專利名稱：肽的純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及肽的純化，具體涉及中等大小的肽的純化，更具體涉及九肽和十肽，如LHRH-拮抗劑的純化。
背景技術：
大多數中等大小的天然的和合成的肽是無定形物質。它們中的許多具有藥理學上有興趣的性質，諸如許多九肽和十肽，是LHRH(促黃體激素釋放激素)拮抗劑。這類已知的僅以無定形形態存在的一個具體的物質就是式(I)的合成的十肽Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(I)它是強力的LHRH拮抗劑，具有所需要的藥理性質。
為了在藥物制劑中應用，LHRH拮抗劑(I)和類似結構的九肽和十肽必須基本上是純的。在多步合成的最后一步得到的粗產物通過色譜或其它方法純化。為了除去從色譜帶來的殘留溶劑，經這樣純化的產物通常要被溶解在水性介質中并冷凍干燥。這是一個高成本的過程，產生不容易操作的體積龐大的產物。
因此希望有冷凍干燥以外的手段，從否則是純的肽中除去溶劑的純化方法。
發明目的本發明目的是提供從上述種類的否則是純的肽中除去殘留的有機溶劑的純化方法，該方法避免了冷凍干燥。
本發明的另一個目的是提供這樣的一種基本上不含殘留的有機溶劑的否則是純的肽，它不是呈冷沉淀物的形態。
本發明的其它目的通過以下的本發明概要、其優選的實施方案的敘述、以及所附的權利要求書將變得明顯。
發明概述本發明提供否則是純的肽(具體是九肽或十肽，更具體是作為LHRH-拮抗劑的九肽或十肽)中除去殘留的有機溶劑的純化方法，該方法包含以下步驟將所述的否則是純的肽溶解在含有水和至少一種選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇的醇的溶解溶劑混合物中；-將該否則是純的肽在所述的溶劑混合物中的溶液加到劇烈攪拌的沉淀溶劑混合物中，該溶劑混合物由一種或多種極性化合物和一種或多種非極性化合物，和任選的高達5％的乙酸或丙酸構成，所述極性化合物選自乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、異丙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯，所述非極性化合物選自己烷、庚烷、辛烷、環己烷、甲基環己烷；-分離沉淀的肽；-用一種所述的極性化合物或該極性化合物的混合物，或相似極性的溶劑或溶劑混合物洗滌該分離的肽；-干燥該洗滌過的肽，條件是，所述的含有水和至少一種醇的溶劑混合物的水含量低于8％(v/v)，溶解溶劑混合物和沉淀溶劑混合物的體積比為1∶10或更高。
術語“否則是純的肽”指對于藥物應用是非常純的肽，只是其揮發性的雜質需要除去或其含量需要顯著地降低。該否則是純的肽一般是已經經過色譜純化的物質。
優選地，該否則是純的肽是Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(I).
按照本發明的第一優選方面，溶解溶劑混合物的水含量低于5％(v/v)。
按照本發明的第二優選方面，溶解溶劑混合物和沉淀溶劑混合物的體積比為至少15，特別是至少20。
按照本發明的第三優選方面，溶解溶劑混合物的醇是乙醇。
按照本發明的第四優選方面，沉淀溶劑混合物的極性組分是乙酸乙酯。
按照本發明的第五優選方面，沉淀溶劑混合物的非極性組分是庚烷。
以下本發明將通過參照其優選的實施方案更詳細地敘述，但這不應該被理解為對本發明的限制。
優選實施方案的敘述實施例1用制備型HPLC將合成產物純化所得到的含純化合物(1)(共100克)在乙醇-水-乙酸(40∶59∶1，v/v/v)中的級份收集起來并真空濃縮，所產生的油狀產物用乙醇共蒸發兩次。產生的固體溶解在440毫升乙醇中，所得到的澄清溶液在20分鐘時間內加入8.8升乙酸乙酯/庚烷1∶1(v/v)中。繼續攪拌1小時，過濾。無定形產物用3升乙酸乙酯洗滌；發現這一步除去了幾乎全部的庚烷。洗滌過的產物在真空烘箱中40℃在0.3巴干燥48小時。干燥產物的元素分析表明得到了(I)的單乙酸酯。相反，冷沉淀產生相應的二乙酸酯。在下表中，按照本發明產生的單乙酸酯的分析參數與相應的冷凍干燥產物(二乙酸酯)的分析參數做比較。
表.所有的百分數都是重量百分數
實施例2改變沉淀溶劑或溶劑混合物的組成；其它方面和實施例1的程序相同。在純乙酸乙酯中沉淀造成約3-5重量％的肽損失。在純庚烷中沉淀造成粘性產物，難以過濾。乙酸乙酯-己烷(1∶1，v/v)混合物給出的產物容易過濾和干燥；在重復實驗中肽的損失總低于0.5重量％。
實施例3改變在溶解溶劑(絕對乙醇)中油性產物的溶液的水含量；其它按照實施例1的程序。10％(v/v)的水含量在沉淀時產生粘性產物，難以過濾。15％(v/v)的水含量在沉淀時產生油性產物。為了得到滿意的結果，水含量必須不超過8％(v/v)，最好應該保持在5％(v/v)以下。低于5％的水含量可以通過將從色譜得到的油性產物—乙醇共蒸發兩次達到。
