgctgtaagg aaactaaagt ttgcaagaca 180tatcaagaaa tctgaaggcc agaaaattcc taaagtggag ttgcaaatat caatttatgg 240agtaaaaatt ctagaaccca aaacaaagga agttcaacac aattgccagc ttcatagaat 300atctttttgt gcagatgata aaactgacaa gaggatattc actttcatat gcaaagattc 360tgagtcaaat aaacatttgt gctatgtatt tgacagcgaa aagtgtgctg aagagatcac 420tttaacaatt ggccaagcat ttgacctggc atacacgaaa tttctagaat caggaggaaa 480agatgttgaa acaagaaaac agatcgcagg gttacaaaaa agaatccaag acttagaaac 540agaaaatatg gaacttaaaa ataaagtaca agatttggaa aaccaactga gaataactca 600agtatcagca cctccagcag gcagtatgac acctaagtcg ccctccactg acatctttga 660tatgattcca ttttctccaa tatcacacca gtcttcgatg cctactcgca atggcacaca 720gccacctcca gtacctagta gatctactga gattaaacgg gacctgtttg gagcagaacc 780ttttgaccca tttaactgtg gagcagcaga tttccctcca gatattcaat caaaattaga 840tgagatgcag gaggggttca aaatgggact aactcttgaa ggcacagtat tttgtctcga 900cccgttagac agtaggtgcg tcgacggtac cgcgggcccg ggatccatcg ccaccatggt 960gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 1020cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1080gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1140gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1200cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1260ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1320ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 1380ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1440caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1500ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1560gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1620ggagttcgtg 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aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtcctgaggc 2520ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 2580gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 2640ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 2700gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 2760ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 2820ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa agatcgatca 2880agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 2940ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 3000tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 3060cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 3120gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 3180gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 3240agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 3300attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 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180tatcaagaaa tctgaaggcc agaaaattcc taaagtggag ttgcaaatat caatttatgg 240agtaaaaatt ctagaaccca aaacaaagga