專利名稱：：分析方法及其所用的裝置的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種改進的分析方法及其所用的裝置，尤其涉及滴定方法和裝置。許多化合物都具有隨其物理或化學環境而變化的物理化學性質，可通過改變物理化學環境并觀測環境對待測化合物的影響來研究這些性質。這些性質的實例是電離狀態、溶解度、在例如有機相和水相之間的分配、或向膠束或脂質體中的分配、配位鏈或金屬結合作用的強度和疏水性，它們可隨一些環境參數例如pH、離子強度或系統中其它物質的濃度而變化。研究化學分子或生物分子性質的分析化學家長期以來就把滴定看成是其行業中的主要工具，因為它能通過滴加一種或多種試劑來改變系統的一個參數，例如溶液的pH，而系統的其它參數基本上保持不變，它能單獨地有效研究變化的影響。可通過滴定測定的性質的實例是化合物可電離基團的pKa(或離解常數)，pKa可定義為該基團的50％發生電離的pH。在準確地知道pKa時，就可直接計算在任一pH下指定可電離基團的電離程度。如果一個指定分子包含一個以上的可電離基團，該分子就具有多個pKa。由于一個分子的電離狀態可以改其它的性質，例如疏水性和水溶性，所以了解潛在藥物分子的pKa是非常重要的。到目前為止，由于傳統的滴定技術方面的困難，一直未能充分地利用pKa資料。下文將對屬于測試化合物的物理化學性質的范圍內討論一般的原理和方法。為了簡化起見，在討論pKa時假定分子只有一個可電離基團，因此只有一個pKa，然而這些討論將同樣適用于具有多個pKa的分子。還將具體地描述多個pKa的存在具有非常重要的場合。傳統的滴定方法具有許多缺點。它們很慢，每個每天能測定的樣品數非常少。費力大，在取讀數之前，滴加每滴試劑后都要停一會，等混合物平衡。常規方法的準確度受加入液滴大小的限制，而液滴的大小又隨操作人員的經驗而異，而且，由于加入的每一滴試劑都會稀釋待測樣品，所以待測化合物的濃度也發生了改變。此外，標準的滴定方法需要待測化合物的量較大，例如，如果滴定分析是要測定一種化合物的pKa，并用紫外分光光度計進行監測，則可能需要1mg待測化合物，如果同樣的分析用pH計監測，則可能需要3mg以上的化合物。分光光度滴定一般不是自動的，而電位滴定是自動的，即使最近在自動化方面的嘗試已提供一些緩慢的(每天1-5種化合物)、連續的方法，可并未排除需要一個有經驗的試驗室技術員在場。Yarnitzky(亞尼茨基)敘述了一種自動滴定系統(儀器科學和技術，Vol.23(2)，91-102(1995))，該系統采用二個蠕動泵、一個混合蛇管和二個三通閥門。該系統要求泵驅動器準確匹配，采用電導或電位檢測，并需要補償由泵引起的管路損耗、混合蛇管的延遲和檢測器的響應時間。Ando(安托)和Heimbach(海姆巴赫)(藥物和生物醫學分析雜志，16(1997)，31-37)敘述了采用高性能液相色譜(HPLC)儀器作為混合器和泵，將一系列分別緩沖到不同pH的樣品送入分光光度檢測器中。在制藥工業中，和在化學的其它分支中一樣，目前向組合化學和重組遺傳工程的發展趨勢，正在越來越快地產生越來越多的新化合物。在制藥工業上，需要迅速評價這些新化合物作為潛在藥物的適宜性。可能每天需要測定幾百個pKa。可用于檢測的每種化合物的量可能是非常少的。因此需要有比較靈敏的方法，為了提高分析數量，優選易自動化的方法，和優選能由未經專門訓練的試驗室化學家來操作的方法。因此，本發明提供一種連續的滴定方法，當混合物的組成連續變化時，采用這種方法可以監測待測混合物中至少一種化合物的至少一種參數。連續變化的特性是改變混合物中一種或多種物質或成分的濃度，例如優選這些物質或成分的濃度連續線性的增高或降低。在本方法中，把至少二種流體的液流連續地混合成一個流過分光光度檢測區的待測混合物液流。通過改變組成待測混合物成分液流的相對比例，使進入檢測區的混合物中至少二種成分液流的體積比可隨時間連續地變化。優選把三種或多種成分流體的液流連續地混合成待測混合物液流，通過改變它們組成待測混合物的相對比例，使這些成分液流中二種液流的體積比隨時間連續地變化。在傳統的電位和電導滴定中，檢測器的響應時間經常是速度限制步驟。采用分光光度檢測能大大地加速滴定過程，本發明優選分光光度檢測。本方法還有另一個優點，由于不是逐滴地加入溶液，而是以變化的比例連續地混合溶液，所以準確度不再受加入液滴大小的限制。此外，由于混合是連續的，沒有加入每滴后等待混合物平衡的時間，所以可明顯地加快分析過程。因而限制步驟可能是通過所用的泵、混合器和導管可能達到的流量。本方法的另一個優點是能較好地利用在檢測器上的數據應答速率，在現代儀器，例如在具有固定幾何形狀鏡片的二極管陣列分光光度檢測器中，數據應答速率非常高，例如每秒可取100個讀數，然而在實用的實施方案中，每秒可取10-30個讀數，例如每秒取20個讀數。數據應答速度高，就能選擇“數據修勻”或減噪。例如如果每秒取20個讀數，可將這些讀數按10個一組平均，提供的有效采樣速率為每秒2個。這種平均可提供比常規分光光度檢測更靈敏的檢測方法。因此，在某些實施方案中，本發明提供一種連續滴定的方法，其中使包含待測化合物的流動的流體流與至少一種附加的流動的流體流混合，形成待測混合物液流并使待測混合物液流優選以恒定的流量流過分光光度檢測區，在該區讀取與待測化合物的至少一種物理或化學參數有關的讀數。優選待測混合物液流是由三種流體成分混合組成的第一種包含待測化合物，優選其體積占待測混合物液流總體積的百分數保持不變。因而混合物液流中該測化合物的濃度也保持不變。優選第二種和第三種成分的體積％可互相成反比例變化，另一種成分的體積％升高時，另一種成分的體積％就下降，以保持混合物的總體積恒定。可變的成分可包括緩沖劑溶液、溶劑、檢測試劑、有機相和水相、或其它流體成分，這些成分可彼此相對改變，以改變待測化合物的物理或化學環境。在待測混合物中還可包含另一些流體成分，其體積是恒定的或可變的。例如可采用鹽溶液保持所選擇的離子強度，可加入指示劑或可調節水(或其它溶劑)量來補償其它流體成分體積發生的變化。在特別優選的實施方案中，可變的成分包括二種線性化的緩沖劑-即其相對比例可改變的二種緩沖劑，以產生線性的pH梯度。要求這些緩沖劑由同一種化合物的酸式和堿式鹽一類的成分組成，使混合物的總化學組成在滴定過程中保持不變，也不引入其它種類的離子。這種化學環境的一致性為預測引入滴定系統的化合物行為提供一種手段，因為如果化學環境發生明顯地變化，某些化合物的行為能發生改變，在罕見的情況下，甚至會導致化合物以固態鹽的形式從溶液中沉淀。因此，在一個實施方案中，其中待測化合物的pKa是要被測定，待測混合物液流由三種成分組成體積恒定的樣品溶液和體積彼此按反比變化的二種線性化的緩沖劑溶液。