專利名稱：體內蛋白質合成的方法
技術領域：
本發明的相關技術甲硫氨酸是唯一已知的起始蛋白質合成的天然氨基酸[Lucas-Lenard,J.and F.Lipmann,Ann.Rev.Biochem.,40:409-448(1971)]。在原核生物中，氨基酸首先通過甲硫氨酰-tRNA合成酶連接到啟動子甲硫氨酸tRNA上面，然后由甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶進行甲酰基化。所得到的f-Met-tRNAfMet啟動在依賴啟動因子2(IF-2)的反應中的蛋白質合成。
大腸桿菌(E.coli)甲硫氨酸tRNA的氨基化依賴大腸桿菌甲硫氨酰-tRNA合成酶對甲硫氨酸反密碼子的識別[Schulman,L.H.and H.Pelka,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,80:6755-6759(1983)]。在該序列中的突變導致甲硫氨酸受體活性的損失，而且在某些情況下導致獲得了相應于被改變了的反密碼子序列的新的氨基酸受體活性[Schulman,L.H.and H.Pelka,Biochemistry,24:7309-7314(1985)；Schulman,L.H.and H.Pelka,Science,242:765-768(1988)；Schulman,L.H.and H.Pelka,Science,246:1595-1597(1989)；Schulman L.H.and H.Pelka,Nucleic AcidsRes.,in press(1990)]。
本發明概述本發明提供了在適宜的宿主細胞(例如，細菌，如大腸桿菌)中對除了甲硫氨酸以外的氨基酸起始的蛋白質(即終端氨基酸不是甲硫氨酸的蛋白質)的體內超級表達方法。在該方法中，宿主細胞被使用已知的方法(例如，轉化、轉染、感染)修飾，即引入了a)編碼所需生產的蛋白質并包括非甲硫氨酸的氨基酸的啟動密碼子的DNA；b)編碼含有相應的反密碼子(對于編碼所需生產的蛋白質的DNA的啟動密碼子而言)的突變的啟動子tRNA的DNA；c)編碼甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶的DNA。所得到的被修飾了的宿主細胞，被保持在適宜超級生產甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶(MTF)和適宜對編碼所需生產的蛋白質(該蛋白質的終端氨基酸不是甲硫氨酸)的DNA進行表達的條件下。結果是，以非甲硫氨酸的氨基酸開始的蛋白質被超級生產了。另外，還可以將編碼適宜的氨酰基tRNA合成酶(根據蛋白質的起始氨基酸來決定)的DNA引入或不引入到宿主細胞中并在其中進行超級生產。在本發明的具體的實施方案中，所生產的蛋白質是以纈氨酸、異亮氨酸、或苯丙氨酸起始的。本發明的方法可以用于生產帶有治療或診斷作用的蛋白質，例如，血紅蛋白和生長激素。根據本發明的方法生產的蛋白質也是本發明的一部分。
附圖的簡要說明

圖1A表示用于表達CAT報道基因和起始tRNA基因的質粒。用于克隆CAT基因和tRNA基因的位點都用箭頭指示。
圖1B顯示用于表達IF2、FMT或FMS-FMT基因(編碼FMT)和ValRS基因的質粒。垂直的箭頭指示用于對各種基因克隆化的pACD載體的位點。
圖2A表示在起始tRNA2fMet中突變的位點。所用的兩個突變tRNA是G34C36和G34，分別帶有GAC和GAU反密碼子，并且分別與纈氨酸和異亮氨酸氨酰基化。
圖2B表示所使用的CAT基因的起始區域。CAT2.5基因，也被稱為野生型基因，具有AUG作為起始密碼子，并且在第二和第五密碼子有改變，即通過事先去除較弱的次級起始位點而被改變。為此而建立的兩個突變被稱為CATV1.2.5和CAT11.2.5。這些突變的CAT基因帶有與CAT2.5相同的在第二和第五密碼子的改變，分別以GUC和AUC作為起始密碼子。
