專利名稱：疏水相互作用色譜法的制作方法
疏水相互作用色譜法本文中報道了通過用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液從色譜材料洗脫多肽的純化包含組氨酸標簽的多肽的疏水相互作用色譜法。
背景技術：
蛋白質在當今的醫療中發揮重要作用。現有技術中熟知生產重組多肽的表達系統。用于藥物應用的多肽主要是在原核細胞例如大腸桿菌，以及真核細胞，例如CHO細胞、NSO細胞、Sp2/0細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6 細胞等中生產的。對于人類應用，每種藥用物質必須符合不同的標準。為確保生物藥劑對人類的安全性，例如，必須去除可導致嚴重傷害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白質。為達到監管規格，在制造過程后必須有一個或多個純化步驟。其中，純度、通量和產量在確定適當的純化過程中起重要作用。不同的方法已經完全建立并廣泛用于蛋白質純化，例如使用微生物蛋白質的親和 色譜(例如蛋白A或蛋白G親和色譜)、離子交換色譜(例如陽離子交換(磺丙基或羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式離子交換)、親硫吸附(例如用β_巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附色譜(例如用苯基-瓊脂、aza-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和色譜(例如用Ni(II)和Cu(II)親和材料)、大小排阻色譜，和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細管電泳)(參見例如Vijayalakshmi,M. A. Appl.Biochem. Biotech. 75(1998)93-102)。Mateo, C.等人報道了多組氨酸標記的酶的親和色譜(J. Chrom. 915(2001)97-106)。在 WO 02/37100 中報道了次氮基三乙酸鎳(NI-NTA)樹脂的新應用。在WO 2005/035092中報道了純化組氨酸標記的蛋白質的方法和試劑盒。在WO98/06739中報道了純化重組蛋白質的方法。在WO 94/07912中報道了涉及氨基酸模擬物作為洗脫劑的親和純化方法。在US2004/0152076中用固定化金屬親和色譜分離核酸。在US6，005, 082中報道了因子VIII的純化方法。在US 2007/0037966中報道了因子VII多肽的疏水相互作用色譜純化。發明概述已發現可用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液從疏水相互作用色譜材料中回收包含組氨酸標簽的多肽。使用本文報道的方法，可避免包含有機溶劑，例如2-丙醇的回收溶液而不損失選擇性和產量。因此，本文中報道了用于獲得或純化包含組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟-將包含具有組氨酸標簽的多肽的第一溶液應用于疏水相互作用色譜材料，和-通過應用包含咪唑或咪唑衍生物的第二溶液，從疏水相互作用色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽，從而獲得或純化包含組氨酸標簽的多肽。本文中也報道了用于生產包含組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟-培養包含編碼包含組氨酸標簽的多肽的核酸的原核或真核細胞，
-從細胞或/和培養基回收包含組氨酸標簽的多肽，任選地以包涵體的形式，-任選地溶解和/或重折疊包含組氨酸標簽的多肽，-用疏水相互作用色譜方法純化溶解的和/或重折疊的包含組氨酸標簽的多肽，從而生產包含組氨酸標簽的多肽。在一個實施方式中疏水相互作用色譜材料包含附著了疏水配體的瓊脂糖的基質。在另一個實施方式中配體選自正_、異-或新脂肪族或寡亞烷基乙二醇。在進一步的實施方式中配體選自丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、聚(乙二醇)基和聚(丙二醇)基基團。在進一步的實施方式中配體是苯基配體，并且回收步驟中的第二溶液除了咪唑或咪唑衍生物，還包含2-丙醇。發明詳述本文中報道了以結合-洗脫模式操作的用于純化包含組氨酸標簽的多肽的可擴展的疏水相互作用色譜方法，其中用包含咪唑或咪唑衍生物，例如組氨酸的溶液從疏水相互作用色譜材料回收多肽。