在改變緩沖劑的比例，以產生線性pH梯度，測定吸光度(在一種或多種波長下，至少其中之一是在此波長下電離形式和未電離形式的化合物吸光度不同)。待測化合物的pKa是吸光度變化中點的pH。如果待測化合物具有一個以上的可電離基團，就可觀測到一處以上的吸光度變化。因而第二處變化的中點就相應于第二個可電離基團的pKa。在第二方面，本發明提供一種分析裝置，其包括至少二個與公共通道流體相通的入口和一個具有與公共通道流體相通的入口和出口的檢測區，該裝置還包括一個分光光度檢測器，用于監測流過檢測區的流體并產生關于該流體成分的至少一種化學或物理特性的數據。可將控制裝置與二個入口聯接，控制通過每個入口加入公共通道的流體的相對量。檢測器可以是任一種適宜的分光光度(即檢測輻射的)分析檢測器，例如紫外或可見光范圍的分光光度計、熒光計、旋光計、比色計或光散射、光旋轉或圓形二色性檢測器。控制通過每個入口加入到公共通道的流體的相對量的控制裝置，可以是例如通常與HPLC儀器一起使用的那種泵控制器。采用另一種方案，一個或多個入口與注射器連接，可利用注射器通過入口將流體加入公共通道，這些注射器的柱塞能在例如計算機的控制下機械移動。有經驗的人員能設想出一些其它裝置，可利用這些裝置來控制流體向公共通道的加入，以能控制構成待測混合物的各流體的比例和待測混合物沿公共通道流過檢測區的流量。采用基于在HPLC儀器中采用的那些注射器泵或泵混合器與小口徑導管和微量分析檢測器例如具有固定幾何形狀鏡片的分光光度計串聯，意味著可以采用體積非常小的待測混合物。因此，所需待測化合物的量比傳統的滴定法所需的量少。特別是自動注射器，具有死體積小(避免了隔離泵的死體積)和自動化容易編程的優點。在一個優選的實施方案中，HPLC混合器泵與待測混合物每一種流體成分的貯存容器連接。混合器泵以恒定流量吸取包含待測化合物的流體，并將其與在逐漸增高的流量下泵送的第一種緩沖劑溶液和在逐漸降低的流量下泵送的第二種緩沖劑溶液混合，使所得混合物的總體積和總流量保持不變，但流動的混合物的每種成分的相對量隨時間而改變。在混合物中二種線性化緩沖劑溶液比例的變化，優選引起作為整體的混合物pH的變化，并按所需控制所述比例的變化，使pH隨時間發生線性變化。可以采用這樣的系統測定例如待測化合物的pKa。在另一個實施方案中，自動采樣器的轉盤包含許多溶解的待測化合物的貯存容器和許多自動注射器，每個注射器都包含待測混合物的一種另外流體成分例如第一和第二種緩沖劑溶液的貯存容器。然后將第一種緩沖劑溶液在逐漸增加的流量下從第一個自動注射器泵送入混合室，并在逐漸降低的流量下將第二種緩沖劑溶液泵送入混合室，使所得混合物的總體積和總流量保持不變，但流動的混合緩沖劑液流的每一種成分的相對量都隨時間而變化。混合物中二種線性化緩沖劑溶液比例的變化，優選引起整體混合物pH的變化，而且按所需控制比例的變化，使pH隨時間發生線性變化。自動采樣器吸取包含一種待測化合物的流體樣品，并以恒定的流量將其注入混合的緩沖劑液流中，形成流過檢測器的待測混合物液流。可以采用這樣的系統測定例如待測化合物的pKa。為了制備待測混合物而混合的各種流體的性質和數目，取決于所要進行的分析。例如，如果要測定分子的分配系數，包含待測化合物的流體加入裝置的流量可保持恒定，分子將在其中分配的二相的流量可以改變，優選以反比和線性地改變。可采用的相分配流體的實例包括水包油型乳濁液或水溶劑包其它有機溶劑在水相溶劑中的乳濁液(例如水中的辛醇)、表面活性劑膠束(例如十二烷基硫酸鈉(SDS)膠束)和磷脂，例如DMPC脂質體，但有經驗的人員能根據本人的知識選擇適合待測化合物的適宜的混合物。采用另一種方案，可按照上面討論的方法制備pH呈線性梯度的待測混合物液流，并使其與流動的有機相(例如辛醇)液流接觸，例如采用由CRL(與EMIGroupplc聯合的中央研究實驗所)和BNFL(英國核燃料有限公司)開發的微量化學處理裝置。這種裝置專門用于使水相和有機相在流動中互相接觸，然后完全分離。詳細情況可在“Eureka(龍雷卡)，傳輸技術”1997年10月，第42頁上找到。可根據與有機相接觸和未與有機相接觸的待測化合物的pKa差值來計算分配系數。如果要測定的參數是待測化合物與第二種分子或其它試劑的結合系數，則其比例要改變的流體可包含一種或二種其本身結合的試劑，和/或用于控制混合物離子強度和/或pH的鹽溶液或緩沖劑。例如可用上面討論的方法，以待測混合物的恒定的比例加入待測的溶質。不是通過例如混合二種緩沖劑使pH隨時間變化，而是在溶質存在下用水或相關的溶劑滴定所研究的配位體，因此給出連續的，優選線性的配位體濃度梯度。這種系統的一個實例是鎳(II)乙二胺。采用本發明的方法和裝置能夠研究的可能的相互作用，包括在酶和它們的基質或輔因子、螯合劑和金屬離子、受體和它們的興奮劑或拮抗劑、抗體和它們的抗原之間的相互作用，或以任何絡合或特定結合對形式的相互作用強度。可采用傳統的方法分析所產生的數據。這種方法可能比其它方法有利，因為不需要校正稀釋倍數。如果正在研究化合物在不同溶劑中的溶解度，則可調節二種或多種不同溶劑的濃度并觀測其對待測化合物的影響。有經驗的人員會很容易地發現一些其它的實例。在某些實施方案中，可用能以高精度和準確度輸送非常小體積的其它泵送系統代替上面討論的自動注射器、或貯存容器和混合器泵。其它適宜的泵送系統包括蠕動泵(盡管，這些泵可造成被泵送混合物的脈動)和在微型導管中的數字開-關閥泵。當然，該裝置也可包括二種或多種不同類的泵。在不采用混合器泵的場合，需要采用某些足以混合待測混合物液流成分的其它裝置，例如混合蛇管、T形管混合器或螺旋混合器。如上面所討論的，在分子具有單一的可電離基團，且電離和未電離的形式又具有不同的紫外吸收光譜的場合，在電離和未電離形式的混合物從電離占優勢發展到未電離占優勢時，將檢測出吸收的變化(反之亦然)。見圖11的概括性示意圖，對于具體的實施例，見圖14和15。對于這種單個的可電離基團，相應于吸光度變化中點的pH為該化合物的pKa(50％的分子發生電離的pH)。可采用曲線擬合法或對pH取吸光度讀數一階導數的方法確定該曲線的中點(拐點)，一階導數的峰值相應于拐點。應用一階導數曲線能夠確定位置靠近pH梯度二端的pKa，因為pH梯度只需經過很短的距離就能通過一階導數曲線達到頂峰又開始下降的拐點。與此相反，只有能在跡線上看到最低和最高吸光度時，才能很容易地確定曲線擬合法的吸光度跡線上的拐點，正如從圖11上所看到的，這要求pH梯度的跨度較長。對于一步電離的過程，在拐點或在一階導數曲線峰值的pH與pKa是等價的，Irving(歐文)等人在“分析家”80，83-94(1955)中提出采用一階導數的方法確定包括二步電離過程的pKa值。然而，這種方法向二個以上的電離步驟推廣，在代數學上是很復雜的。