專利名稱：純化(多)肽的制備的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于方便純化(多)肽的制備的修飾方法，還涉及一種利用該修飾方法的純化工藝。
近些年來，采用t-Boc或F-moc策略的固相肽合成技術有了很大的改進。復雜的合成方法可以制備約100個或更多殘基的多肽1-4。然而，由于在肽合成的每一個循環都有可能發生不完全連接和鏈終止，導致缺失序列和截短序列的形成。
這些以及可能發生的副反應(主要發生在從樹脂上最后切離過程中)妨礙了直接從其它雜質中分離所需求的肽。長合成多肽的純化是用于生物學研究和用于人及動物的產品生產中的主要問題，因為它們必需是高純度的。
尤其是，當合成的序列包含30個或更多個殘基時，所需求的產物與缺失的肽、截短的肽或修飾過的肽等雜質的物理性質如大小、電荷、疏水性等差異太小，無法得到充分的純化。另外，如反相HPLC的現代的高效分離技術常常受到收率低、載樣量小的限制，使得這些技術耗時多，花費高。
人們已經試驗了多種不同的方法來克服這種限制。有人將一種153個殘基的IL-1合成蛋白質5和一種99個殘基的SIV蛋白質酶合成蛋白質6生物素化，然后在一種抗生物素蛋白質-瓊脂糖柱上分離生物素化的肽鏈。
Ball等人7最近提出了一種純化方法，該方法基于加入一種可逆的保護基團，使得肽鏈的最后一個殘基具有親脂性、酸性或堿性。
有人利用合成序列中存在的特定殘基優化了更為特異的層析方法。例如，含半胱氨酸的肽通過與固定化的汞衍生物8或活化的硫醇9反應而得到的純化，且固定化金屬離子親和層析方法(IMAC)10也已成功地用于含組氨酸或色氨酸的肽的純化11。
重組蛋白質中有目的地加入組氨酸尾巴、B細胞表位或者GST組分，然后可利用這些尾部結構進行親和層析。
一般地，一種基于合成肽的物理化學性質的純化方案必須根據每一個特定的樣品進行優化，而這是一種耗時多、花費高的過程。因此，為了獲得通用的純化方法，開發了許多技術15。然而，迄今為止所報道的純化方法都不盡如人意，因為這些方法需要花費大量的時間和/或終純化產物中存留共價衍生的肽，而這就可能影響產品的生物和物理化學性質，及其在動物和人中的應用。
因此，本發明的目的就是要通過提供一種用于方便其純化的多肽的修飾方法來改進已知的方法，并且改進(多)肽的純化工藝，該方法及工藝普遍適用，具有高回收率且易于操作。
通過一種修飾方法實現了本發明的目的，該修飾方法包括在(多)肽鏈合成過程中，向其末端插入至少一個可特異性裂解的氨基酸，并且，(多)肽中若有同種氨基酸時要加以保護使其不被裂解，從而使得特異性裂解精確發生于可特異性裂解的氨基酸處。
一種利用該修飾方法的純化工藝包括下列步驟a)合成所需求的(多)肽；b)在(多)肽的末端加入至少一種可特異性裂解的氨基酸，并且，(多)肽中若有同種氨基酸時要加以保護使其不被裂解；b)用一種標記序列延長(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延長的多肽；c)使用一種標記特異性的純化方法純化延長肽；且d)通過一種特異于所加入氨基酸的裂解方法從延長(多)肽中去除標記序列和所加入的氨基酸，以得到純化的多肽。
特異性裂解方法優選是化學裂解法，下面將做進一步的說明。
本發明的方法和工藝適用于每一種(多)肽，因為它不依賴于其氨基酸組成。而且，在特定優選實施方案中，該方法和工藝花費不多且效率很高。
在一種優選實施方案中，加入親和標記(例如，6個組氨酸殘基序列或者其它方便純化的化合物)之前，使用甲硫氨酸殘基作為添加的氨基酸。在經過例如標記特異性的親和層析等適當的純化步驟以后，使用在甲硫氨酸殘基處特異性裂解的CNBr消化法以切除組氨酸標記。CNBr消化法是一種花費不多而效率很高的方法。
在一種優選實施方案中，標記包括至少一個組氨酸殘基序列(優選6個或6個以上)和一個甲硫氨酸殘基。也可以任選地加入一種或多種其它氨基酸。
如果所需求的多肽序列中含有甲硫氨酸殘基，那么當用溴化氰除去標記時，它們也將被裂解。然而，根據本發明就可以避免這種情況的發生，方法是在(多)肽合成過程中使用修飾過的甲硫氨酸殘基。這種修飾過的甲硫氨酸殘基的一個例子為甲硫氨酸亞砜。
本發明方法和工藝的另一實施方案中，標記是一種如聚乙二醇的大分子。在這種情況下標記特異性的純化方法是凝膠過濾層析法。
本發明的方法和工藝同樣適用于由重組DNA技術生產的多肽。在優選實施方案中，所需求的多肽中原有的而不在標記中的甲硫氨酸殘基經裂解保護，例如用如纈氨酸、甘氨酸等其它氨基酸取代或者被刪除。