agttcaacac aattgccagc ttcatagaat 300atctttttgt gcagatgata aaactgacaa gaggatattc actttcatat gcaaagattc 360tgagtcaaat aaacatttgt gctatgtatt tgacagcgaa aagtgtgctg aagagatcac 420tttaacaatt ggccaagcat ttgacctggc atacacgaaa tttctagaat caggaggaaa 480agatgttgaa acaagaaaac agatcgcagg gttacaaaaa agaatccaag acttagaaac 540agaaaatatg gaacttaaaa ataaagtaca agatttggaa aaccaactga gaataactca 600agtatcagca cctccagcag gcagtatgac acctaagtcg ccctccactg acatctttga 660tatgattcca ttttctccaa tatcacacca gtcttcgatg cctactcgca atggcacaca 720gccacctcca gtacctagta gatctactga gattaaacgg gacctgtttg gagcagaacc 780ttttgaccca tttaactgtg gagcagcaga tttccctcca gatattcaat caaaattaga 840tgagatgcag gaggggttca aaatgggact aactcttgaa ggcacagtat tttgtctcga 900cccgttagac agtaggtgct gagtcgacgg taccatatgg gaattcgaag cttggctgtt 960ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 1020tgataaaaca gaatttgcct 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構建包括克隆到載體pEGFP-C2多克隆位點的人hlced-6 cDNA<400>7tcgacggtac cgcgggcccg ggatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata 60ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 120aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 180aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 240gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt aacgcgtaaa ttgtaagcgt taatattttg 300ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 360ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt 420tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc 480tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 540tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 600aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 660ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 720ctacagggcg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 780tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 840caataatatt gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc 900agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 960tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 1020aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc 1080ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt 1140atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt 1200ttggaggcct aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg 1260attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 1320tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 1380caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 1440gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 1500gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 1560ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 1620cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 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權利要求