另一種數據分析方法是目標因式分析(TFA)。可用TFA根據在滴定過程中在不同時間點(不同pH)記錄的多波長吸收光譜推導出pKa值。采用主要成分分析(PCA-參見D.Perez-Bendito(佩雷斯-本迪托)，“分析家”，Vol.115，689-698(1990)和E.R.Malinowski(馬利諾斯基)，“化學中的因式分析”，第二版，1991，Wiley出版社，紐約)將吸光度數據矩陣Ns(吸收光譜)×Nw(波長)分解成主要成分的線性組合，并在假定的反應模型(如上述的馬利諾斯基)基礎上，通過采用TFA進行數學解轉換，將這些成分視為一個。Allen(艾倫)R.I.等人在“藥物和生物醫學分析雜志”，1998，vol.17，699-712中結出在測定藥物化合物pKa方面應用TFA的實例，在Tam(塔姆)，K.I.和(Tacacs-Novak(塔卡克斯-諾瓦克)，K.提交的“藥物研究”中可以找到這種方法與上面討論的一階導數分析的比較。采用下述適宜緩沖劑的連續滴定方法能在很寬的pH范圍內產生迅速的pH線性梯度。這反過來又能加速pKa值的測定。除了分光光度檢測器外，一般還會為分析裝置配上pH計，以便能對時間或對pH測定吸光度。然而，如果pH梯度的速度很快，pH電極不能足夠快地響應，產生的讀數會有誤差。在這種情況下，可采用已知pKa的化合物來校準梯度。標準化合物的已知pKa，對采用連續滴定方法對這種化合物得到的吸光度曲線的一階導數峰最大值時間的線性回歸，產生一條校準曲線，利用這條校準曲線可不經pH測定就能確定未知化合物的pKa。測定待測化合物通過相同梯度的“峰最大值時間”，并從校準曲線上讀出pKa。由于方便，這個“峰最大值時間”可從裝置循環的開始或從梯度的開始測定，重要的準則是，涉及相同的梯度的所有標準化合物和待測化合物采用一致的起始時間。雖然采用梯度校準來代替直接的pH測定，但可將pH電極作為一種診斷工具安裝好，例如用來校核儀器的操作，例如檢查pH梯度是否保持線性。本發明對分析溶解性差的化合物是特別有利的，因為只需要非常低的溶液濃度和非常小的溶液體積，即100-10μg/ml和100μl，而不是傳統方法的100ml。此外，采用高靈敏度檢測器與高的數據應答速率相結合能夠引入減噪技術和裝置，所以可以采用濃度低得多的待測溶液。而且，不必知道待測化合物的濃度，因為輸出可用曲線來表示，例如吸光度的變化不是用絕對值標繪出來，而是用表示待測化合物電離狀態、相或其它變化的圖形形狀變化表示出來。只要濃度能使發色團可被分光光度計檢測出來就足夠了。在近代，分析化學家一直在處理組合化學庫中產生的化合物，這已導致日漸減少的待測化合物的數目日益增多的問題。如上所述，本發明提供一些有助于解決這些問題的方法和裝置。當一些化合物作為庫中的一部分被合成后，還可能有涉及樣品純度的問題，采用本文所述的連續滴定方法所能達到的自動化水平還可提供解決那些問題的手段。例如可能有將HPLC色譜分離與連續滴定“連鎖”的場合，使采用HPLC儀器純化的樣品收集在自動采樣器的管形瓶內，以便直接注入本文所述連續滴定裝置的待測混合物液流中。不需操作人員干預。此外，如果HPLC儀器和連續滴定裝置的循環時間是一致的，就存在將被純化的庫化合物的峰值部分直接轉入連續滴定裝置的待測混合物液流中的范圍。下面參照附圖通過最適宜的實施例說明本發明具體的實施方案，其中圖1是根據本發明第一個實施方案的裝置示意圖；圖2是根據本發明第二個實施方案的裝置示意圖；圖3是圖2裝置的管路連接示意圖；圖4是圖2裝置的電接線示意圖；圖5是控制圖2裝置的電觸發動作示意圖；圖6是說明圖2裝置接線板接線的詳圖；圖7是根據本發明第三個實施方案的裝置示意圖；圖8是根據本發明第四個實施方案的裝置示意圖；圖9是圖8的裝置檢測器接線示意圖；圖10是描述圖8的裝置自動采樣器控制程序的流程圖；圖11是具有單個可電離基團物質的pKa、吸光度和吸光度一階導數之間關系的示意圖，其中電離和非電離的形式有不同的吸光度分布。圖12示出對已知pKa的化合物根據按照本發明獲得的滴定數據推導的標準(校準)曲線；圖13是線性梯度的pH-時間曲線；圖14是涉及圖13梯度的4-氰酚的吸光度曲線；圖15是標繪在圖14中的吸光度讀數的一階導數曲線；圖16是終點滴定的吸光度曲線(實施例4)；圖17是終點滴定的校準曲線(實施例4)；圖18是對產生圖12標準(校準)曲線的線性梯度的pH對酸％的曲線；圖19是終點滴定的校準曲線(實施例5)；圖20是絡合滴定的校準曲線(實施例6)；圖21-24示出曲線擬合法作為數據處理方法的應用；圖25是對10種化合物采用圖8的裝置測定的pKa對文獻pKa值的曲線；圖26是對另外10種化合物采用圖8的裝置測定的pKa對文獻pKa值的曲線；和圖27是對35種化合物采用圖8的裝置測定的pKa對文獻pKa值的曲線。實施例實施例1A.圖1和2的裝置在第一個實施方案中，分析裝置是由試驗室中現有的設備組裝的，它由以下單元組成GilsonAspecXL自動采樣器；HewlettPackard1050四道HPLC泵；Kontron440二極管陣列檢測器(DAD)分光光度檢測器；66MHz486PC計算機，帶有草莓樹數據采集插件(StrawberryTreeDataacquisitioncard)；Dynares8超(+71-TC)接線板；Dasylab軟件，用于數據收集；PEEK導管(外徑(OD)1/16″)。在圖1和2中可以看到該裝置二種配置的示意圖，下面采用在圖2的配置中各單元之間的導管連接(示于圖4)和電接線(示于圖5)對其做進一步地說明。緩沖系統的改進最初開發的緩沖系統采用四種溶液混合形成線性的梯度(圖1)。用酸(如圖1所示)或堿滴定體積％恒定的樣品，鹽溶液的體積％隨酸或堿的增加而下降，保持離子強度在可接受的限度內。該系統是由體積％不變的緩沖劑溶液緩沖的。緩沖系統的改進已將其減少到三種成分一種樣品溶液，其量不隨梯度經過的時間而改變，二種線性化的緩沖劑溶液，一種是酸性的，一種是堿性的，它們互相以反比隨時間呈線性變化。見圖2。圖2裝置的操作在試求梯度的過程中，以恒定的流量將包含待測化合物的樣品從自動采樣器吸入HP1050泵的通道A中。同時也將數量變化的其它成分吸收泵中。通用的緩沖劑成分B(堿性成分，詳見下文)從貯存容器吸入到通道B。類似地將通用的緩沖劑化合物A(酸性成分)吸入通道C。在梯度開始時緩沖劑的一種成分從零或占待測混合物低的體積％提高到結束時的例如占混合物80％或以上。另一種緩沖劑從例如占混合物的80％或以上下降到零或低的最終濃度。對pH逐漸升高的梯度，緩沖劑B的比例隨梯度時間而增高，而緩沖劑A的比例則下降。混合物的其余部分是待測化合物溶液(通道A)，必要時，還可有其它所需成分(例如水、表面活性劑膠束和反應劑)，它們可由HPLC泵的通道D提供。