本發明的詳細描述本發明涉及對以非甲硫氨酸的氨基酸為起始氨基酸(即終端氨基)的體內生產蛋白質的方法。現在已經顯示了的是那些包括了非甲硫氨酸的氨基酸的蛋白質可以在宿主細胞中超級生產，宿主細胞中含有編碼所需生產的蛋白質的DNA，并且具有對非甲硫氨酸的氨基酸的起始密碼子(即非甲硫氨酸起始密碼子)，含有相應的反密碼子序列的突變的起始tRNA，編碼甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶(MTF)的DNA，其在宿主細胞中超級表達，以及含有或不含有對所生產的蛋白質為適宜的氨酰基tRNA合成酶進行編碼的DNA。在此所述的工作顯示，在MTF被超級表達(即其生產水平高于常規宿主細胞，含有一份MTF編碼基因)的宿主細胞中，以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質被超級表達。特別是，已經顯示了在MTF被超級表達的宿主細胞中以纈氨酸或異亮氨酸起始的蛋白質都被超級生產，對于以纈氨酸起始的蛋白質，只要在宿主細胞中也使適宜的氨酰基tRNA合成酶(ValRS)被表達，則其生產就可以獲得進一步的提高。
本申請在此描述的評價是關于對非甲硫氨酸的啟動密碼子進行閱讀的突變啟動子tRNA是否能夠對選擇的由非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質的生產以比野生型啟動子tRNA和其相應的野生型基因結合的形式而更高的水平來在活體中進行，以及其所得到的結果。此外，還描述了分別帶有GAC或GAU反密碼子的兩種突變啟動子tRNA和相應的帶有GUC或AUC起始密碼子的基因突變體。如本文所述，這些突變啟動子tRNA/選擇的基因突變的結合比野生型啟動子tRNA/野生型基因的結合產生更多的蛋白質。特別是，本申請人已經顯示了以纈氨酸或異亮氨酸起始的蛋白質在對MTF進行超級表達的大腸桿菌中結合或不結合適宜的氨酰基tRNA合成酶都可以被以增強水平生產。
本發明涉及以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質合成的體內生產方法，以及對以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質合成進行增強的(即稱為超級生產)生產的體內方法，其結果是蛋白質產物在其終端的氨基酸不是甲硫氨酸。氨基終端的氨基酸可以是其它的19種天然氨基酸中的任何一種。在具體的實施方案中，以異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸起始的蛋白質的生產被增強，分別得到終端氨基是異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸的蛋白質。本發明進一步涉及被超級生產的蛋白質，這些蛋白質在氨基終端含有的氨基酸不是甲硫氨酸(例如，是異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸)。此外，本發明涉及對那些一般對其生產宿主為毒性的蛋白質的體內生產方法。在具體的實施方案中，本發明的方法可以用于生產血紅蛋白(其氨基終端為纈氨酸)、人或豬生長激素(其氨基終端是纈氨酸)、或任何以纈氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸起始的蛋白質。
對氨基終端不是甲硫氨酸的蛋白質的體內增強生產方法按照下述進行將下述的物質引入適宜的宿主細胞，原核或真核細胞都可以a)編碼所需生產的蛋白質的DNA并包括非甲硫氨酸的氨基酸的啟動密碼子(即非甲硫氨酸啟動密碼子)；b)編碼含有相應的反密碼子序列的啟動子tRNA的DNA；c)編碼甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶(MTF)的DNA。在一個實施方案中，除了上述的a-c)之外，還向宿主細胞中引入了編碼適宜的氨酰基tRNA合成酶的DNA。編碼MTF的DNA用載體引入到宿主細胞中，載體是使MTF在受體中能被超級表達的載體。在MTF和適宜的氨酰基tRNA合成酶被在宿主細胞中表達的實施方案中，編碼MTF的DNA和編碼適宜的氨酰基tRNA合成酶的DNA是通過載體引入到宿主細胞中的，載體是可以使MTF和適宜的氨酰基tRNA合成酶都被以充足的水平表達的那些載體。所得到的被修飾的宿主細胞(即現在含有上述的a)和b)的DNA)，突變的啟動子tRNA，以及包括或不包括編碼適宜的氨基酸tRNA合成酶的DNA，都被保持在適宜MTF超級生產的條件下，這些條件還可以是對適宜的tRNA合成酶和所需產生的蛋白質的超級生產為適宜的條件。所得到的蛋白質利用已知的方法從細胞中獲得。