1．一種表達載體，包括編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列，其中人CED-6蛋白包括圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的氨基酸序列的差異僅有功能保守性的氨基酸變化的氨基酸序列。
2．權利要求1的表達載體，包括圖2或圖3所示的從轉錄起始密碼子到轉錄終止密碼子的脫氧核苷酸序列。
3．權利要求1或2的表達載體，它包括編碼位于所述載體中的報告基因的脫氧核苷酸序列，結果是人CED-6蛋白或其功能保守的變體的表達導致該報告基因表達報告蛋白。
4．權利要求3的表達載體，其中報告基因位于編碼人CED-6蛋白或其功能保守的變體的脫氧核苷酸序列的5’端。
5．權利要求3的表達載體，其中報告基因位于編碼人CED-6蛋白或其功能保守的變體的脫氧核苷酸序列的3’端。
6．權利要求3到5中任意一項的表達載體，其中報告基因編碼綠色熒光蛋白(GFP)。
7．權利要求4的表達載體，它為在多克隆位點插入了編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列的pEGFP-C2，其中人CED-6蛋白包括如圖4或圖5所示的氨基酸序列或其功能保守的變體。
8．權利要求5的表達載體，它為在多克隆位點插入了編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列的pEGFP-N3，其中人CED-6蛋白包括如圖4或圖5所示的氨基酸序列或其功能保守的變體。
9．權利要求4或7的表達載體，其中所述的載體包括圖28的核苷酸序列(pGA3103)。
10．權利要求5或8的表達載體，其中所述載體包括圖9的核苷酸序列(pGA3104)。
11．權利要求1或2的表達載體，其中所述載體表達人CED-6蛋白或其功能保守的變體，且在載體的氨基和/或羧基端包括表位標記。
12．權利要求11的表達載體，其中表位標記為HisA。
13．權利要求11的表達載體，它為pBAD/HisA，插入有編碼人CED-6蛋白的脫氧核苷酸序列，人CED-6蛋白包括如圖4或圖5所示的氨基酸序列，或其功能保守的變體。
14．權利要求12的表達載體，它具有圖17所示的脫氧核苷酸序列(pGA1028)。
15．用權利要求1到13中任一項的表達載體轉染的哺乳動物細胞系。
16．權利要求15的哺乳動物細胞系，其中所述細胞選自成纖維細胞細胞系或上皮細胞細胞系。
17．權利要求16的哺乳動物細胞系，其中所述細胞系選自COS1,BHK21,L929,CV1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48，或G361。
18．權利要求15的哺乳動物細胞系，其中所述細胞系為初級細胞系。
19．權利要求18的哺乳動物細胞系，其中所述細胞系選自人皮膚FIBs，皮膚角質細胞，白細胞，單核細胞，淋巴細胞，樹突細胞或巨噬細胞。
20．權利要求19的哺乳動物細胞系，它為鼠巨噬細胞系J774或人單核細胞細胞系THP-1。
21．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否是促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的抑制劑或增強劑，該方法包括將權利要求15到20中任意一項的轉化的哺乳動物細胞暴露給凋亡顆粒，并測定在化合物存在或缺乏時，顆粒被轉染細胞吞噬的速率。
22．權利要求21的方法，其中在加入凋亡顆粒前將轉染的細胞暴露給化合物。
23．權利要求21或22的方法，其中凋亡顆粒選自凋亡嗜中性細胞，凋亡淋巴細胞或視需要而定經過調理的紅細胞。
24．權利要求21到23中任意一項的方法，其中凋亡顆粒包括貼壁細胞系PC12。
25．權利要求21到23中任意一項的方法，其中凋亡顆粒包括生長因子依賴性的小鼠細胞系Ba/F3。
26．權利要求25的方法，其中Ba/F3細胞通過在缺乏生長因子IL-3時培養以發生凋亡。
27．權利要求23到26中任意一項的方法，其中包括凋亡顆粒的細胞穩定轉染了報告基因。
28．權利要求27的方法，其中報告基因選自編碼β-半乳糖苷酶的基因，編碼熒光蛋白的基因或編碼能夠產生熒光的蛋白的基因。
29．權利要求28的方法，其中能發光的蛋白為熒光素酶。
30．權利要求28的方法，其中所述的熒光蛋白為綠色熒光蛋白。
31．權利要求26的方法，其中凋亡顆粒包括穩定轉染了β-半乳糖苷酶或熒光素酶的Ba/F3細胞。
32．權利要求26的方法，其中吞噬作用的水平通過添加一種能夠被β-半乳糖苷酶轉化為熒光化合物的底物進行檢測的。
33．權利要求21到32中任意一項的方法，其中如果在暴露給待測化合物時，沒有觀察到吞噬作用或吞噬的量減少，應檢測哺乳動物轉染細胞的活力。
34．權利要求33的方法，其中如果細胞有活力，將哺乳動物轉染的細胞的表型與相同細胞系的未轉染的哺乳動物細胞表型相比。
35．權利要求21到32中任意一項的方法，其中如果在待測化合物存在時，觀察到吞噬的量的增加，該方法包括進一步將所述的化合物暴露給未轉染的相同細胞系的哺乳動物細胞，并觀察化合物是否誘導與轉染哺乳動物細胞表現的表型相同的表型。
36．通過權利要求21到35任意一項的方法鑒定的化合物，它被鑒定為促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的抑制劑或增強劑。
37．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否為促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的抑制劑或增強劑，該方法包括以下步驟(1)向哺乳動物細胞顯微注射包括圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的氨基酸序列的差異僅有功能保守性的氨基酸變化的氨基酸序列的人CED-6蛋白；(2)將步驟(1)產生的哺乳動物細胞暴露給凋亡顆粒并測定顆粒被細胞在化合物存在或缺乏時吞噬的速率。
