專利名稱：一種新的免疫毒素的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種由生物工程技術制備的免疫毒素，特別是涉及一種用人源性毒素穿孔素(perforin)的活性片段作為毒素分子，通過基因工程技術將穿孔素的活性片段與載體相結合而制成的免疫毒素。
目前，所用的大多數毒素仍為異源性毒素，細菌或植物來源，如綠膿桿菌外毒素PE，白喉桿菌外毒素DT，蓖麻毒素Ricin等，動物實驗和臨床使用已證明這類毒素可喚起機體對毒素的免疫反應，體內產生的抗體可中和免疫毒素的細胞毒活性。此外，目前所用毒素均屬于細胞內毒素，包括人源毒素RNA酶(血管生成素等)，要發揮作用，首先涉及到毒素的內化(endocytosis/internalization)，毒素能夠被載體順利攜帶使之內化，并能轉運至胞質中才能發揮作用。不能內化或不能適當轉運則無活性，不能殺傷靶細胞。應用人源性毒素(如血管生成素)作為毒素分子，由于其作用過程亦需內化，作用機制與經典毒素類似，用這種免疫毒素治療惡性腫瘤，更有刺激腫瘤血管增生之慮，并未得到廣泛接受和應用。
本發明的目的在于提供一種對人體不具有免疫原性，有嚴格靶向性，可直接激發細胞膜損傷過程，不需內化及細胞內轉運過程的免疫毒素。
實現本發明的方法是以PCR技術擴增編碼細胞因子或者抗體的基因片段，以及編碼穿孔素(Perforin)活性部位的基因片段，與表達載體(Expression Vector)連接，轉化大腸桿菌，誘導表達融合蛋白，復性并分離純化得到免疫毒素。
與已有技術相比，本發明的突出優點是人源性毒素穿孔素的活性片段為人體固有蛋白，又是一種膜損傷性毒素，長期反復應用不會發生過敏或免疫反應，也不需要內化。殺傷靶細胞的過程直接、迅速，與已有技術相比，殺傷時間可縮短3-100倍。本發明可廣泛在生物工程領域的各類生產單位實施，可用于治療某些腫瘤、自身免疫性疾病，特別適合用于抑制器官移植時的免疫排斥反應。
實施例一、IL2HPN34重組免疫毒素的質粒構建1.擴增不含終止密碼的IL2 cDNA片段取凍存的分別含pBV221/IL2原核表達質粒和pBV221原核表達質粒的菌株，劃線接種于含氨芐青霉素的LB-瓊脂培養板上，30℃培養20小時，挑取單菌落接種于10ml含氨芐青霉素的LB培養基30℃振搖過夜，采用小量快速質粒提取法，提取質粒作為模板。
IL-2上游引物5′GGG AAT TCC ATG GCA CCT ACT TCAA3’，5’端包含有EcoRI酶切位點，ATG起始密碼，但不含信號肽序列，IL2下游引物5’-GCC GGA TCC AGT TAG TGT TGA GA-3’不含終止密碼，含BamHI酶切位點。
以適度稀釋的pBV221/IL2質粒DNA為模板，以特異性引物，經PCR擴增不含終止密碼的IL2 cDNA片段，反應條件如下反應體系去離子水30μl25mM MgCl23μl4×dNTP 4μl(每鐘200μM)上游引物2.5μl(25pmol)下游引物2.5μl(25pmol)
模板1μl(～100ng)經95℃變性10分鐘，加入Taq DNA聚合酶2u表面覆蓋液體石蠟以防蒸發，94℃，50秒變性，55℃，50秒退火，72℃，1分鐘延伸，30個循環，最終72℃延伸10分鐘，循環完畢，取反應產物5μl，2.0％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA分子量標準物為參照，紫外燈下觀察擴增結果。擴增產物為420bp片段。經電泳證實后，以酚氯仿抽提，乙醇沉淀，風干后溶于適量去離子水中備用。
2.人穿孔素(HP)cDNA活性片段的制備HPN34上游引物5’GCC GGA TCC CCG TGC CAC ACA GCCGCA 3’起始于HP第一個氨基酸，含BamHI酶切點，不含起始密碼，下游引物5’-CCG CTG CAG TTA GCG GCG GAG GCT GGTCA3’，與nt85 nt102互補，含Pst1酶切位點及終止密碼。
取凍存的含PCDM8/HP質粒的菌株，劃線接種于含氨芐青霉素和四環素的LB-瓊脂板上，37℃培養20小時，挑取單菌落，于10ml含兩種抗菌素的LB培養基中37℃的振蕩過夜，采用小量快速質粒提取法提取質粒。
以PCDM8/HP質粒為模板，加入特異性HPN34引物，經PCR擴增，反應體系同前。