被混合的成分從HPLC泵的出口送入分光光度計(Kontron440DAD)，然后廢棄，還可通過pH計，該pH計可用來監測系統的正確操作，例如校核所形成的pH梯度的線性。適宜的導管是外徑1/16″的PEEK或不銹鋼導管。在要測試許多樣品時，可將裝置調到重復循環運行，在循環過程中，有四個不同的階段1)采用HPLC泵以恒定流量按固定的比例泵送緩沖劑和任何其它成分，為梯度提供穩定的起點。2)改變緩沖劑成分的比例，以試求梯度。3)在4)之前可在短時間內維持梯度的最終條件。4)系統再循環(其中可包括在循環結束時用水或其它適宜溶劑沖洗)，準備吸取下一個樣品。圖2裝置的電接線正如從圖4給出的電接線簡圖所看到的，將來自分光光度計和pH計的模擬數據提供給接線板，并從那里輸入專用微機，以便由Dasylab軟件收集和分析。能收集和處理模擬據數的任一其它軟件都是適宜的。這個實施方案被限制于分光光度計的四個模擬輸出，將分光光度計的四個數據通道與接線板上的屏蔽輸入1-4連接，pH計的模擬信號與端子5連接。電纜的屏蔽能降低高頻儀表噪聲的干擾，在圖6中更詳細地示出接線板內的接線。正如從圖4所看到的，自動采樣器與泵、分光光度計和接線板連接。這些觸點都是數字信號，它們規定了試驗循環的開始和結束，這些觸點的閉合動作是由自動采樣器驅動的。觸點閉合是送往泵和分光光度計的信號。觸點打開是送往接線板的信號。在圖5中更詳細地表明了這一點。B.另一些實施方案圖7示出一個與圖2的相似的裝置配置，但緩沖劑成分是從自動注射器加入混合器的，而不是由混合器泵從貯存容器吸取的。如果需要，如作分配試驗的任何附加成分例如膠束懸浮液，也可象檢測的樣品一樣由注射器加入，然而如果要檢測多個樣品，則采用自動采樣器代替泵或注射器提供了一種方便的自動化裝置。圖8和9示出另一種裝置的實施方案，該方案采用自動注射器輸送形成梯度的成分。這種裝置采用以下單元Sirius梯度系統(Sirius分析儀器有限公司)有混合作用的T形管(ThamesRestek)袖珍超微流通式吸收池(Hellma-參見178.713)氟化乙丙烯(FEP)導管，外徑1.6mm，內徑0.8mmMSP9000/XL3000/注射口(Cavro)脈沖燈電源(Cathodeon-C720)氘燈，210nm-700nm(Cathodton-J27)遙控吸收池架(Hellma-664.000)紫外/可見光光纖電纜，帶鏡頭(Hellma-041.002紫外/可見光)MMS分光光度計，256二極管陣列(Zeiss-224000-9001.000)MMS12-位適配器電子設備(Zeiss-792200-9009.000)計算機主板12-位CIO-DAS16Jr(Talisman)正如在圖8所看到的，采用有混合作用的T形管混合來自注射器分配器的二種流動液流，T形管的總體積為4μl。流動液流接著通過促進混合的蛇管，然后送到位于自動采樣器的注入口。在此自動采樣器將樣品注入流動液流中。液流從注入處流到分光光度計的遙控流通式吸收池，然后流出廢棄。在圖9中可以看到圖8的裝置所采用的電接線和光纖接線與檢測器的連接。氘燈是由晶體管-晶體管邏輯(TTL)信號控制的，該信號又控制電源電路。在試驗開始之前應將氘燈加熱。一般加熱約半小時。由計算機控制TTL信號，使燈自動地打開或關閉。傳輸光纖以燈為動力運行，將光從燈傳送到吸收池架。采用吸收池架將流通式吸收池插入光路中，將接收光纖的位置可在吸收池架的范圍以內調節，然后用鎖定螺釘固定。再將這些光纖與MMS分光光度計連接。MMS12-位適配器電子設備在CIO-DAS16Jr計算機主板信號的控制下執行分光光度計的數據獲取。控制按照LabviewVirtual儀器編制主控程序，采用主控程序控制主要外圍設備分光光度計的燈(即開/關)梯度線模塊(發送觸發信號并起協調作用)自動采樣器(發送校正控制信息串)分光光度計(提供時鐘脈沖和接收觸發信號)開始，主控程序協調所有的外圍設備，并使它們進入準備狀態。對于用戶需要從試驗開始就儲存所有數據的場合，用戶可以選擇文件的名稱，在完成這一步驟之后，儀器就進入儲存狀態，這時用戶可在自己的控制下單個地進行全部試驗，或者他們可以設定樣品的編程號碼，連續運行到完成為止。Sirius梯度系統包括80C552微處理機基本控制板，二個Sirius注射器分配器、數據圖象液晶顯示器(LCD)和鍵盤。液晶顯示器和鍵盤提供簡單的用戶界面，使用戶能為流動液流的梯度控制變量編制程序。也可通過RS-232界面控制速變線系統。梯度模塊有嵌入式軟件程序，使用戶能為產生梯度確定試驗參數。為梯度控制確定的參數是總流量，以ml/min表示。梯度復位時間，以s表示(例如如果梯度是從低到高，在注入下一個樣品之前，需使梯度復原到低)。總梯度時間，以s表示。梯度后時間，以s表示(這是將梯度結束延長到通過流通式吸收池)。這些參數也可通過一系列的端口由控制計算機預置。可同時控制二個注射器。在梯度模塊進入待用狀態后，可采用由主控計算機自動提供的外部觸發信號起動梯度控制規程。在檢測到這個信號時，梯度模塊就開始其操作運行。在運行結束時，模塊自動地重新裝入，然后等待下一個觸發信號，以開始下一個試驗。在采樣操作開始時，自動采樣器將樣品裝入蛇管中。圖10示出自動采樣器的控制流程圖。然后懸臂移到注入點。向梯度模塊發送開始梯度流動的觸發信號，也向氘燈發送觸發信號。在預定的時間，數據收集開始，間隔為0.5秒。將樣品注入梯度液流。該儀器實際上捕獲取分光光度計的六個掃描，將后五個掃描平均，并采用平均值作為存儲掃描。這樣做是通過調入CIN(代碼界面節點)進行的，CIN與CIO-DAS16/Jr板配合，收集256-吸收光譜，并將這一數據陣列返回到可視指示器(VI)，可視指示器以指定文件的形式將其存在磁盤上。數據獲取和數據處理通過補充用來控制和調節對二極管陣列信號執行數據采集的硬件，簡化了數據獲取的程序。該硬件與信號波形加工器電子設備一起包括在Zeiss電子設備中。要求數據獲取程序發送指示要求掃描的觸發信號。Zeiss電子設備控制二極管陣列和數據獲取插板。Zeiss電子設備還將信號波形從0伏調高到+2.5伏，使得能充分利用模-數轉換器(ADC)的解。為了提高信號對噪聲的比例，進行暗掃描(關燈)，并從所有的其它掃描(開燈)中減去這一結果。每次掃描都對信號采樣六個，第一個掃描廢棄，然后將剩下的五個掃描平均，再將平均的掃描存到磁盤上，這花費約300毫秒。掃描按500ms間隔記錄，所得的數據文件包含每個樣品的256波長數據。將包含每個波長480個數據點的數據文件轉換成適合用一階導數或TFA分析進行數據處理的格式。二極管陣列數據是采用“能量計數”表示的，需采用下式將其轉換成吸光度數據A＝log10((1(參比)-1(暗))/(1(樣品)-(暗)))式中1(樣品)是樣品對特定通道或波長的強度或能量計數；1(暗)是暗電流；和1(參比)是初始參比計數(緩沖劑B+樣品)。