在本申請中，“標記”是指在所需求肽的合成過程中或者在其合成之后加入到其上的一種可去除的分子。一個“標記”可以是在多肽合成過程中加入的一種氨基酸序列，也可以是一種易于從組分混合物中純化出來的其它分子。后者的一個例子是聚乙二醇(PEG)。
在本申請中，術語“肽”、“多肽”、和“(多)肽”可以替換使用。
下面給出一個實施例來說明本發明。很顯然，熟練技術人員完全可以根據本實施例設計出落在本發明專利保護范圍內的其它方法。本實施例公開了一種通用的純化方法，它基于下面的組合1)一種加帽(capping)方法，2)在天然序列的合成過程中使用甲硫氨酸亞砜作為經保護的甲硫氨酸，并且3)使用1個甲硫氨酸、2個甘氨酸殘基和用于親和層析的6個組氨酸終序列來延長所需求的肽。在充分的純化步驟后，組氨酸標記用溴化氰裂解，然后將甲硫氨酸亞砜最終還原為甲硫氨酸。采用這種簡單、直接的策略，利用傳統的層析方法就可以在短時間內高產量地將69個殘基的多肽“PbCs242-310”純化至均質，該多肽覆蓋Plasmodiumberghei的CS蛋白質的C-末端區。實施例1．材料與方法1.1試劑與溶劑用于肽合成的化學藥品和溶劑購自Calbiochem-Novabiochem AG(Laufelfingen，瑞士)和Fluka(Buchs，瑞士)。1.2肽的合成與分析為說明本發明，采用Applied Biosystem 431A肽合成儀以固相F-Moc化學法化學合成了一種命名為“PbCs242-310”的多肽12，其覆蓋Plosmodium berghei CS蛋白質的C-末端區。該多肽的制備在一種F-moc-叔丁基絲氨酸-對-烷氧基苯甲醇樹脂(Wang樹脂)上進行，反應規模為0.1mmol時，該樹脂的取代度為0.43mmol/g。合成在如下條件下進行使用5倍過量的F-moc氨基酸衍生物；DCCI和HOBt作為活化劑；開始的34個氨基酸連接時間為60分鐘，后面的殘基連接時間加倍。每一個反應循環結束時用乙酸酐進行加帽。側鏈保護基團包括用五甲基代苯并二氫吡喃磺酰基基團保護Arg；用-S-叔丁基基團保護Cys；用三苯甲基基團保護Asn、Gln和His；用叔丁氧羰基基團保護Lys和Trp；用叔丁基基團保護Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr。Met-306以F-moc-甲硫氨酸亞砜的形式插入以防止其以后被溴化氰裂解。
下一步，用序列His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Met-將該肽向N-末端方向延長，反應條件與上所述相同，只是在連接了第二個Gly以后省略加帽步驟。這樣得到的多肽命名為“組氨酸標記的PbCs 242-310”。
在室溫下將肽-樹脂用溶解在TFA中的2.5％H2O、5％三乙基硅烷處理2小時，以得到肽的粗制品。然后將此合成肽用體積排阻液相層析法進行純化(使用70×2.5cm的Sephadex G50柱，流動相為50％的乙酸/水)。肽的純度用RP-HPLC分析使用250×4.6mm的C4W-Porex柱，使用60分鐘內溶解在0.1％TFA/水中的10-90％CH3CN梯度，流速為1.0ml/分鐘。氨基酸組成按Knecht和Chang的方法測定13。1.3固定化金屬離子親和層析(IMAC)和CNBr裂解首先將多肽用基于組氨酸標記的親和層析法純化。然后再用溴化氰除去標記。
用Ni-NTA瓊脂糖樹脂制備一種Ni柱(Giagen公司，Chatsworth，美國)，并用緩沖液A(8M尿素、0.1M Na2HPO4、0.01MTris，用H3PO4調pH至8.0)平衡。將經過體積排阻純化的“組氨酸標記的PbCs242-310”多肽溶解于緩沖液A中，以15ml/小時的流速上柱。用緩沖液A洗柱，再用含50mM咪唑的緩沖液B以30ml/小時的流速洗柱。然后用含250mM咪唑的緩沖液B將“組氨酸”標記的多肽洗脫下來。其中，緩沖液B含8M尿素、0.1MNa2HPO4、0.01MTris，用H3PO4調pH至6.3。
將此洗脫液經過一種50×25cm的Sephadex G25柱(流動相為50％乙酸/水)脫鹽并冷凍干燥。再將其以20mg/ml的濃度溶于70％TFA中，用摩爾數過量100倍的CNBr在室溫處理8小時以除去組氨酸標記。