3. pBV221/IL2 HPN34質粒構建及工程菌建立①取不含終止密碼的IL2基因片段，HPN34基因片段，以及質粒pBV221，分別用EcoRI/BamHI，BamHI/PstI，EcoRI/PstI雙酶切，酶切體系20μl，37℃ 3小時，取少量酶切產物電泳，證實pBV221已被切開，經低溶點瓊脂糖凝膠電泳回收線化的pBV221質粒，及經酶切的IL2，HPN34基因片段，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于適量去離子水中，三者按一定比例混勻，加T4連接酶及連接緩沖液，總量20μl，16℃連接過液。連接產物置4℃備用。
②DH5α感受態細胞的制備-70℃凍存的DH5α菌株，劃線接種于LB瓊脂培養板上，37℃倒置培養過夜。挑取單菌落接種于50mlLB培養液中，37℃劇烈振搖培養，至OD600，達0.3～0.4時，將菌液轉移至50ml無菌離心管，冰浴10分鐘，4000rpm，4℃離心10分鐘，棄上清，加入預冷的0.1M無菌CaCl2溶液10ml，重懸細菌，冰浴10分鐘，4℃，4000rpm，離心沉淀細菌，再以2ml預冷的0.1M CaCl2溶液重懸，分裝至1.5mlEppendorf管備用(200μl/支)。
③重組質粒的轉化取制備的感受態細胞200μl，加入連接產物5μl(50ng)，混勻后冰浴30分鐘，42℃循環水浴2分鐘后，迅速置冰浴中2分鐘，加800μl LB培養基，30℃振蕩培養1小時，取100μl菌液用無菌玻棒涂布于含100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養板，30℃培養20小時，觀察菌落生長情況。
二、重組體IL2HPN34融合蛋白的表達和初步純化(一)證實pBV221/IL2HPN34表達融合蛋白①待測樣品準備，取經證實含有pBV221/HPN34質粒的菌株，接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養基中，30℃擴增細菌至OD6000.5，升溫至42℃，誘導表達3小時(對照不升溫誘導)。4℃，4000rpm離心，沉淀細菌，加1×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃水浴變性5分鐘備用。
②SDS-PAGE電泳檢測IL2HPN34融合蛋白表達。照儀器說明書安裝電泳裝置，按《分子克隆實驗指南》配制15％，Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠及5％的積層膠，并灌制膠板。等凝膠聚合后，取上述制好的樣品，依次加樣，每孔15μl，電泳(積層膠70V，分離膠140V)，至溴酚蘭到達分離膠下緣，停止電泳，取下凝膠，考馬氏亮蘭染色4小時，甲醇醋酸脫色至條帶清晰，背景透明。可見誘導株出現一條約18-20KD的蛋白條帶，與預期的蛋白分子量相符。
(二)IL2HPN34大量表達及初步純化選擇表達陽性菌株，接種于100ml含氨芐青霉素的LB培養基中，30℃振搖培養至OD6000.5，升溫42℃誘導表達3小時，4℃，4000rpm離心收菌，重懸于適量細菌破碎緩沖液(20mM Tris 50mMEDTA.pH7.5)，加入溶菌酶(1mg/1ml)，室溫下放置30分鐘，冰浴下超聲粉碎，在含1％ Triton-X100的洗滌液及含2％脫氧膽酸鈉的洗滌液中反復多次離心，(1％ Triton-X100，30mM Tris，50mMEDTA，2％脫氧膽酸20mM Tris，50mM EPTA，pH7.5)，獲得包涵體。6M鹽酸胍裂解包涵體，以0.1M Tris(pH8.0)復性緩沖液，室溫下稀釋復性，復性產物對生理鹽水透析，除去鹽酸胍等雜質。然后經硫酸銨分段沉淀(30％及80％飽和硫酸銨)，沉淀產物透析除鹽，過濾除菌，即得到粗制IL2HPN34。
還可根據上述原理制備出以穿孔素其它活性片段作為毒素分子的免疫毒素。
權利要求
1.一種由載體分子與毒素分子經基因工程技術制備的免疫毒素，其特征在于所述的免疫毒素的毒素分子是穿孔素(Perforin)的活性片段。
全文摘要
本發明涉及一種新的免疫毒素,其特征在于利用人源性毒素穿孔素(Perforin)的活性片段作為毒素分子,通過基因工程技術將毒素分子與載體分子的基因重組在大腸桿菌中表達出的免疫毒素,其優點是對人體不具有免疫原性,有嚴格靶向性,可直接激發細胞損傷過程,殺滅靶細胞,不需要內化及細胞內轉運過程,可用于治療某些腫瘤和自身免疫性疾病。特別是適合用于抑制器官移植時的免疫排斥反應。
文檔編號C07K2/00GK1254717SQ9811302
公開日2000年5月31日 申請日期1998年11月24日 優先權日1998年11月24日
發明者王一理, 司履生 申請人:西安醫科大學