轉換程序使用戶能夠確定需要抽取哪些波長用于數據處理規則系統，并使所得的數據文件格式化。然而，為了使用TFA，必須首先執行一階導數程序以計算pH梯度。pH梯度是采用具有明確定義的pKa并因而將其稱作“標準”的化合物的數據計算時。隨后這將為TFA規則系統提供所需的pH尺度。在任何樣品通過該系統之前，必須先進行空白樣品(只是水或適宜的溶劑)和校準標準試驗，空白樣品提供空白曲線，它所提供的吸收信息是由梯度和水產生的。必須從所有標準/樣品的試驗中將其減去。因而由此提供了純粹由標準/樣品產生的吸收曲線。為了得到這些數據的吸收峰，數據處理規則系統采用線性擬合規則系統以修勻數據，然后對線性擬合的斜率求導數。用戶能夠確定進行擬合的點數(點數必須是奇數)。將數據處理規則系統應用于數據文件中的每一個點。在完成這步之后，需求出峰值。這是將數據分組(由用戶規定組的大小)進行的，在每一組中尋找符合最小或最大峰標準的峰。實施例2A.pKa的測定-采用圖2的裝置圖2示出形成緩沖線性pH梯度所用裝置的示意圖。下面測定pKa的試驗就是采用這個裝置進行的。線性pH梯度是由混合樣品溶液產生的，樣品溶液的量不隨遞變經過的時間而改變，二種緩沖劑溶液，一種是酸性的，一種是堿性的，它們互相以反比隨時間發生線性變化。這二種緩沖劑具有一種共同的成分，向其中加入酸性成分就形成緩沖劑A，加入堿性成分就形成緩沖劑B。這些緩沖劑的配制如下溶液C共同成分(11)向1升水中加入硼酸(Fluka15660)24.732g(Mw61.83)＝0.4MTRIS(Fluka93350)48.456g(Mw121.4)＝0.4M(三(羥甲基)氨基甲烷)丁胺(Fluka19480)29.256g(39.696cm3)＝0.4M(Mw73.14，密度0.737)緩沖劑A-1升向500cm3溶液C中加入KH2PO4(BDHAnalar10203)27.218g(Mw136.09)檸檬酸一水合物42.028g(Mw210.14)HCl350cm3(1M溶液)用H2O補充到總體積1000cm3，產生KH2PO40.2M檸檬酸一水合物0.2MHCl0.35MpH＝～2.8緩沖劑B-1升向500cm3溶液C中加入K2HPO4(Fluka60356)34.836g(Mw174.18)檸檬酸三鉀(一水合物)64.884g(Mw324.42)(Fluka60153)KOH(Aldrich31,936-8)400cm3(0.5M)用H2O補充到總體積1000cm3，產生K2HPO40.2M檸檬酸三鉀0.2MKOH0.2MpH～11.58在用于HPLC梯度之前，需將緩沖劑成分A(酸性的)和B(堿性的)以1∶10稀釋。稀釋后緩沖劑的pH值如下酸性的(緩沖劑A)＝3.01堿性的(緩沖劑B)＝11.19逐步檢測這個緩沖劑系統線性的方法是，采用HP1050HPLC泵以5cm3min-1的流量混合緩沖劑，采用流通式PharmaciapH電極監測pH。緩沖劑A和緩沖劑B的相對量保持不變，直至pH讀數穩定為止，然后變到其下一個值，再保持相對量不變，直到讀數達到穩定為止，然后再變到下一個值。重復這一步驟，直至梯度完成為止。測定的結果如下，并用曲線示于圖18。<t>圖18表明，從pH3到pH11，pH梯度基本上是線性的。采用圖2的裝置對已知pKa的化合物進行連續梯度(而不是躍變)試驗，其中緩沖劑A的量在4分鐘內從占待測混合物的80％下降到0％，而緩沖劑B的量從0％增加到80％。樣品溶液的量保持恒定，為20％。通過通道B加入緩沖劑B和通過通道C加入緩沖劑A也是采用HP1050泵。待測混合物液流從混合器到檢測器的流量為1cm3min-1。記錄在240nm、265nm、290nm和315nm處的吸光度變化，并確定一階導數曲線峰最大值。由峰最大值的時間和標準的已知pKa值(由常規滴定測定的)產生校準曲線(圖12)，還將已知pKa的化合物作為待測溶質進行了測定。測定的校準結果如下峰最大值的時間是從儀器循環開始(自動采樣器第一次進入新樣品容器時)算起。標準鄰苯二酸氫二鉀的pKa值堿性較強。*是采用SiriusPCA101儀器用0.15KCl進行電位滴定測定的。結果對檢測溶質測定的結果和偏差如下*是采用SiriusPCA101儀器用0.15KCl進行電位滴定測定的。從標準校準曲線上所取的導出的pKa值非常接近于預期值。圖13、14和15示出4-氰酚對上述梯度在290nm的校準曲線(圖13)、吸光度曲線(圖14)和一階導數曲線(圖15)。可從這個pH梯度的校準曲線上讀出相應于峰最大值時間(361s)的pKa值，導出的pKa為7.64。預期值為7.7(采用SiriusPCA101儀器根據傳統的逐步滴定結果推導的)。將校準曲線加入數據處理程序可進一步改進本方法，例如使儲存由檢測器產生的吸光度讀數的計算機按程序運行，求出這些讀數的一階導數，確定峰值讀數的時間，例如從根據校準曲線推導的表中查出吸光度讀數，就能產生給出樣品pKa的輸出讀數。那時pKa讀數是唯一的輸出-就操作人員而言，不需要進行任何運算。B.pKa的測定-采用圖8的裝置梯度進一步地最佳化緩沖劑的配方，以改進梯度的線性，而且在保持生理離子強度的同時又不顯著地降低緩沖劑的緩沖能力。還選擇對紫外/可見光吸收性能最小的成分。下面示出這些配方，并將其與上述實施例2A的配方進行比較成分A(酸性緩沖劑)成分B(堿性緩沖劑)梯度組合物方法開始，緩沖劑B是在1ml/min的流量下注入的，樣品在下游以0.25ml/min的流量注入(從Cavro自動采樣器)，產生的總流量為1.25ml/min。在每個試驗之前記錄暗光譜(關燈)。在液流達到Hellma流通式吸收池(178.713型，光徑長度10mm，容積8μl)后，由CathodeonC720氘脈沖燈電源打開氘燈(Cathodeon)，記錄在樣品和緩沖劑B存在下的參比能譜。梯度開始并經過240秒，在此期間緩沖劑成分互相以反比隨時間發生線性變化，從成分B(堿性緩沖劑)開始，在240秒結束時變化到成分A(酸性緩沖劑)。總梯度流量保持在1ml/min。在梯度結束后，使緩沖劑A和樣品通過一段短時間，推動梯度的末端通過流通式吸收池，然后進行轉換，返回到緩沖劑B，以儲存為下一個樣品準備的初始條件。在打開燈后，采用Zeiss256波長的光電二極管陣列和12-位數據獲取電子設備在梯度期間以0.5秒的間隔記錄光譜。每個光譜都由總共花費50毫秒的五個掃描的平均值組成，還對每個光譜記錄了每個二極管通道的能量計數減去暗電流的差值。標準和校準對已知(文獻)pKa的四個標準苯甲酸(pKa3.96)、鄰苯二酸氫鉀(pKa4.87)、對硝基酚(pKa6.90)和苯酚(pKa9.72)采用每個自動采樣器盤進行試驗，以建立pH刻度。