通過使用此洗脫系統，可以避免使用含有有機溶劑例如2-丙醇的洗脫緩沖液，而不損失選擇性和產量。術語“施用于”及其語法等價表示純化方法的部分步驟，其中將含有待純化的目標物質的溶液與固定相接觸。這表示a)溶液被加到固定相所在的色譜裝置，或b)固定相被加到包含目標物質的溶液。在a)中含有待純化的目標物質的溶液流過固定相,允許固定相和溶液中的物質間的相互作用。取決于條件，例如pH、電導率、鹽濃度、溫度和/或流速，溶液的一些物質與固定相結合，并因而從溶液中移除。其他物質留在溶液中。留在溶液中的物質可在流通液中找到。“流通液”指在通過色譜裝置后獲得的，與其來源無關的溶液。它可以是含有目標物質的施用的溶液，或用于沖洗柱或用于洗脫結合于固定相的一種或多種物質的緩沖液。在一個實施方式中色譜裝置是柱，或盒。通過本領域技術人員熟悉的方法，例如沉淀、鹽析、超濾、滲濾、凍干、親和色譜或減少溶劑體積進行純化步驟后，能夠從溶液回收目標物質，以獲得純化的或甚至基本上均質形式的目標物質。在b)中，將固定相，例如作為固體加入含有待純化的目標物質的溶液中，允許固定相或溶液中的物質之間的相互作用。在相互作用后，通過例如過濾移除固定相，目標物質結合于固定相并與之一同從溶液除去，或者目標物質不結合于固定相，留在溶液中。如本申請中所用的術語“緩沖的”表示其中由于酸性或堿性物質的加入或釋放導致的pH改變被緩沖物質拉平的溶液。可使用任何導致此類效應的緩沖物質。在一個實施方式中緩沖物質選自磷酸或其鹽、醋酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽、咪唑或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽或者三(羧甲基)甲胺(TRIS)或其鹽。在一個實施方式中緩沖物質選自咪唑或其鹽或者組氨酸或其鹽。任選地，緩沖的溶液也可包含額外的無機鹽。在一個實施方式中無機鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉和檸檬酸鉀。“多肽”是由被肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，無論是天然生產的或人工合成的。具有少于約20個氨基酸殘基的多肽可稱為“肽”，而由兩個或更多多肽組成，或包含一個多于100個氨基酸殘基的多肽的分子可稱為“蛋白質”。多肽也可包含非氨基酸組分，例如糖基、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可由其中表達多肽的細胞添加，并可隨細胞類型而改變。本文中以其氨基酸骨架結構或編碼其氨基酸骨架結構的核酸來限定多肽。添加物例如糖基通常不詳細說明，但可存在。術語“結合-洗脫模式”表示實施色譜純化方法的方式。本文中將含有待純化的目標多肽的溶液施用于固定相，特別是固體相，藉此目標多肽與固定相相互作用，并被保留在其上。非目標物質分別隨流通液或上清被移除。然后在第二步驟中通過使用洗脫溶液從固定相回收目標多肽。術語“單體形式的多肽”表示多肽未與第二個多肽分子締合，即多肽未與同種類或不同種類的另一多肽分子共價或非共價地結合。術語“聚集形式的多肽”表示共價或非共價地與至少一個額外的多肽結合，并以單峰的形式從大小排阻色譜柱洗脫的多肽。術語“單體形式”不一定表示100% (以大小排阻色譜確定)的多肽以單體的形式存在。它還表示多肽基本上是單體形式的，即至少90% (以大小排阻色譜確定)的多肽為單體的形式，或至少95% (以大小排阻色譜確定)的多肽為單體的形式，或至少98% (以大小排阻色譜確定)的多肽為單體的形式，或至少99% (以大小排阻色譜確定)的多肽為單體的形式，或者特別地多于99% (以大小排阻色譜確定)的多肽為單體的形式。術語“單體和聚集形式”表示未與其他多肽分子締合的多肽分子和與其他多肽分子締合的多肽分子的混合物。在此 混合物中，單體形式和聚集形式都不唯一地存在。術語“包涵體”表示聚集的目標多肽的致密的細胞內團，它組成總細胞蛋白質的重要部分，包括原核細胞的全部細胞組分。術語“變性的”表示其中具有非天然二級、三級和/或四級結構的多肽的形式。處于此非天然形式的多肽可為可溶的但伴隨地處于生物失活構象。或者多肽可為不可溶的，并處于生物失活構象，具有例如錯配的或未形成的二硫鍵。此不可溶多肽可以，但不一定包含于包涵體內。術語“重折疊的”表示從變性形式獲得的多肽。通常，重折疊的目標是生產與沒有重折疊步驟生產的蛋白質相比，具有更高水平的活性的蛋白質。折疊的蛋白質分子在處于具有最低自由能的構象時是最穩定的。