實施例4改變沉淀的溫度；其它方面按照實施例1。沉淀溫度證明不是關鍵性的。可從0℃改變到20℃而在產物的產率和形態上沒有可察覺的不同。
實施例5改變(I)在溶解溶劑中的濃度；其它方面按照實施例1。發現，從色譜得到又經過用乙醇共蒸發兩次的油性產物在溶解溶劑中的濃度應該盡可能高。甚至可以使用330克(重量)的濃度。
實施例6改變溶解溶劑和沉淀溶劑之間的比；其它方面按照實施例1。發現最佳的比為約1∶20。從1∶15到1∶30的比都可給出滿意的結果。1∶10的比產生粘性的產物。沉淀過程是非常快的。可以在溶解的物質最后加入的30分鐘以后過濾虛浮液。用乙酸乙酯洗滌不會造成產物的損失，但能有效除去庚烷。
權利要求
1.一種從否則是純的九肽或十肽中除去殘留的有機溶劑的純化方法，所述方法包含以下步驟-將所述的九肽或十肽溶解在溶解溶劑混合物中，該混合物含有水和至少一種選自甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇的醇；-將九肽或十肽在所述溶劑混合物中的溶液加到劇烈攪拌的沉淀溶劑混合物中，該溶劑混合物基本上由一種或多種極性化合物和一種或多種非極性化合物和任選地高達5％的乙酸或丙酸構成，所述極性化合物選自乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、異丙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、乙酸叔丁酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸異丙酯，所述非極性化合物選自己烷、庚烷、辛烷、環己烷、甲基環己烷；-分離沉淀的九肽或十肽；-用一種所述的極性化合物或所述的極性化合物的混合物，或者類似極性的溶劑或溶劑混合物洗滌該分離的九肽或十肽；-干燥該洗滌過的九肽或十肽，條件是，所述含有水和至少一種醇的溶劑混合物的水含量低于8％(v/v)，所述溶解溶劑混合物和所述沉淀溶劑混合物的體積比是1∶10或更高。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有水和至少一種醇的溶劑混合物的水含量低于5％(v/v)。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述九肽或十肽是LHRH拮抗劑。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述九肽或十肽是Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(I)。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(I)是以單乙酸酯的形式得到的。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解溶劑混合物的水含量低于5％(v/v)。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解溶劑和沉淀溶劑的體積比為至少15。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶解溶劑混合物中的醇是乙醇。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀溶劑混合物中的極性組分是乙酸乙酯。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀溶劑混合物中的非極性組分是庚烷。
11.Ac-D-2NaI-D-4ClPhe-D-3Pal-Ser-MeTyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2的單乙酸酯。
全文摘要
九肽或十肽從殘留的有機溶劑中純化，辦法是通過將其溶解在含有水和至少一種C1－C3醇的溶劑中，接著加入劇烈攪拌的由羧酸烷基酯(包含3－6個碳原子)和一種或多種非極性化合物(選自己烷、庚烷、辛烷、環己烷、甲基環己烷)和任選地高達5％的乙酸或丙酸構成的溶劑中進行沉淀，分離沉淀的九肽或十肽，接著用C3－C5酯的混合物洗滌并干燥，條件是含有水和至少一種醇的溶劑的水含量低于8％(v/v)，溶解溶劑混合物和沉淀溶劑混合物的體積比為1∶10或更高。還敘述了Ac－D－2NaI－D－4ClPhe－D－3Pal－Ser－MeTyr－D－Asn－Leu－Lys(iPr)－Pro－D－Ala－NH
文檔編號C07K1/30GK1625561SQ02828348
公開日2005年6月8日 申請日期2002年12月23日 優先權日2001年12月29日
發明者J·H·拉斯姆森, P·H·拉斯姆森 申請人:多肽實驗室聯合股份有限公司