將經消化的產物冷凍干燥，溶解在緩沖液A中，再次上樣于Ni-NTA瓊脂糖柱。組氨酸標記保留在Ni-柱上，柱流出物中則含有“PbCs 242-310”多肽。然后，流出物經過50×2.5cm的Sephadex G25柱(流動相為50％乙酸/水)脫鹽并冷凍干燥。1.4甲硫氨酸亞砜的還原將經過CNBr處理和IMAC純化的產物用pH8.0的10％巰基乙醇處理，使甲硫氨酸亞砜轉變為甲硫氨酸，同時使S-叔丁基半胱氨酸轉變為半胱氨酸，然后再用凝膠過濾法進一步純化(250×4.4mm的Sephadex G25柱)。1.5質譜分析進行質譜分析時所用儀器為一種飛行時間質譜儀LDI 1700型MassMonitor(Linear Scientific Inc.,Reno,NV，美國)。將5微升1mg/ml的多肽溶液與5μl反式-3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(芥子酸)混合。其中，芥子酸為20mg/ml的乙腈溶液(Linear Scientific Inc.Reno,NV，美國)。取1μl上述混和液置于質譜儀探頭的尖端，并輕輕抽真空使之干燥。然后用一種N2-激光儀的3納秒激光脈沖(波長337nm)照射該樣品。用一種數字示波儀測定飛行時間并按肽MALDITOFMS校對標準(Linear Scientific Inc.,Reno,NV，美國)轉換為質譜結果。其中，數字示波儀系列號為9304(Le Croy Research System,Corp.,SpringValley,NY)。2．結果69個殘基的多肽“PbCs242-310”相應于P.berghei CS蛋白質的C-末端區12。如“材料與方法”部分所述，“組氨酸標記的PbCs242-310”是通過自動化方法進行合成的，其中每一次連接反應之后都包括一個加帽的步驟。
將600mg相應的肽樹脂用H2O/三乙基硅烷/TFA處理后，得到150mg以上的多肽粗品。
對此多肽粗品的質譜分析表明，其中含有分子量(MW)為9301的所需求成分，還含有低分子量的其它組分(

圖1)。
將90mg多肽粗品于25ml的Ni-NTA瓊脂糖柱用固定化金屬離子親和層析法(IMAC)進行純化(圖2)。用體積排阻液相層析法脫鹽后得到35mg“組氨酸標記的PbCs242-310”。對洗脫物(35mg)和流出物(55mg)280nm處測量的光吸收結果表明該純化工藝的收率為100％。
然后，將經過Ni柱純化的產物用CNBr裂解以除去6×His標記。
消化產物再次上樣于Ni柱以除去未裂解的肽，并用pH8.0的10％巰基乙醇處理以還原在合成中插入的甲硫氨酸亞砜和半胱氨酸殘基的保護基團。為確證甲硫氨酸亞砜已被完全還原，再一次將產物用CNBr處理，并用質譜法檢查裂解的效率。
用體積排阻層析法進行進一步純化，得到19mg純化的PbCs 242-310。
圖3顯示所得產物的質譜分析結果。圖4比較了肽粗品及純化的肽的分析層析曲線。可以看出，兩次層析的保留時間之間的差異是因為純化的產物中不含高度荷電的His標記。基于對214nm的吸收峰面積進行積分，表明該純化的“PbCs 242-310”約為95％純。該CS多肽的氨基酸組成也與預期的結果相符(表1)。表1氨基酸分析
3．討論由于有了高效的、自動化的肽鏈合成方法，生物活性肽的化學合成已經成為一種廣泛使用和迅速發展的技術。對于大多數的應用，合成產物的粗品必須經過純化以除去其中的殘基反應劑、不正確的序列以及化學修飾過的肽。這通常使用三氟乙酸/乙腈水溶液作流動相的反相HPLC來完成。雖然肽合成已實現高度自動化，但純化主要還是靠手工操作，因此耗時多、花費大、效率也不很高。
本實施例表明，本發明的工藝可以得到如圖3所示的高純度，而且易于操作、普遍適用。
如本文所述，由于所需求的序列中含有Met殘基造成的特異性裂解問題，可以根據本發明通過使用甲硫氨酸亞砜很容易地解決，因為甲硫氨酸亞砜可以抵抗CNBr裂解，且可用巰基乙酸定量地還原14。
由上所述，本發明的方法已成功地應用于多肽“PbCs 242-310”的純化。該肽含69個殘基，相應于P.berghei CS蛋白質的C-末端區12。雖然，如圖1質譜分析結果所示，從樹脂上切離下來的粗品中含有許多肽雜質，本發明者還是能夠在相對較短的時間內，高效率地將目的肽純化到均質。整個純化方案得到了19mg純化的PbCs 242-310，相當于粗品的約20％。
總之，表明了CNBr裂解同時以亞砜形式保護相關Met殘基，并結合使用一種高效的親和標記方法，構成了一種純化化學合成的長鏈多肽的高效而通用的方法。4．圖例說明圖1肽粗品的質譜圖2IMAC純化的層析曲線圖3純化的肽的質譜圖4肽粗品及純化的肽的層析曲線參考文獻1．Chong,P.,Sia,C.,Tam,E.,Kandil,A.& Klein,M.國際肽及蛋白質研究雜志(International Journal of Peptide & Protein Ressarch)41,21-27(1993).