大部分水溶性蛋白質以大部分疏水性氨基酸位于分子內部，遠離水的方式折疊。維持蛋白質結合的弱鍵能夠被多種導致多肽解折疊(即變性)的處理破壞。折疊的蛋白質是氨基酸本身及其環境之間的多種類型的相互作用(包括離子鍵、范德華相互作用、氫鍵、二硫鍵和共價鍵)的產物。如本文所用的術語“變性的”或“使變性的”指其中存在于天然或重折疊狀態的分子中的離子鍵和共價鍵以及范德華相互作用被破壞的多肽。多肽的變性可通過例如用8M尿素、還原劑例如巰基乙醇、熱、pH、溫度和其他化學物處理完成。試劑例如SM尿素破壞氫鍵和疏水鍵，并且如果也加入了巰基乙醇，在半胱氨酸之間形成的二硫橋(S-S)被還原為兩個-S-H基團。在其天然或重折疊狀態下含有二硫鍵的多肽的重折疊也可涉及存在于蛋白質的半胱氨酸殘基的-S-H基團的氧化，以重新形成二硫鍵。通常，在多肽的多步驟純化順序中疏水相互作用色譜的位置是可變的。已經完全建立并廣泛使用純化多肽的方法。它們被單獨或組合使用。此類方法是例如使用具有復合的金屬離子(例如使用Ni (II)-和Cu (II)-親和材料)的硫醇配體或源自微生物的蛋白質(例如蛋白A或蛋白G親和色譜)的親和色譜、離子交換色譜(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換色譜)、親硫吸附(例如使用β -巰基乙醇和其他SH配體)、疏水相互作用或芳香族吸附色譜(例如使用苯基瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或m_氨基苯基硼酸)、大小排阻色譜和制備電泳方法(例如凝膠電泳、毛細管電泳)。免疫球蛋白的純化過程通常包括多步驟色譜部分。在第一個步驟中，通過親和色譜(例如用蛋白A)從免疫球蛋白級分分離非免疫球蛋白多肽和蛋白質。然后可進行離子交換色譜以分離(disunite)各個免疫球蛋白類并移除從第一柱共洗脫的痕量的蛋白A。最后第三個色譜步驟是分離同類的免疫球蛋白單體和多聚體及片段所必須的。有時聚集物的量高(5%或更多)而不能在第三個純化步驟有效分離它們，使得進一步的純化步驟是必要的。發現可用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液從疏水相互作用色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽。此發現非常令人驚訝，因為咪唑或咪唑衍生物通常用于從金屬親和色譜材料而不是從疏水相互作用色譜材料回收組氨酸標記的多肽。通過使用金屬親和色譜材料不能區分正確折疊的、聚集的、部分折疊的和解折疊的多肽形式，因為全部這些不同形式包含 組氨酸標簽，并與金屬親和色譜材料結合。然而，已經發現通過使用疏水相互作用色譜材料能分辨這些密切相關的多肽形式。同時，此色譜材料具有足夠的結合能力用于工業生產規模的分離。因此，本文中報道的第一方面是純化具有組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟-將包含具有組氨酸標簽的多肽的溶液施用于疏水相互作用色譜材料，和-用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液回收包含組氨酸標簽的多肽并從而純化包含組氨酸標簽的多肽。由于咪唑或咪唑衍生物被用于回收結合的多肽，施用于疏水相互作用色譜材料的包含多肽的溶液不含咪唑或任何咪唑衍生物。用含有咪唑或咪唑衍生物的溶液回收保留在疏水相互作用色譜材料上的多肽。此方法以結合-洗脫模式操作，即首先將包含組氨酸標簽的多肽結合到疏水相互作用色譜材料，并然后在進一步的步驟中，從疏水相互作用色譜材料回收多肽。間歇的洗滌步驟可被包括于如本文報道的方法中。在這些洗滌步驟中，施用的一種或多種溶液不含咪唑或咪唑衍生物。在本文報道的方法中，除了用于從疏水相互作用色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽的溶液以外，所有溶液都不含，即不含有咪唑或咪唑衍生物。在一個實施方式中包含咪唑或咪唑衍生物的溶液是水溶液。在進一步的實施方式中包含咪唑或咪唑衍生物的溶液不包含，即不含有機溶劑和/或脂肪醇。在進一步的實施方式中包含咪唑或咪唑衍生物的溶液由水、咪唑或咪唑衍生物、緩沖物質，以及任選地一種或兩種或三種無機鹽組成。術語“咪唑或咪唑衍生物”表示選自咪唑、取代的咪唑、組氨酸和組氨酸衍生物的化合物。在一個實施方式中咪唑或咪唑衍生物選自咪唑和組氨酸。在一個實施方式中疏水相互作用色譜材料包含已與其共價連接疏水配體的瓊脂糖基質。在進一步的實施方式中配體是正_、異-或新-脂肪族配體，或寡(亞烷基乙二醇)配體。在進一步的實施方式中配體選自丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、聚(乙二醇)基和聚(丙二醇)基配體。在一個實施方式中配體是聚(丙二醇)配體。在另一個實施方式中配體是苯基配體,并且回收步驟中的溶液還包含2-丙醇。術語“包含組氨酸標簽”或“組氨酸標記的”表示在多肽的C末端或N末端存在組氨酸殘基的連續序列。組氨酸標簽可直接位于相應的末端或在相應末端的最大多至10個殘基內。組氨酸標簽中的組氨酸殘基的數量是從3個殘基到多至10個殘基，即3、或4、或