38．權利要求37的方法，其中顯微注射的哺乳動物細胞在加入凋亡顆粒前被暴露給化合物。
39．權利要求38的方法，其中凋亡顆粒選自凋亡嗜中性細胞，凋亡淋巴細胞或視需要而定經調理的凋亡紅細胞。
40．權利要求37或38中的方法，其中凋亡顆粒包括貼壁細胞系PC12。
41．權利要求37到39中任意一項的方法，其中凋亡細胞包括生長因子依賴的小鼠細胞系Ba/F3。
42．權利要求41的方法，其中Ba/F3細胞通過在生長因子IL-3缺乏時培養產生凋亡。
43．權利要求39到42中任意一項的方法，其中包括凋亡顆粒的細胞穩定轉染了報告基因。
44．權利要求27的方法，其中報告基因選自編碼β-半乳糖苷酶的基因，編碼熒光蛋白的基因或編碼能發光的蛋白的基因。
45．權利要求44的方法，其中所述的蛋白能產生的熒光為熒光素酶。
46．權利要求44的方法，其中熒光蛋白是綠色熒光蛋白。
47．權利要求42的方法，其中凋亡顆粒包括穩定轉染了β-半乳糖苷酶的Ba/F3細胞。
48．權利要求47的方法，其中吞噬作用的水平通過加入能夠被β-半乳糖苷酶轉換化熒光化合物的底物進行探測。
49．權利要求37到48中任意一項的方法，其中哺乳動物細胞是成纖維細胞或上皮細胞。
50．權利要求49的方法，其中哺乳動物細胞選自COS1,BHK21,L929,CV1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。
51．權利要求37到48中任意一項的方法，其中哺乳動物細胞為一種初級細胞。
52．權利要求51的方法，其中所述的哺乳動物細胞選自人皮膚FIBs，皮膚角質細胞，白細胞，單核細胞，淋巴細胞，樹突細胞或巨噬細胞。
53．權利要求52的方法，其中哺乳動物細胞是小鼠巨噬細胞J774或人單核細胞THP-1。
54．權利要求37到53中任意一項的方法，如果在暴露給待測化合物時，沒有觀察到吞噬作用或吞噬的量減少，應檢測哺乳動物轉染細胞的活力。
55．權利要求54的方法，其中如果細胞有活力，將哺乳動物轉染的細胞的表型與相同細胞系的未轉染的哺乳動物細胞表型相比。
56．權利要求21到32中任意一項的方法，其中如果在待測化和物存在時，觀察到吞噬的量的增加，該方法包括進一步暴露化合物給未轉染的相同細胞系的哺乳動物細胞，并觀察化合物是否誘導與轉染哺乳動物細胞表現的表型相同的表型。
57．通過權利要求37到56任意一項的方法鑒定的化合物，它被鑒定為促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的抑制劑或增強劑。
58．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否為促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的抑制劑或增強劑，該方法包括以下步驟(1)向哺乳動物細胞顯微注射或轉染一種載體，該載體表達與如圖2或圖3所示的核苷酸序列的所有或一部分反義的RNA序列；(2)向凋亡顆粒暴露步驟1制備的哺乳動物細胞并測量當化合物存在或缺失時顆粒被細胞吞噬的速率。
59．權利要求58的方法，其中反義RNA包括在高于2×SSC；0.1％SDS；25℃-50℃嚴格條件下能與圖2或圖3的所示的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
60．權利要求58或59的方法，包括權利要求38到56任意一項的特征。
61．通過權利要求58到60任意一項的方法確定的化合物，其中的方法可以確定所述化合物是否是促進凋亡細胞吞噬的信號傳導通路的抑制劑或增強劑。
62．一種肽，它包括具有如圖4的氨基酸序列的人CED-6同源物的片段，其中所述片段包括氨基酸序列NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。
63．權利要求62的肽，由氨基酸序列NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGET或TRNGTQPPPVPSRST組成。
64．一種抗體制備物，它包括抗下列如圖4的人CED-6同源物的一或更多表位的抗體NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。
65．一種抗體制備物，包括抗人CED-6同源物表位NRAFSRKKDKTC的抗體。
66．一種抗體制備物，包括抗人CED-6同源物表位FLGSTEVEQPKGTE的抗體。
67．一種抗體制備物，包括抗人CED-6同源物表位TRNGTQPPPVPSRST的抗體。
68．權利要求63到66中任意一項的抗體制備物，其中所述抗體為多克隆抗體。
69．一種方法，用于診斷與個體吞噬細胞中人CED-6蛋白的過表達或低表達相關的疾病，包括(a)從所述個體獲得吞噬細胞樣品；(b)向權利要求64到68中任意一項的抗體制備物暴露吞噬細胞；(c)定量測定在抗體和所述CED-6蛋白之間形成的任意的免疫復合物的存在；(d)與來自對照個體的吞噬細胞比較形成免疫復合物的量。
70．一種方法，用于確定一種化合物是否是促進凋亡細胞吞噬的信號轉導通路的抑制劑或增強劑，包括(a)向檢測的化合物暴露轉染了權利要求1到14中任意一項的表達載體的轉染的哺乳動物細胞；(b)向哺乳動物細胞暴露權利要求64到68中任意一項的抗體制備物；(c)定量測量抗體和所述細胞表達的蛋白之間形成的免疫復合物的存在；(d)將檢測的免疫復合物量與未暴露給化合物的如步驟(a)轉染的哺乳動物細胞中檢測的免疫復合物的量的水平進行比較。
71．權利要求70的方法，其中哺乳送物細胞選自COS1,BHK21,L929,CU1 SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。
72．權利要求71的方法，其中哺乳動物細胞是COS1細胞。
73．權利要求70的方法，其中哺乳動物細胞是人皮膚FIB，皮膚角質細胞，白細胞，單核細胞或巨噬細胞。
74．權利要求73的方法，其中所述細胞是小鼠單核細胞J774或人單核細胞THP-1。