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權利要求
1．用于方便純化(多)肽的多肽修飾方法，該修飾方法包括在(多)肽合成過程中，向(多)肽鏈末端插入至少一種可特異性裂解的氨基酸，并且該(多)肽序列中若有同種氨基酸時要加以保護使其不被裂解，從而使得特異性裂解精確地發生在可特異性裂解的氨基酸處。
2．利用權利要求1的修飾方法的純化(多)肽的制備工藝，該工藝包括下列步驟a)合成所需求的(多)肽；b)向該(多)肽末端加入至少一種可特異性裂解的氨基酸，同時，該(多)肽中若具有同種氨基酸時要加以保護使其不被裂解；c)用一種標記序列延長(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延長的多肽；d)使用一種標記特異性的純化方法純化延長的肽；且e)通過一種特異于所加入的氨基酸的裂解方法從延長的肽中去除標記序列和所加入的氨基酸，以得到純化的(多)肽。
3．如權利要求1或2中的工藝，其中的特異性裂解方法是一種化學裂解法。
4．如權利要求1、2或3中的工藝，其中所加入的氨基酸為甲硫氨酸；其中(多)肽中的甲硫氨酸在(多)肽合成過程中用一種可去除的保護基團進行化學修飾以保護它不被溴化氰裂解，且其中的氨基酸特異性裂解方法由溴化氰裂解。
5．如權利要求4中的工藝，其中的保護基團為亞砜。
6．如權利要求2-5中的工藝，其中的標記序列由HiS-His-His-His-His-His-Gly-Gly-組成。
7．如權利要求2-6中的工藝，其中，標記特異性的純化方法為基于對標記序列的親和性的層析方法。
8．如權利要求2-5中的工藝，其中的標記是諸如聚乙二醇之類的一種大分子。
9．如權利要求8中的工藝，其中的標記特異性的純化方法為凝膠過濾層析法。
10．如權利要求1-9中的工藝，其中所需求的(多)肽通過重組DNA技術在一種活體宿主中生產，(多)肽中與該多肽末端至少一種可特異性裂解的氨基酸相同的氨基酸被刪除或進行防裂解保護，例如用另外一種氨基酸取代。
11．如權利要求10中的工藝，其中，那些原存于所需求的(多)肽中而不在標記中的甲硫氨酸被刪除或者進行防裂解保護，例如可以使用諸如纈氨酸、甘氨酸或被修飾的甲硫氨酸等其它氨基酸來取代。
12．如權利要求10或11中的工藝，其中，活體宿主為一種真核宿主或者一種原核宿主，諸如大腸桿菌。
全文摘要
本發明提供了一種用于方便純化(多)肽的多肽修飾方法。該修飾方法包括:在(多)肽合成過程中,向其末端插入至少一種可特異性裂解的氨基酸,并且多肽序列中若有同種氨基酸時要加以保護使其不被裂解,從而使得特異性裂解精確地發生在可特異性裂解的氨基酸處。本發明還涉及一種利用此修飾方法的純化(多)肽的制備工藝。該工藝包括下列步驟:合成所需求的(多)肽;向該(多)肽的末端加入至少一種可特異性裂解的氨基酸,并且,該(多)肽中若有同種氨基酸時要加以保護使其不被裂解;并用一種標記序列延長(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延長的多肽;使用一種標記特異性的純化方法純化此延長(多)肽;通過一種特異于所加入氨基酸的裂解方法,從延長(多)肽中去除標記序列和所加入的氨基酸,以得到純化的(多)肽。
文檔編號C07K1/04GK1233255SQ97198637
公開日1999年10月27日 申請日期1997年9月9日 優先權日1996年9月9日
發明者M·羅吉洛, G·克拉丁, C·雷蒙德, N·法塞爾 申請人:Rmf迪克塔恩有限公司