上述方法的結果不但實現了對以甲硫氨酸以外的氨基酸起始的蛋白質的生產，而且還使生產被提高(即獲得的所需蛋白質的數量高于在MTF或MTF和適宜的氨酰基tRNA合成酶沒有被超級表達時的數量)。在本文中，蛋白質的增強生產指的是所生產的蛋白質的水平比對照細胞的生產水平高至少兩倍，優選地高3倍，更優選地高5-6倍。對照細胞是同類的細胞，它們帶有野生型基因，具有編碼所需蛋白質的甲硫氨酸起始密碼子。
在本文中所述的具體實施方案中，當MTF自己或其與纈氨酰tRNA合成酶(ValRS)一起被超級表達時，以纈氨酸起始的所需蛋白質就被在適宜的宿主細胞中超級生產。在一個實施方案中，所需的蛋白質是血紅蛋白。在另一個實施方案中，被超級生產的所需的蛋白質是以異亮氨酸起始的，當MTF被超級生產時，其就被在適宜的宿主細胞(如大腸桿菌)中超級生產。
本發明由下面的實施例給予具體的描述，這些實施例都不是對本發明的任何限制。實施例材料和方法以下的實施例中使用了下述的材料和方法。質粒和菌株野生型和各種突變CAT報道基因和tRNAfMet基因被克隆到pRSVp質粒中[Li et al.,J.Biol.Chem.,271:1022-1028(1996)；圖1]。使用pACD質粒[Mangroo and RajBhandary,J.Biol.Chem.,270:12203-12209(1995)]進行對ValRS、IF2和MTF的超級生產。ValRS、IF2和FMT[編碼MTF和FMS-FMT基因(編碼肽基去甲酰基酶，該酶將甲酰基從蛋白質和MTF的N-終端去掉；Guillonet al.,J.Mol.Biol.,234:359-367(1992)]分別被克隆到EcoRⅠ、Notl、Ncol和Espl位點[Mangroo and RajBhandary,J.Biol.Chem.,270:12203-12209(1995)]。FMS-FMT基因超級生產的MTF比FMT基因單獨生產的多，并且用于對MTF和ValRS的共同超級生產。使用大腸桿菌CA274菌株(hfrH LacZ125am trpEam)作為這些質粒轉化的宿主細胞[Smith and Cells,Nature New Biol.,243:66-71(1973)]。突變發生突變發生和將突變的DNA亞克隆到pRSVp載體中都按照以前的描述進行[Seong and RajBhandary,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,84:3343-338(1987)；Varshney and RajBhandary,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,87:1586-1590(1990)]。為CAT和β-內酰胺酶活性檢測制備細胞提取物轉化的大腸桿菌在含有氨芐青霉素(100μm/ml)的2X YT培養基中以37℃培養過夜。過夜培養物被以50-100倍稀釋于新鮮的含有同樣抗生素的2X YT培養基后再培養4-6小時。細胞提取物按照所述[Varshney et al.,J.Biol.Chem.,266:18018-18024(1991)]進行，并用于測量CT和β-內酰胺酶活性。為了盡量避免在不同的轉化體中pRSVpCAT拷貝數目的變化的效應，對CAT的特異性活性轉換為在同樣提取物中β-內酰胺酶的特異性活性(Varshney et al.,1991b)。對CAT和β-內酰胺酶的免疫印跡分析含有0.2 U β-內酰胺酶的細胞提取物的等份試樣用來進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳和將蛋白質從凝膠轉移到immobilon轉移膜上都按照以前所述進行(Varshney et al.,J.Biol.Chem.,1991b)。免疫印跡分析中使用了Amersham Corp.的ECL試劑盒。對大腸桿菌ValRS基因的分離和克隆利用PCR方法將ValRS基因從大腸桿菌TGI染色體DNA中擴增出來。使用的引物的根據是公開的ValRS基因序列(Hartleinet al.,1987)，即CGGAATTCTGCGAAACAAGCTTTGCAGA和ATGAATTCTTTACCATTTTGTATAAGAGA。