75．一種融合蛋白，包括(1)一種圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的序列的差異僅僅有功能保守型的氨基酸變化的氨基酸序列；和(2)一種為報告基因的表達產物的蛋白。
76．權利要求75的融合蛋白，它由表達GFP和圖9或28所示的h1ced-7編碼序列而獲得。
77．一種融合蛋白，包括(1)一種如圖4或圖5的氨基酸序列或其與圖4或圖5的氨基酸序列的差異僅在功能保守性上發生氨基酸變化的序列，和(2)一種表位標記。
78．權利要求77的融合蛋白，它通過表達HisA和圖17所示的hlced-6編碼序列而獲得。
79．一種方法，該方法用于確定一種化合物是否是促進凋亡細胞吞噬的信號轉導通路的抑制劑或增強劑，該方法包括(a)在待測化合物存在或缺乏時，向凋亡的哺乳動物細胞暴露哺乳動物專業性或半專業性吞噬細胞，該凋亡的哺乳動物細胞穩定轉染了能夠產生無需顯微鏡探測的信號的報告基因，(b)移除未被所述吞噬細胞吞噬的凋亡細胞(c)探測任何來自吞噬細胞的信號；其中在化合物存在時與化合物缺乏時相比任何信號的差異說明該化合物是凋亡細胞吞噬作用的抑制劑或增強劑。
80．權利要求79的方法，其中吞噬細胞是小鼠細胞系J774或人單核細胞系THP-1。
81．權利要求80的方法，其中單核細胞系經培養使之在暴露給凋亡顆粒前分化為巨噬細胞。
82．權利要求79到81中任意一項的方法，其中吞噬細胞是轉基因細胞。
83．權利要求82的方法，其中吞噬細胞用權利要求1到14的任意一項的表達載體轉染。
84．權利要求82的方法，其中吞噬細胞用編碼細胞表面受體CD36的表達載體轉染。
85．權利要求84的方法，其中吞噬細胞用圖31的載體轉染。
86．權利要求79到85的方法，其中凋亡細胞包括貼壁細胞PC12。
87．權利要求79到85的方法，其中凋亡細胞包括生長因子依賴的小鼠細胞系Ba/F3。
88．權利要求26的方法，其中Ba/F3細胞在生長因子IL-3缺乏條件下培養時發生凋亡。
89．權利要求88的方法，其中在約20％膜聯蛋白陽性且少于5％碘化丙啶陰性時，細胞被認為是凋亡。
90．權利要求79的方法，其中報告基因選自編碼β-半乳糖苷酶的基因，編碼熒光蛋白的基因或編碼能夠產生熒光的蛋白的基因。
91．權利要求90的方法，其中能夠產生熒光的蛋白是熒光素酶。
92．權利要求91的方法，其中凋亡細胞被穩定轉染了表現圖19的PGL2對照的表達特性的質粒。
93．權利要求92的方法，其中凋亡細胞被穩定轉染了包括圖19的脫氧核糖核苷酸序列的質粒。
94．權利要求79-89中任意一項的方法，其中熒光蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)。
95．權利要求94的方法，其中凋亡細胞被穩定轉染了表現表達特性的質粒或如圖10或29的質粒。
96．權利要求95的方法，其中所述的凋亡細胞被穩定轉染了包括圖9或28的脫氧核糖核苷酸序列的質粒。
97．權利要求79-89中任意一項的方法，其中凋亡細胞被穩定轉染了表達β-半乳糖苷酶的質粒。
98．權利要求97的方法，其中所述質粒具有圖11所示的質粒的表達特性。
99．權利要求98的方法，其中所述質粒包括圖11所示的脫氧核糖核苷酸序列。
100．權利要求79-89中任意一項的方法，其中凋亡顆粒包括穩定轉染了β-半乳糖苷酶的細胞系Ba/F3。
101．權利要求100的方法，其中吞噬的水平通過加入一種能夠被β-半乳糖苷酶轉換為熒光化合物的底物而被檢測。
102．權利要求79-101中任意一項的方法，其中如果在暴露給待測化合物時，未觀察到吞噬作用或吞噬的量減少，應檢測哺乳動物轉染細胞的活力。
103．權利要求79-102中任意一項的方法，其中吞噬細胞在多孔板中培養，向其中每個孔加入凋亡細胞和待測化合物。
104．前述任一項權利要求的方法，其中來自報告基因的信號通過自動平板讀數儀檢測。
105．權利要求101的方法，其中來自報告基因的信號通過能檢測熒光信號的自動平板讀數儀檢測。
106．一種化合物，經過權利要求79-105中任意一項的方法鑒定為凋亡細胞吞噬的抑制劑或增強劑。
107．權利要求22-35,39-56,58-60中任意一項的方法，其中吞噬通過非顯微鏡方式測量。
108．權利要求107的方法，其中非顯微鏡方式為多孔平板讀數儀。
109．權利要求108的方法，其中多孔平板讀數儀測量發光，熒光或進行分光光度檢測。
110．權利要求79-105中任意一項的方法，具有權利要求108和109的特點。
111．一種方法，用于診斷與個體中吞噬細胞的人CED-6過表達或低表達相關的疾病，包括(a)從所述個體中獲得吞噬細胞樣品，(b)從吞噬細胞分離RNA，(c)從RNA制備DNA(d)在所述cDNA上進行第一次PCR反應，(e)在所述第一次PCR反應的反應產物上進行第二次(嵌套式)PCR，(f)通過分析第1次和第2次PCR的反應產物，定量和定性測量CED-6RNA的存在，(g)與來自對照個體的吞噬細胞形成的反應產物比較在第1次和第2次PCR形成的反應產物的量和類型。
112．權利要求111的方法，其中PCR使用從人CED-6的序列衍生的引物，或從cDNA產生時使用的載體衍生的引物。
113．權利要求111或112的方法，其中第1次PCR使用的引物具有核苷酸序列1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gatctactaggtactggag
114．權利要求111,112或113的方法，其中第2次PCR使用的引物具有核苷酸序列1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag。
全文摘要
本發明提供分析方法,該方法用于檢測一種化合物是否是促進吞噬凋亡細胞的信號傳導通路的的促進物或抑制劑。此方法包括將吞噬細胞暴露給視需要而定,轉染有報告基因的凋亡細胞,在待測化合物存在或缺失時測量吞噬的程度。使用表達載體轉染DNA序列到哺乳動物細胞中,該DNA序列表達時影響凋亡細胞被吞噬的速率,DNA序列例如線蟲C.elegansced－6基因。
文檔編號C07K16/18GK1305525SQ99807222
公開日2001年7月25日 申請日期1999年6月10日 優先權日1998年6月11日
發明者E·斯米茨, W·M·R·范克里金格, T·A·O·E·波格爾特 申請人:德福根有限公司