5、或6、或7、或8、或9、或10個殘基。在一個實施方式中組氨酸殘基的數量是從4個殘基到多至8個殘基。在本文報道的方面的一個實施方式中，純化或獲得包含組氨酸標簽的多肽的方法包括以下步驟-將第一溶液施用于疏水相互作用色譜材料以生產條件(conditioned)疏水相互作用色譜材料，-將包含含有組氨酸標簽的多肽的第二溶液施用于條件疏水相互作用色譜材料，-任選地將第三溶液施用于疏水相互作用色譜材料，
-用包含咪唑或咪唑衍生物的第四溶液從疏水相互作用色譜材料回收并從而純化或獲得多肽。第一至第三溶液不含咪唑或任何咪唑衍生物。可以在真核和原核細胞，例如CHO細胞、HEK細胞和大腸桿菌中重組生產包含組氨酸標簽的多肽。如果多肽是在原核細胞中生產的，通常以不可溶的包涵體的形式獲得多肽。包涵體可容易地從原核細胞和培養基回收。在純化和/或重折疊步驟進行前，必須使在包涵體中獲得的不可溶形式的多肽溶解。通常金屬親和色譜不能區分例如在溶解和/或重折疊后得到的溶液中含有的正確折疊的、聚集的、部分折疊的和解折疊的多肽形式。這是因為不同多肽形式都包含負責與金屬親和色譜材料的相互作用的組氨酸標簽。已發現當使用含有咪唑或咪唑衍生物的溶液用于回收時，疏水相互作用色譜材料能分離這些不同但密切相關的多肽形式。此發現是絕對出乎意料的，因為咪唑和咪唑衍生物通常用于從螯合色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽。用缺少組氨酸標簽的多肽的對照表明咪唑誘導的回收作用對于包含組氨酸標簽的多肽是特異性的。因此，本文中報道的第二方面是用于生產包含組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟-培養包含編碼含有組氨酸標簽的多肽的核酸的原核或真核細胞，-從原核或真核細胞或/和培養基回收包含組氨酸標簽的多肽，在原核細胞的情況下任選地為包涵體的形式，-任選地溶解和/或重折疊包含組氨酸標簽的多肽，-用如本文報道的疏水相互作用色譜方法純化包含組氨酸標簽的多肽，并從而生產包含組氨酸標簽的多肽。在一個實施方式中疏水相互作用色譜方法包括以下步驟-將第一溶液施用于疏水相互作用色譜材料以生產條件疏水相互作用色譜材料，-將包含含有組氨酸標簽的多肽的第二溶液施用于條件疏水相互作用色譜材料，-任選地將第三溶液施用于疏水相互作用色譜材料，-用包含咪唑或咪唑衍生物的第四溶液從疏水相互作用色譜材料回收并從而獲得多肽，其中第一至第三溶液不含咪唑或任何咪唑衍生物。在以下不同的實施方式中呈現如上報道的全部方面。
在一個實施方式中，第一溶液包含第一緩沖物質，第二溶液包含第二緩沖物質，第三溶液包含第三緩沖物質，第四溶液包含第四緩沖物質，其中第四緩沖物質是咪唑或咪唑衍生物，條件是至少第二緩沖物質和第三緩沖物質和第四緩沖物質都是不同的緩沖物質。在一個實施方式中第一溶液和/或第二溶液和/或第三溶液不含咪唑和咪唑衍生物。在另一個實施方式中，第一溶液的上樣是3至20倍柱體積。在另一個實施方式中，施用3至10倍柱體積的第一溶液。在一個實施方式中，施用I至10倍柱體積的第二溶液。在另一個實施方式中，施用I至10倍柱體積的第三溶液。在第一步中用緩沖的溶液調節疏水相互作用色譜材料。此溶液不包含咪唑或咪唑衍生物。條件作用，第一緩沖溶液的緩沖物質可與包含含有組氨酸標簽的多肽的第二溶液的緩沖物質相同或不同。然后將包含含有組氨酸標簽的多肽的第二溶液施用于條件疏水相互作用色譜材料。在此步驟中，包含組氨酸標簽的多肽保留在疏水相互作用色譜材料上。此溶液不包含咪唑或咪唑衍生物。上樣(即第二)緩沖溶液的緩沖物質可與第三溶液的緩沖物質相同或不同。