染色體DNA的制備按照以前所述進行(Wilson,1992)。用于PCR的混合物含有0.5μg基因組DNA,50 mM KCl,10 mM Tris-HCl,pH 9.0,0.1％TritonX-100,2.5 mM MgCl2,0.32 mM dNTP,50 pmol各種引物，以及1U Taq DNA聚合酶。擴增在Perkin-Elmer熱調節器中進行，一個循環培養，即95℃下5分鐘，55℃下40秒，72℃下4分鐘，然后進行30個循環培養，即94℃下1分鐘，55℃下40秒，72℃下4分鐘。混合物最后在72℃下培養10分鐘。約3.2 kbp的PCR產物用EcoRⅠ(VAlRS編碼序列不具有EcoRⅠ位點)酶解，并克隆到質粒pACD的EcoRⅠ位點(圖1)。在表達G34C36突變tRNA的細胞中的CAT活性；IF2,ValRS，MTF和ValRS及MTF的超級生產效果表中顯示的是在帶有突變啟動子tRNA基因和突變CAT基因的細胞中的相對CAT活性。有意思的是，在帶有G34G36突變啟動子tRNA基因和CATV1.2.5基因的細胞中的CAT活性高于(約1.6倍)帶有野生型CAT基因的細胞。在同一質粒上帶有CATV1.2.5基因和野生型啟動子tRNA基因的細胞中，其CAT活性是＜2％(數據未給出)。因此，對CATV1.2.5 mRNA的翻譯依賴于是否有相應的G34G36突變啟動子tRNA的存在。
纈酰基-tRNA合成酶(ValRS)、甲硫氨酰tRNA轉甲酰基酶(MTF)、或ValRS和MTF一起都導致帶有G34G36突變啟動子tRNA的細胞中的CAT活性的進一步提高(見表中)。在僅超級生產ValRS自身的細胞中，CAT活性稍有上升。在僅超級生產MTF的細胞中，CAT活性增加約2倍。在對ValRS和MTF都超級生產的細胞中，CAT活性進一步提高，所以其相對CAT活性比含有野生型CAT基因的細胞高5-6倍。對IF2的超級生產，只對帶有G34G36突變啟動子tRNA的細胞的CAT活性有很少的影響。
表IF2和MTF的超級生產對帶有G34G36和G34突變啟動子tRNA的細胞的相對CAT活性a的影響
顯示的相對CAT活性是從不同克隆的提取物和/或從相同的克隆的不同細胞的提取物中的平均值。
在帶有野生型CAT基因(CAT2.5)的細胞的提取物中的相對CAT活性，對野生型起始tRNA的超級生產定為100％。
對細胞提取物的免疫印跡分析確認了上述的結果，并顯示在各種提取物中CAT活性的升高的原因是CAT蛋白質的數量的升高。例如，當β-內酰胺酶這種在同一質粒中編碼的蛋白質的水平在所有各道都大約相同時，某些提取物中的CAT蛋白質就比其它的多，而且各條帶的相對強度與表中的相對CAT活性對應。ValRS、MTF、ValRS和MTF對體內G34G36突變起始tRNA的氨酰基化和甲酰基化的作用從表達G34G36突變起始tRNA的CA274轉化體中分離的總tRNA在酸性脲聚丙烯酰胺凝膠上分離。用Northern印跡雜交檢測到相應于脫酰基tRNA、氨酰基-tRNA和甲酰基氨酰基-tRNA的各種形式的突變tRNA[Varshney et al.,J.Biol.Chem.,266:24712-24718(1991)]。用內源性tRNATyr探針作為內部對照。在那些不超級生產ValRS或MTF的細胞中，大約50％的G34G36突變啟動子tRNA是Val-tRNA(57％)，并且只有約20％為fVal-tRNA[根據對數據的磷光分析(phosphorimager analysis)]。MTF的超級生產導致所有的Val-tRNA轉換為fVal-tRNA，而對ValRS和MT的超級生產導致幾乎完全的G34G36突變起始tRAN向fVal-tRNA的轉換。因此，對ValRS、MTF、ValRS和MTF的超級生產在一方面與細胞的CAT活性有直接的相關性，并且在另一方面與fVal-tRNA的水平有直接的相關性。
如前所述，內源性tRNATyr是在各種條件下基本上全部氨酰基化的[Varshney et al.,J.Biol.Chem.,266:24712-24718(1991)]。