標準化合物的已知pKa對標準化合物吸光度曲線一階導數峰最大值時間的線性回歸產生一條校準曲線，可用這條曲線確定未知化合物的pKa。還采用每個盤進行幾個空白(無離子水)試驗，以便能從緩沖劑成分的吸光度曲線中減去本底。樣品準備一般稱取1-10mg樣品放入管形瓶中，再將1ml甲醇加入其中，以促進樣品的溶解，然后加入10ml無離子水(＞1014MΩ)。將溶液吸入5ml的一次性注射器中并通過一次性尼龍過濾器將其直接送入試管中，以除去未溶解的固體。將試管直接轉移到Cavro自動采樣器單元上進行樣品分析。樣品的流量占總流量的20％，使在流通式吸收池檢測器處的典型樣品濃度為10-3-10-3M。數據處理第一步是采用吸光度曲線一階導數峰最大值時間確定pH刻度。采用幾種波長(苯甲酸-235nm；KHP-278nm；對硝基酚-321nm；苯酚-235nm)并將能譜轉換成吸光度A＝log10((1(參比)-1(暗))/(1(樣品)-1(暗)))式中1(樣品)是樣品對特定通道或波長的梯度強度或能量計數；1(暗)是暗電流；和1(參比)是初始參比計數(緩沖劑B+樣品)。首先處理空白，并從所有的樣品和標準的光譜中減去空白。以標準的峰值時間對已知的pKa值繪圖，并將校準曲線存入文件。對一組指定的試驗條件已經證明，校準的回歸方程在幾周的期間內是非常一致的，減少了每天多次校準的必要性。在用導數方法確定梯度開始和結束時的pH以后，就可處理樣品的數據。對于樣品分析，一般選擇達20個平均波長間隔，波長范圍為210-350nm，并將能量計數按上述方法轉換成吸光度。也可通過選擇光譜的非吸收區(通常為420-440nm)和建立空白基準線，應用內標校正任何漂移。應用目標因式分析(TFA)確定樣品的pKa值。也可將一階導數方法應用于pKa值不重疊的樣品。為了選擇吸收紫外線的化合物，下面給出采用圖8的裝置和最佳的緩沖劑以及采用一階導數和TFA數據處理方法進行的幾次自動采樣器試驗的結果，并將其與文獻的pKa值比較。這些結果表明，對范圍廣泛的化合物能準確地測定pKa，其中有些化合物具有多個pKa，而且pKa很接近，已經證明，對此采用傳統方法很難解決。我們發現，往往可采用連續滴定以及TFA數據處理確定它們，有時也可采用一階導數數據分析方法。校準曲線pH＝-0.021×時間+12.49(R2＝0.9950)pKaKHP4.878苯酚9.721苯甲酸3.964對硝基酚6.869結果(還可見圖25)a是在25℃和離子強度0.15M下用pH測量測定的b1984年艾伯特和薩金特對離子強度0.15M修正的c是在25℃和離子強度0.2M下用分光光度法測定的，Mchedlovpetrosyan等人，分析化學雜志，蘇聯，1984，39，1105d沒有可利用的校準曲線pH＝-0.022×時間+12.66(R2＝0.9955)pKaKHP4.878苯酸9.721苯甲酸3.964對硝基酚6.869結果(還可見圖26)<>a1984年艾伯特和薩金特對離子強度0.15M修正的b是在25℃和離子強度0.15M下用pH測量測定的c沒有可利用的類似地，采用圖8的裝置和在試驗2A中設定的緩沖劑對35種化合物進行試驗。采用一階導數處理數據。對這些結果與這些化合物的文獻pKa進行比較。為了證明連續滴定方法在很寬的pH范圍內的準確性，挑選一些pKa范圍很寬的化合物。試驗結果繪于圖27。正如從圖25-27所看到的，已經證明，在很寬的pH范圍內和對用傳統方法一直難以測定的具有多個pKa的化合物，連續滴定方法是一種測定pKa的準確方法。實施例3對分配進膠束的測定某些藥物分子的重要特性是它們可透過某些阻擋層例如磷脂膜分配。給定分子的一種電離狀態一般會比其它狀態更有效地透過阻擋層。在一定pH下，在自由溶液中分子以某一恒定比例電離。但個個分子會在電離狀態和未電離狀態之間發生轉換這就是動力學平衡。例如，如果未電離的形式分配進膠束的傾向較大，那么膠束的加入就會引起自由溶液中這種質點濃度的下降，因為有一些分子會進入膠束中。自由溶液中電離和未電離形式的動力學平衡就起調節作用，使電離質點濃度的降低和未電離質點濃度的升高，直至重新建立初始的平衡比為止。因此在有膠束存在下進行pH梯度試驗時，所觀測的吸光度中點(表觀pKa)會發生偏移。這造成所觀測的化合物pKa的偏移，對于酸pKa增加，對于堿pKa降低。已知二相的體積比，可直接從表觀pKa的這一偏移推導出該化合物的logP。這種方法的一個假設是，分子的吸收性質在兩相之間不會發生顯著的變化。可采用連續滴定方法和上述的裝置，通過在梯度混合物中包含第四種成分來研究這種行為。這種成分包含由表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)形成的膠束。在第四種成分中表面活性劑的濃度必須足夠高，以致在由四種成分混合成的最終待測液流中，表面活性劑的濃度超過其臨界膠束濃度(CMC)并生成膠束。為了確定分配作用，在進行pH梯度試驗時，保持膠束懸浮液和樣品溶液的量不變。可根據下式確定分配系數logP＝log(△pKa(Vw/Vo))式中△pKa是在有膠束存在下和沒有膠束存在下pKa的差值，Vw是水相體積，Vo是有機相(膠束)體積。Vo可根據CMC、膠粒半徑和表面活性劑聚集數(每個膠粒所需的分子數)以及有經驗的人員很容易得到或可以計算的一些系數計算。苯甲酸進入SDS膠束中的分配采用連續滴定進行這個試驗，以觀測進入膠束中的分配。按照實施例1(圖2)的方法設置連續滴定裝置。采用四種濃度的SDS，它們是由0.1M的原料水溶液配制的。配制下列樣品，總體積為20ml。</tables></tables>*～0.5mg固體苯甲酸連續滴定裝置按下列樣品次序安排1.空白(只有水)10.E2.空白(只有水)11.F3.空白(只有水)12.G4.標準113.H5.標準214.I6.A15.標準17.B16.標準28.C17.空白(只有水)9.D18.空白(只有水)不包含苯甲酸(SDS空白)的管形瓶未示出滴定曲線，所以在進一步處理時略去(管形瓶7、9、11和13)。結果列于下表標準曲線截距＝-4.9325斜率＝0.0326樣品logP的計算logP＝log(△pKa×Vw/vo)式中Vw＝水相體積Vo＝有機相體積對于這種應用，Vo取SDS膠束的體積。在0.1M離子強度(緩沖劑液流的離子強度)下膠粒半徑＝2.5×10-9m聚集數～100臨界膠束濃度1.5mM(根據VanCs(范奧斯)N.M.等人“所選的陰離子型、陽離子型和非離子型表面活性劑的物理化學性質”。ElsevierISBN0-444-89691-0)。在CMC以上存在的所有表面活性劑都是以膠束形式存在的，所以根據上述的資料，我們就可以計算在每種溶液中存在的SDS膠束體積。