在將包含組氨酸標簽的多肽上樣至色譜材料后，任選地，可對上樣的疏水相互作用色譜材料施用洗滌(即第三)溶液。此溶液不包含咪唑或咪唑衍生物。最后，為從疏水相互作用色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽，將包含咪唑或咪唑衍生物的回收(即第四)溶液施用于色譜材料。在一個實施方式中，純化或獲得包含組氨酸標簽的多肽的方法是柱色譜方法。在不同的步驟中，施用于疏水相互作用色譜材料的體積彼此獨立地是從3至20倍柱體積，在一個實施方式中是從4至10倍柱體積。在一個實施方式中,第一溶液的電導率與包含含有組氨酸標簽的多肽的第二溶液的電導率和/或第三溶液的電導率和/或第四溶液的電導率相同或更高。如本文報道的方法中的溶液的pH值是從pH5至pH8。如本文報道的方法在實施例中用胰島素樣生長因子I和組氨酸標簽的綴合物示例。其制備在WO 2008/025527中報道(以引文合并入本文)。呈現的數據只為示例本方法，并不應被視為本發明的限制。提供以下實施例和附圖供以理解本發明，本發明的實際范圍在所附權利要求書中限定。應當理解，可以在不離開本發明的精神的情況下對所述步驟進行修改。


圖I用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM咪唑通過10倍柱體積的至100%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖組合的峰級分的分析HPLC色譜圖。圖2用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM咪唑通過10倍柱體積的至50%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖組合的峰級分的分析HPLC色譜圖。圖3用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM咪唑通過至100%洗脫緩沖液的分級洗脫來洗脫；小圖組合的峰級分的分析HPLC。
圖4用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用IOOmM組氨酸通過20倍柱體積的至100%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖組合的峰級分的分析HPLC色譜圖。圖5用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM組氨酸通過20倍柱體積的至100%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖組合的峰級分的分析HPLC。圖6用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(丁基配體)洗脫色譜圖，用20mM咪唑通過10倍柱體積的至50%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖峰級分的分析HPLC色譜圖。圖7用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM磷酸鉀緩沖液通過10倍柱體積的至50%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫，；小圖 流通液級分的分析HPLC色譜圖。圖8用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(苯基配體)洗脫色譜圖，用5mM咪唑通過10倍柱體積的至50%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖峰級分的分析HPLC色譜圖。圖9用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用I. SM氯化鈉通過30倍柱體積的至100%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫；小圖組合的峰級分的分析HPLC色譜圖。圖10用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM咪唑通過10倍柱體積的至50%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫。圖11用于本文報道的方法的總疏水相互作用材料(聚(丙二醇)配體)洗脫色譜圖，用20mM磷酸鉀通過20倍柱體積的至100%洗脫緩沖液的線性梯度洗脫。實施例I材料和方法除非另有說明，不同色譜方法根據色譜材料制造商的說明進行。重組DNA技術用標準方法操作DNA,如 Sambrook, J.等人，Molecular cloning Alaboratorymanual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York,1989 所述。