在表達G34突變tRNA的細胞中的CAT活性用G34突變啟動子tRNA和CAT11.2.5報道基因進行類似的實驗。表中顯示，在表達該tRNA和CAT1.1.2.5基因的細胞的提取物中的CAT活性與表達野生型CAT基因的細胞相似。然而，對IF2或MTF的超級生產導致CAT活性分別提高2或3倍以上。因此，對U35A36和G34G36突變啟動子tRNA而言，G34突變啟動子tRNA與CAT1.1.2.5基因結合所產生的CAT蛋白質比野生型CAT基因和野生型啟動子tRNA基因的結合更多。對細胞提取物的免疫印跡分析結果也與CAT活性檢測的結果相吻合。對G34突變啟動予tRNA的酸性脲凝膠電泳分析的結果顯示在超級生產MTF的細胞中的fIle-tRNA的水平被明顯提高。這一點與表中顯示帶有G34突變啟動子tRNA和超級生產MTF的細胞的CAT活性的升高相吻合。然而，G34突變啟動子tRNA的相當部分(約60％)還是在體內沒有改變(根據對Northern印跡的磷光分析，數據未給出)，這就建議該tRNA對異亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)是比較差的底物。這些結果意味著，如果通過對IleRS和MTF的超級生產可以將tRNA完全轉換為fIle-tRNA，則在表達G34突變啟動子tRNA和超級生產MTF(見表)的細胞的325％相對CAT活性還可以進一步被提高。
在上述實施例中描述的工作顯示，帶有GUC和AUC起始密碼子的突變CAT基因，在有相應的突變啟動子tRNA存在的大腸桿菌中產生的CAT蛋白質比帶有AUG起始密碼子(見表)的CAT基因產生的更多。這些結果證明，與野生型CAT mRNA/野生型啟動子tRNA結合相比，突變CAT mRNA/突變啟動子tRNA結合所產生的CAT蛋白質更多是一種普遍現象，并且，以不是甲硫氨酸的氨基酸為N-終端的蛋白質可以在大腸桿菌中被超級生產。
體內提高CAT蛋白質生產的所需條件依賴于所使用的突變啟動子tRNA。(ⅰ)對于G34G36突變體，即被纈氨酸所氨酰基化的，IF2的超級生產沒有效果。然而，對ValRS和MTF的超級生產顯著地提高了對CAT蛋白質的合成(見表)。這是因為G34G36突變tRNA是ValRS的比較差的底物。而且，對MTF而言，被纈氨酸所氨酰基化的tRNA與被甲硫氨酸所氨酰基化的tRNA相比是比較差的底物[Giege et al.,FEBS Lett.,30:291-295(1973)；Guillon et al.,J.Bacteriol.,174:4294-4301(1992)]。結果是，對G34G36突變的體內fVal-tRNA水平相當低，大約為20％。對ValRS和MTF的超級生產將全部的G34G36 tRNA轉換為fVal-tRNA，并且提高CAT活性的水平。(ⅱ)對G34突變啟動子tRNA而言，即被異亮氨酸所氨酰基化的，在帶有該突變tRNA的細胞中的CAT活性被IF2或MTF的超級生產所提高。這種tRNA中的相當部分沒有改變。然而，IleRS與MTF一起的超級生產可以導致體內CT水平的進一步提高。(ⅲ)對U35A36突變tRNA，即在體內基本都被谷氨酸所氨酰基化并甲酰基化的，要提高CAT蛋白質合成就需要對MetRS或IF2的超級生產。我們對MetRS的超級生產的效果的解釋是，fGln-tRNA比fMet-tRNA的起始活性差，而且MetRS的超級生產導致該tRNA被甲硫氨酸部分氨酰基化，從而將其轉換為“更活性”的啟動子tRNA。相似地，IF2超級生產的效果的原因是fGln-tRNA對結合IF2為比較差的底物。對IF2的超級生產可能導致fGln-tRNA對IF2結合的增強，從而導致其在起始中的應用被提高。這樣，有多個因子影響在大腸桿菌中使用突變啟動子tRNA合成CAT蛋白質。它們包括:(ⅰ)tRNA的氨酰基化和甲酰基化的程度；(ⅱ)甲酰基氨酰基化的tRNA對結合IF2和/或核糖體的活性；以及(ⅲ)對突變啟動子tRNA的超級生產的程度。第三個因子的重要性被低估了，因為在此所用的兩種突變tRNA產生的另一種報道蛋白，即二氫葉酸還原酶，在被克隆到低拷貝載體時比較低[Pallanck and Schulman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:3872-3876(1991)]。CAT蛋白質水平對細胞中甲酰基氨酰基-tRNA水平的依賴強烈表明起始是CAT mRNA翻譯的限制性步驟阻[Hershey,“Protein Synthesis”,In Neidhart et al.,(Eds),Escherichia coli andSalmonella Typhimurium,Cellular and Molecular Biology,Amer.Soc.Microbiology,Washington,DC,Chapter 40,pp.613-647(1987)]。等同物本領域的技術人員的人將知道或者通過不多的例行試驗就能確定許多與本文介紹的具體實施方案等價的方案。這些方案和其他等價方案沒有脫離本發明的權利要求規定的范圍。