球體積為V=4&pi;r33=6.54&times;10-26m3]]><<p>這個試驗看來進行得非常好，觀測到pKa的偏移是一致的，這在所有的SDS濃度下都給出合理的結果。這些結果表明，連續滴定可用于測定進入具有機體構造的有機相例如膠束中的分配。實施例4終點滴定-采用圖2的裝置許多傳統的定量滴定方法，例如溶液中化合物濃度的測定，依賴于目視終點指示劑的使用。這種方法的準確度非常依賴操作人員的經驗和終點指示劑的目視判斷。采用分光光度檢測終點的連續梯度滴定，使這種方法的準確度與操作人員的經驗無關。這種方法特別適用于具有一個可電離基團或少數不重疊pKa的化合物。這種方法的應用實例是采用酚酞作指示劑通過終點測定鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)的濃度。KHP在溶液中是強酸。它可用強堿滴定定量地測定，在滴定完所有的KHP以后，pH急劇升高，pH由存在的酚酞指示劑檢測。指示劑在pH8.4-10.0發生顏色變化，從無色變成粉紅色。和上述的實施例2一樣，在圖2裝置的樣品液流中加入待測的溶質(KHP)，樣品量保持恒定，為最終混合物的20％。二種梯度的成分(分別從80％變到零和從零變到80％)是0.05MKOH和水。通過樣品液流(在20cm3樣品中加入2滴酚酞溶液)加入終點指示劑。采用KOH液流滴定待測的溶質KHP。一旦滴定完所有的化合物，pH就大幅度地升高，指示劑的電離狀態迅速地改變，因而顏色迅速地發生變化。該系統是采用已知濃度的KHP標準校準的。化學試劑·0.05MKOH-通道B用H2O將50cm30.5-KOH(Aldrich)稀釋到500cm3稱出0.27g酚酞指示劑，將其溶解在10cm3MeOH和10cm3H2O中。有些沉淀生成。·KHP溶液0.1416M進行一系列的稀釋，配制出下列的KHP溶液0.1416M0.0708M0.0354M0.0177M0.0089M將這些標準液倒入閃爍管形瓶中，加入2滴指示劑。然后對樣品和空白進行試驗。測定在240nm的吸光度。在圖16中示出這個實施例所得的跡線。將對空白和標準所獲的峰值時間輸入Excel電子數據表中，執行KHP濃度對梯度時間的回歸。由連續梯度滴定測定KHP<>采用非常有效的統計方法獲得良好的回歸，r2＝0.9996F＝10337-標準的校準曲線示于圖17。采用這條校準曲線，就可根據其一階導數峰值的吸收時間，確定對同一梯度的KHP未知濃度。這個試驗證明了連續梯度滴定對經典終點滴定的適用性。這種方法比傳統的方法有幾個優點。1.分析速度快，分析數量大；2.終點的檢測非常顯明，準確度高；3.不需要用戶的經驗；4.動力學范圍寬。實施例5KHP終點的確定-采用圖8的裝置溶液酚酞指示劑將0.33g酚酞溶解在10cm3MeOH和10cm3H2O中。過量的酚酞逐漸沉淀出來。KOH滴定劑將50ml0.5NKOH(Aldrich)用二次蒸餾H2O稀釋到500cm3，配制成濃度0.05N的KOH原料溶液。KHP原料溶液將7.723gKHP(Mw204.23)溶解在250cm3H2O中，配制成濃度為0.15126M的溶液。由KHP原料溶液配制成一系列的標準。<>KHP樣品由原料溶液配制一組KHP樣品，在試驗后求出樣品的組成為<試驗裝置DAD440檢測器設置檢測540nm、550nm、560nm和570nm四種波長的二極管陣列檢測器。注射器模塊溶劑AH2O溶劑B0.05NKOH溶劑是由5cm3注射器注入的。通過流通式吸收池的流量為0.8cm3min-1。梯度時間240秒，預梯度流動時間75秒和梯度后流動時間90秒，接著是梯度后復位時間45秒，總循環時間7.5分。設置注入流量為0.2cm3min-1、循環時間為7.5分鐘的自動采樣器。按下列順序對空白、標準和樣品進行試驗。采用Dasylab獲取數據，在將3個數據點修勻后，采用一階導數方法分析數據。分析在540nm的數據。繪制標準曲線圖(見圖19)，該曲線圖可由下式表示y＝0.009×-0.1166R2＝0.998采用根據標準溶液繪制的校準曲線，可將每個樣品一階導數最大值的時間轉換成上表中的樣品濃度。將這些結果(對雙樣的平均值)與計算的樣品組成進行比較實施例6Zn++的EDTA絡合滴定-采用二甲酚橙作指示劑這種方法大體上是基于S.G.Novick(諾維克)為測定喉糖片中的鋅而研究的方法(化學教育雜志，Vol.74(12)1463(1997))。鋅離子與二甲酚橙形成的絡合物產生在580nm處吸收的深紅色，在用EDTA(乙二胺四乙酸)滴定時，Zn++優選與EDTA形成絡合物。一旦所有的Zn++都生成EDTA-Zn++絡合物后，二甲酚橙又變成游離的形式，在表觀上是黃色，所以觀測到在580nm處的吸光度相應降低。溶液二甲酚橙指示劑0.1％的H2O溶液＝100mg/100cm3EDTA溶液將3.485gEDTA·2Na·2H2O(Mw372.24)溶解在500cm3的H2O中，配制成500cm3的18.75mM的原料溶液。鋅標準選擇硝酸鋅作為標準配方中的鹽。在待測混合物液流中的鋅濃度必須低于EDTA的最高濃度，以確保所有的鋅都被EDTA所絡合，而留下游離的未絡合形式的指示劑。在EDTA濃度最高時，EDTA溶液占液流的80％，所以其濃度為18.72×O.8＝14.976mM。因此在測定液流中的Zn++濃度必須低于14.976mM。鋅樣品占液流的20％，所以樣品中鋅離子的最高濃度必為14.976×100÷5＝74.88mM。稱出1.03gZn(NO3)2·6H2O并將其溶解在50cm30.1N乙酸鹽緩沖劑(pH4.9)中，配制成濃度為69.25mM的鋅原料液。由這種原料液配制標準*向每個標準中加入200μl二甲酚橙指示劑梯度注射器AH2O注射器B18.72mMEDTA原料液流量0.8cm3min-1梯度時間100％A到100％B為240秒，預梯度注入時間75秒(注射器A)，梯度后注入時間90秒(注射器B)和梯度后復位時間45秒(注射器A)。循環時間共7.5分鐘。自動采樣器循環時間7.5分鐘、注入流量0.2mlmin-1的，采用EDTA梯度進行標準試驗，以建立校準曲線(見圖20)。在570nm處的吸光度數據的一階導數的峰值時間如下>NF＝一階導數曲線未擬合一階導數曲線不可能與高濃度標準的吸光度數據擬合。認為這是由于標準溶液的緩沖作用不夠造成的，因此溶液中二甲酚橙指示劑不能產生清晰的顏色變化。對于第三種標準，在能夠得到結果的場合，得到線性的校準曲線(圖20)。這個試驗清楚地表明，連續滴定方法可以用于絡合滴定。在此所示的實施例中，緩沖能力不夠，但這可采用緩沖劑配制EDTA溶液來改進。實施例7曲線擬合方法對由連續滴定產生的pKa數據的應用可由上面討論的一階導數方法分析由連續滴定方法和裝置產生的吸光度數據。