根據制造商的說明使用分子生物學試劑。蛋白質確定蛋白質濃度是通過確定280nm處的光密度(OD)，以320nm為參考波長，使用基于氨基酸序列計算的摩爾消光系數確定的。大小排阻HPLC :色譜是用Tosoh Haas TSK 3000SWXL 柱在 ASI-100HPLC 系統(Dionex，德國Idstein)上進行的。在280nm通過UV 二極管陣列探測器(Dionex)監測洗脫峰。在將濃縮的樣品溶解到lmg/ml后，用由200mM磷酸二氫鉀和250nM氯化鉀組成的，pH7. O的緩沖液洗滌柱，直到達到穩定的基線。分析運行是在等度條件下用0. 5ml/min的流速在室溫下進行30min。使用Chromeleon (Dionex,德國Idstein)人工整合色譜圖。反相HPLC (RP-HPLC)
通過RP-HPLC分析純度。使用乙腈/水性TFA梯度在PhenomenexC18柱上進行測定。以215nm處的UV吸收監測洗脫譜。基于洗脫的蛋白質的總峰面積計算洗脫的物質的百分比。DNA閾值系統參見例如Merrick, H.,和 Hawlitschek, G. , Biotech Forum Europe9(1992)398-403 ο宿主細胞蛋白質確定用血清白蛋白和鏈霉親和素的混合物包被微量滴定板的孔壁。將源自山羊的抗HCP多克隆抗體結合到微量滴定板的孔壁。在洗滌步驟后，用不同濃度的HCP校準序列和樣品溶液孵育微量滴定板的不同孔。在孵育后，通過用緩沖溶液洗滌來移除未結合的樣品材料。為檢測，用抗體過氧化物酶綴合物孵育孔，以檢測結合的宿主細胞蛋白質。通過與ABTS 溫育并在405nm檢測，來檢測固定的過氧化物酶活性。DNA 確定將生物素結合到微量滴定板。加入鏈霉親和素、單鏈DNA和生物素化的單鏈DNA結合蛋白的反應混合物。結合蛋白能結合DNA，并被生物素化。用這種方式能特異性地從樣品混合物移除DNA。鏈霉親和素結合微量滴定板上的生物素以及與單鏈DNA結合蛋白偶聯的生物素。向此總復合物加入與脲酶偶聯的DNA特異性抗體。加入尿素導致尿素水解，引起PH的局部變化。能夠以改變的表面電勢檢測到此變化。表面電勢的變化與結合的DNA的量成比例。通過蛋白酶K消化和用SDS變性獲得單鏈DNA。用于來自包含體的多肽的分離、溶解和重折疊的一般方法除了引用的文獻中進行的方法，例如能夠根據Rudolph等人的方法進行包涵體的制備(Rudolph,R.等人,Folding Proteins, In :Τ· E. Creighton(編)Protein function A Practical Approach, 57-99 (1997))。包涵體儲存于-70°C。包涵體的溶解可類似地根據Rudolph 等人的方法進行(Rudolph,R.等人,Folding Proteins, In :Τ· Ε· Creighton(編)Protein function APractical Approach(1997)57-99)。實施例2在疏水相互作用色譜柱上用咪唑洗脫，純化組氨酸標記的IGF-I樹脂TOYOPEARL Polypropylenglycol-600 ； TOYOPEARL PPG-600M(TosohBioscienc, Stuttgart,德國)上樣a)118mg多肽b) 1034mg 多肽c) 1034mg 多妝柱尺寸a) 13cm高，Ilml床體積b) 22cm 高，108ml 床體積c) 22cm 高，108ml 床體積平衡緩沖液/ 第一溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl, pH 3. 5洗滌緩沖液I/ 第二溶液1M TRIS-HCl，0· 15Μ NaCl，pH 3. 5洗滌緩沖液2/ 第三溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl, pH 3. 5洗脫緩沖液/第四緩沖液20mM咪唑，pH 9. 7