權利要求
1．一種在宿主細胞中超級生產蛋白質的方法，所述的蛋白質是以非甲硫氨酸的氨基酸起始的，該方法包括下述步驟(a)向宿主細胞中引入(1)編碼蛋白質的并具有對非甲硫氨酸的氨基酸的啟動密碼子的DNA；(2)編碼含有相應的反密碼子的突變啟動子tRNA；以及(3)編碼甲硫氨酰tRNA轉甲酰基酶的DNA；從而產生修飾的宿主細胞；和(b)將修飾的宿主細胞保持在對超級生產甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶和表達具有對非甲硫氨酸的氨基酸的啟動密碼子并編碼蛋白質的DNA為適宜的條件下；從而對以非甲硫氨酸的氨基酸為起始的蛋白質進行超級生產。
2．根據權利要求1所述的方法，其中所述的以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質是以纈氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸起始的蛋白質。
3．根據權利要求2所述的方法，其中所述的宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)。
4．根據權利要求2所述的方法，其中所述的以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質是血紅蛋白或生長激素。
5．根據權利要求1所述的方法，進一步包括在步驟(a)中向宿主細胞中引入編碼適宜的氨酰基tRNA合成酶的DNA，和在步驟(b)中保持修飾的宿主細胞在對適宜的tRNA合成酶的生產為適宜的條件下。
6．一種在宿主細胞中超級生產蛋白質的方法，其中所述的蛋白質以非甲硫氨酸的氨基酸起始，該方法包括下述步驟(a)向宿主細胞中引入(1)編碼蛋白質的并具有對非甲硫氨酸的氨基酸的啟動密碼子的DNA；(2)編碼含有相應的反密碼子的突變啟動子tRNA；(3)編碼甲硫氨酰tRNA轉甲酰基酶的DNA，從而產生修飾的宿主細胞；以及(4)編碼適宜的氨酰基tRNA合成酶的DNA，從而生產修飾的宿主細胞；和(b)將修飾的宿主細胞保持在對超級生產甲硫氨酰-tRNA轉甲酰基酶和表達具有對非甲硫氨酸的氨基酸的啟動密碼子并編碼蛋白質的DNA為適宜的條件下；從而對以非甲硫氨酸的氨基酸為起始的蛋白質進行超級生產。
7．根據權利要求6所述的方法，其中所述的以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質是以纈氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸起始的蛋白質。
8．根據權利要求7所述的方法，其中所述的宿主細胞是大腸桿菌。
9．根據權利要求7所述的方法，其中所述的以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質是血紅蛋白或生長激素。
10．由權利要求1所述的方法生產的以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質。
11．由權利要求6所述的方法生產的以非甲硫氨酸的氨基酸起始的蛋白質。
全文摘要
本發明提供了由除了甲硫氨酸以外的氨基酸起始的蛋白質的超級生產,其中,甲硫氨酶tRNA轉甲酰基酶加上或不加上tRNA合成酶在宿主細胞中被超級表達。
文檔編號C07K14/245GK1231697SQ97198313
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月28日 優先權日1996年8月29日
發明者尤他曼·L·瑞杰布漢德瑞 申請人:麻省理工學院