為了成功地采用這種方法，吸光度數據需要修勻，這會失去滴定的過高和過低數據。然而，在吸光度變化大、pH梯度的線性非常好又沒有重疊的pKa時，一階導數方法能處理得很好。可用于數據分析的第二種方法是目標因式分析(TFA)。這種方法更適合多個、特別是重疊的pKa，但計算強度大，需要在幾種波長處的光譜數據。此外，在能處理數據之前，尚需了解樣品分子的電離行為。能適用于本發明的連續滴定分光光度方法產生的數據的第三種分析方法，是“曲線擬合法”。這種分析方法可應用于光譜變化非常小的場合，它對非線性的pH梯度是相當不靈敏的，這種方法只需一種波長的數據，并不需要數據修勻，計算強度也不是很大。在下面的實施例中，由樣品化合物S滴定的吸收數據，是采用實施例2的方法形成的線性pH梯度得到的，按照下面所述的方法將其歸一化。采用四種波長處的數據。測定每種波長的最小和最大的吸光度，在0和1之間采用下式換算數據光譜的變化可定義為對數函數式中A、B和D是常數，x是因變量。在下面的實施例中A、B和D是由試差法擬合求出的，x是時間。采用微軟ExcelTM中的“求解程序”功能，通過使殘差平方和最小和將A、B和D擬合，使這個函數與光譜數據擬合。下面列出四種波長的數據如果B大，則吸光度隨時間而增加。如果B小，則吸光度隨時間而下降。該對數的一階導數被定義為通過求出相應于一階導數最大值的數據點，我們就能采用這些數據作為根據已知pKa的標準校準的標準一階導數數據。樣品S的數據如下</tables>正如所看到的，所有光譜的變化都是非常小的。</tables>可采用在歸一化過程中所采用的范圍將這些值加權</tables>*加權平均值是采用微軟ExcelTM中的“和積”功能產生的在圖21-24中對每一波長標繪出原始數據、擬合曲線和(為了對比)一階導數曲線。實施例8對分配系數測定的理論研究在不溶混的溶劑存在下測定pKa時，所得的“表觀”pKa值有偏移。這種偏移是由于化合物向有機相中分配引起的。偏移的大小取決于化合物的分配系數和二相的體積比。可根據下式求出分配系數(logP)logP＝log(10ch(pKa-pKa′)-1)/R式中pKa＝在H2O中的pKapKa＇＝在有機相存在下的pKach＝分子的電荷(對酸為-1，對堿為+1)R＝體積比＝有機相體積÷水相體積這一模型只對一元化合物是正確的。如果體積比相等，則logP約等于pKa與pKa′之差。采用連續滴定裝置進行二次滴定可用于測定logP值，第一次是與實施例1相同的標準連續滴定，第二次滴定加入與水性樣品液流接觸的辛醇或其它有機相液流。當在水相和有機相液流之間有足夠的接觸面積時，在二相之間就會發生分配。然后分離水相和有機相并使水相液流通過檢測器。實現此目的的一種手段是采用由CRL和BNFL開發的微量化學處理裝置。這種裝置是專門用于使水相和有機相流動互相接觸，然后完全分離。其詳情可在“Eureka，傳輸技術”1997年10月，42頁上找到。如果采用相同的流量，就相當于等於在傳統的分配試驗中的體積比。根據這一試驗預測的光譜數據可模擬如下對任一指定的pH，一元化合物的logD可模擬如下式1logD＝log(10logP+10logP·△+ch(pKa-pH))-log(1+10(ch(pKa-pH)))式中logP＝未電離質點的logP△＝未電離質點的logP減去電離質點的logPch＝電荷(對酸為-1，對堿為+1)pKa＝分子的pKa在任一指定的pH下溶液的吸光度都可由下式模擬式2式中A1＝電離質點的吸光度A0＝未電離質點的吸光度在分配試驗中，水相中的化合物濃度可由下式模擬式3濃度水相＝1/10logD+1而辛醇相的濃度由下式模擬式4濃度辛醇＝1-濃度水相將式2和3合并，我們可模擬在分配試驗中水相的吸光度。對典型的酸和堿，預測的結果與圖28和29中所示的相似。變更方法顯然，有經驗的人員對上述發明進行更動是可能的，例如可在樣品溶液中包含已知pKa的標準化合物提供內標，代替在采樣前或采樣過程中采用幾個標準試驗校準系統。它們會給出與待測化合物比較的已知pKa的吸光度變化時間。顯然有經驗的人員還可借助于標準的試驗室技術，在沒有過重負擔的情況下采用其它一些修改方案。權利要求1.一種連續滴定的方法，其中在改變混合物中一種或多種物質的濃度使混合物的組成連續地變化時，可監測待測混合物中至少一種化合物的至少一種參數，該方法包括以下步驟連續混合至少二種成分流體液流，形成待測混合物液流，并使待測混合物液流通過分光光度檢測區，其特征在于形成待測混合物液流的至少二種成分液流的體積比是通過改變形成待測混合物的成分液流的相對比例而隨時間連續地變化。2.根據權利要求1的方法，其中待測混合物液流是由三種成分流體的液流形成的，一種成分流體液流的比例保持恒定，第二種和第三種成分流體液流的比例互相以反比變化。3.一種連續滴定的方法，其中包括將包含待測化合物的流動的流體液流與至少一種附加的流動流體液流混合，形成待測混合物液流，并使待測混合物液流在恒定的流量下通過分光光度檢測區，在該區讀取關于待測化合物的至少一種物理或化學參數的讀數。4.根據權利要求1或2的方法，其中可變的成分液流包括緩沖劑溶液、檢測試劑、水或有機溶劑。5.根據權利要求4的方法，其中具有至少二種可變的成分，其中包含二種線性化的緩沖劑溶液。6.一種分析裝置，其中包括至少二個與公共通道以流體相通的入口，一個具有與公共通道以流體相通的入口和出口的檢測區，該裝置還包括一個分光光度檢測器，用于監測通過檢測區流動的流體，并產生關于流體至少一種化學或物理特性的數據。7.根據權利要求6的分析裝置，還包括與入口連接的控制裝置，用于控制通過每個入口引入公共通道的流體的相對量。8.根據權利要求6或7的分析裝置，其中分光光度檢測器是紫外或可見光范圍的分光光度計、熒光計、旋光計、比色計或光散射、光旋轉或圓形二色性檢測器。9.根據權利要求8的分析裝置，其中分光光度檢測器是紫外或可見光范圍的分光光度計。10.根據權利要求7-9任一項的分析裝置，其中與入口連接的控制裝置包括自動注射器、混合器泵、蠕動泵或數字開-關閥泵、或它們的組合。11.根據權利要求6-10任一項的分析裝置，還包括適合將多個樣品相繼送入公共通道的自動樣品輸送裝置。12.根據權利要求11的分析裝置，其中自動的樣品輸送裝置包括自動采樣器。全文摘要本發明涉及一種改進的分析方法及其所用的裝置,具體涉及連續滴定的方法和裝置,其中在混合物的組成連續變化時,可監測待測混合物中至少一種化合物的至少一種參數。文檔編號G01N31/16GK1278331SQ9881068公開日2000年12月27日申請日期1998年9月9日優先權日1997年9月9日發明者C·D·貝范,A·P·希爾,D·P·雷諾申請人:葛蘭素集團有限公司