洗脫方法a)線性梯度至100%洗脫緩沖液，20倍柱體積b)線性梯度至50%洗脫緩沖液，10倍柱體積c)分級洗脫至100%洗脫緩沖液結果如圖I至圖3所示，用三種使用的洗脫方法中任一種，能夠從聚(丙二醇)疏水相互作用色譜材料回收組氨酸標記的IGF-I分子。實施例3在疏水相互作用色譜柱上用組氨酸洗脫，純化組氨酸標記的IGF-I樹脂TOYOPEARL Polypropylenglycol-600 ； TOYOPEARL PPG-600M (TosohBioscienc, Stuttgart,德國) 上樣123mg多肽柱尺寸13cm高，Ilml床體積平衡緩沖液/ 第一溶液20mM ΚΗ2Ρ04，0· 8Μ NaCl，pH 3. 5洗滌緩沖液I/ 第二溶液1M TRIS-HCl，O. 15M NaCl，pH 3. 5洗滌緩沖液2/ 第三溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl，pH 3. 5洗脫緩沖液/第四緩沖液a) IOOmM組氨酸，pH 9. 7b) 20mM 組氨酸，pH 9. 7洗脫方法線性梯度至100%洗脫緩沖液，20倍柱體積結果如圖4至圖5所示，用兩種使用的洗脫方法中任一種，能夠從聚(丙二醇)疏水相互作用色譜材料回收組氨酸標記的IGF-I分子。實施例4在疏水相互作用色譜柱上用咪唑洗脫，純化組氨酸標記的IGF-I樹脂CaptoTMButyl (GE Healthcare, Uppsala,瑞典)上樣104mg多肽柱尺寸13. 5cm高，10. 7ml床體積平衡緩沖液/ 第一溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl，pH 3. 5洗滌緩沖液I/ 第二溶液1M TRIS-HCl，0· 35Μ NaCl，20mM 檸檬酸，pH 3. 5洗滌緩沖液2/ 第三溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl，pH 3. 5洗脫緩沖液/第四緩沖液20mM咪唑，pH 9. 7洗脫方法線性梯度至50%洗脫緩沖液，10倍柱體積結果如圖6所示，用洗脫緩沖液能夠從丁基疏水相互作用色譜材料回收組氨酸標記的IGF-I。實施例5比較性實施例——在疏水相互作用色譜柱上用磷酸鹽洗脫，純化組氨酸標記的IGF-I樹脂TOYOPEAR.L Ether_650M (Tosoh Bioscience, Stuttgart,德國)上樣102mg多肽
平衡緩沖液/ 第一溶液20mM KH2P04, IM NaCl，pH 7. O洗滌緩沖液1/ 第二溶液20mM KH2P04, IM NaCl, pH 7. O洗脫緩沖液/第四緩沖液20mM KH2P04, pH 7. O洗脫方法分級洗脫至100%洗脫緩沖液結果如圖7所示，只用含有磷酸鹽的緩沖液不能從醚疏水相互作用色譜材料回收組氨酸標記的IGF-I。實施例6比較性實施例一在疏水相互作用色譜柱上用不同洗脫，純化組氨酸標記的IGF-I樹脂a)PhenylSepharoseTM(GE Healthcare, Uppsala,瑞典)b) TOY()PEARL PPG-600M(Tosoh Bioscience, Stuttgart，德國)上樣80mg多肽柱尺寸14cm高，Ilml床體積平衡緩沖液/ 第一溶液a)20mM ΚΗ2Ρ04，0· 8Μ NaCl，pH 3. 5b)20mM KH2P04,1. 5M NaCl，pH 3. 5洗滌緩沖液1/ 第二溶液a) IM TRIS_HC1，0. 35M NaCl，20mM 檸檬酸，pH 3. 5b)-洗滌緩沖液2/ 第三溶液a)20mM ΚΗ2Ρ04，0· 8Μ NaCl，pH 3. 5b)20mM KH2P04,1. 5M NaCl, pH 3. 5洗脫緩沖液/第四緩沖液a) 5mM咪唑，20% (v/v)2-丙醇，pH 7.0b) 1. 5M NaCl, 20% (v/v)2-丙醇，pH 3.5洗脫方法a)線性梯度至50%洗脫緩沖液，10倍柱體積b)線性梯度至100%洗脫緩沖液,30倍柱體積結果如圖8所示,能夠用含有咪唑和2-丙醇的洗脫緩沖液從phenylSepharoseTM疏水相互作用色譜材料以尖銳的峰回收組氨酸標記的IGF-1。這不能用不含咪唑的洗脫緩沖液實現(見圖9)。實施例7比較性實施例——在疏水相互作用色譜柱上用咪唑洗脫，純化組氨酸標記的IGF-I樹脂CaptoTMPhenyl (GE Healthcare, Uppsala,瑞典)上樣117mg多肽柱尺寸13. 5cm高，10. 7ml床體積平衡緩沖液/ 第一溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl, pH 3. 5洗滌緩沖液1/ 第二溶液1M TRIS-HCl，O. 35M NaCl，20mM 檸檬酸，pH 3. 5洗滌緩沖液2/ 第三溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl，pH 3. 5洗脫緩沖液/第四溶液20mM咪唑，pH 9. 7洗脫方法線性梯度至50%洗脫緩沖液，10倍柱體積
結果如圖10所示，不能用洗脫緩沖液從苯基疏水相互作用色譜材料回收組氨酸標記的 IGF-I。實施例8比較性實施例——在疏水相互作用色譜柱上用咪唑洗脫，純化Herceptin 將培養上清液調整到pH3. 5和O. 8mol/l的NaCl濃度，并在施用于疏水相互作用色譜材料前濾過 Sartobran P 濾器。樹脂TOYOPEARL Polypropylenglycol-600 ；TOYOPEARJL PPG-600M (Tosoh Bioscience, Stuttgart,德國)上樣189mg多肽柱尺寸16cm高，12. 6ml床體積平衡緩沖液/ 第一溶液20mM KH2P04,0. 8M NaCl, pH 3. 5洗滌緩沖液I/ 第二溶液1M TRIS-HCl，0· 35Μ NaCl，20mM 檸檬酸，pH 3. 5洗脫緩沖液/第四溶液a) 20mM咪唑，pH 9. 7b)20mM KH2P04, pH 8. 9洗脫方法a)線性梯度至50%洗脫緩沖液，10倍柱體積b)線性梯度至100%洗脫緩沖液,20倍柱體積結果可在通過咪唑洗脫的流通液中發現部分Herceptin 。在洗脫開始時能以小峰從柱回收其他級分。與此相反，如圖11所示，通過用磷酸鹽緩沖的溶液洗脫，可獲得尖銳峰的Herceptin 。
權利要求
1.純化包含組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟 -將包含具有組氨酸標簽的多肽的溶液施用于疏水相互作用色譜材料，和-用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液從疏水相互作用色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽，并從而純化包含組氨酸標簽的多肽。
2.生產包含組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟 -培養原核或真核細胞，所述原核或真核細胞包含編碼含有組氨酸標簽的多肽的核酸， -從細胞和/或培養基回收包含組氨酸標簽的多肽， -用疏水相互作用色譜方法純化包含組氨酸標簽的多肽，所述方法包括以下步驟 -將包含具有組氨酸標簽的多肽的溶液施用于疏水相互作用色譜材料，和-用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液從疏水相互作用色譜材料回收包含組氨酸標簽的多肽，并從而生產包含組氨酸標簽的多肽。
3.根據前述權利要求的任一項的方法，所述方法特征在于疏水相互作用色譜材料包含已附著疏水配體的瓊脂糖基質。
4.根據權利要求3的方法，其特征在于配體是丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、聚(乙二醇)基和聚(丙二醇)基配體。
5.根據權利要求3的方法，其特征在于配體是苯基配體，并且回收步驟中的溶液還包含2-丙醇。
6.根據上述權利要求中任一項的方法，所述方法包括以下步驟 -將第一溶液施用于疏水相互作用色譜材料， -將包含含有組氨酸標簽的多肽的第二溶液施用于疏水相互作用色譜材料，和 -用包含咪唑或咪唑衍生物的第四溶液回收并從而生產或純化包含組氨酸標簽的多肽， 其中第一溶液包含第一緩沖物質，第二溶液包含第二緩沖物質，并且第四溶液包含第四緩沖物質，其中第四緩沖物質是咪唑或咪唑衍生物，并且其中第二緩沖物質和第四緩沖物質是不同的緩沖物質。
7.根據權利要求6的方法，所述方法特征在于在施用第二溶液后和回收之前包括以下步驟 -將第三溶液施用于疏水相互作用色譜材料， 其中第三溶液包含第三緩沖物質，其中第二緩沖物質，和第三緩沖物質和第四緩沖物質都是不同的緩沖物質。
全文摘要
本文報道了純化包含組氨酸標簽的多肽的方法，所述方法包括以下步驟i)將包含具有組氨酸標簽的多肽的溶液施用于疏水相互作用色譜材料，和ii)用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液回收包含組氨酸標簽的多肽，并從而純化包含組氨酸標簽的多肽，其中施用于疏水相互作用色譜材料的包含多肽的溶液不含咪唑或咪唑衍生物，并且吸附到疏水相互作用色譜材料的多肽是用包含咪唑或咪唑衍生物的溶液回收的。
文檔編號G01N30/02GK102893146SQ201180024701
公開日2013年1月23日 申請日期2011年5月17日 優先權日2010年5月19日
發明者R·法爾肯施泰因, N·菲爾勒, M·斯密達 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司