專利名稱：糖鏈識別抗體及治療hiv感染疾病的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的糖鏈識別抗體，更具體地涉及屬于IgM類并且識別在HIV感染細胞中表達的糖鏈的抗體，以及涉及用于治療HIV患者的含有該抗體為有效成分的藥物。
背景技術：
1981年在圣弗蘭西斯科第一次發現AIDS(后天免疫缺陷綜合癥)，為同性戀男性致命的免疫缺陷疾病(Gottlieb，M．S．，Schroff，R．，等，N．Engl．J．Med．，305，1425-1430(1981))。兩年以后，法國Pasteur研究所Montanie研究小組發現引起AIDS的病毒(Barre-Sinoussi，F．，Chermann，J．C．，等，《(科學》(Science)，220，868-871(1983))。1985年，該病毒被統一命名為HIV(人免疫缺陷病毒)(Coffin，J．，Haase，A．，等，《(科學》(Science)，232，697(1986))。
AIDS是具有下面特征和性質的疾病當一個個體通過性交，輸血等感染了HIV，則該病毒破壞受感染個體的免疫功能，引起宿主，即該感染個體后天性免疫缺陷。甚至，該宿主出現多種癥狀，例如腹瀉和肺炎，導致宿主的最終死亡。
迄今為止，很多研究人員力圖開發出治療AIDS的藥物。例如，從Mitsuya等發現疊氮基胸苷(AZT)(Mitsuya，H．，等，《美國國家科學院院刊》(Proc．Natl．Acad．Sci．，USA．)，82，7096(1985))開始，臨床條件下已經研究了ddI(2’，3’-二脫氧肌苷)，ddC(2’，3’-二脫氧胞苷)，和其它物質。但是，還沒有獲得提供令人滿意效果的藥物。
盡管從HIV感染到發病的潛伏期根據個體而大大不同，但是大約感染HIV人數的50％肯定會在感染后10年內出現病癥，并且幾乎所有的感染患者在出現病癥后1-3年內死亡。超過40歲的成年和兒童在感染HIV后很快發展病情。解釋感染與出現AIDS相關綜合癥(ARC)之間的潛伏期的原因可能包括患者一般的健康狀況，遺傳素因，與其它感染疾病的并發癥，和其它依賴宿主的原因，以及感染病毒菌株間的差異。
由于灌輸血液成分而感染的情況下，大多數HIV感染個體出現AIDS而死亡。但是一些感染個體即使在感染10年后也不出現AIDS，而且另一些感染個體在出現AIDS之前甚至需要更長時間。這種病例分布世界各地，而且據報道5％的HIV感染個體長時間生存。HIV感染人員中長時間保持沒有癥狀的稱作長時間生存者已經引起了很大關注，因為認為他們提供了解釋他們對HIV病毒的抗性或防止出現病理癥狀的機理的線索。因此對這些長時間生存者進行了大量的研究和探討。
但是還沒有清楚地明白為什么長時間生存者盡管感染了HIV但是不出現AIDS的原因。因此期望澄清HIV抗性原因，并以此為基礎開發出治療HIV疾病的藥物。
本發明的公開本發明人研究了HIV感染人員病毒復制的靜止情況和活性情況之間的差別。在該項研究中發現一些感染患者攜帶的某些糖鏈的天然抗體中存在的特異性IgMs可能能解釋疾病發展的延遲。作為抗原的糖鏈據認為不存在于處于正常環境下的人體內，或者以有限量存在。但是當細胞受HIV感染時，這些糖鏈出現在T細胞或巨噬細胞的表面。(一般來說，已知當細胞發生腫瘤或感染一種病毒時，特殊的糖鏈出現在這些細胞的表面)。如果屬于IgM類的這些糖鏈所屬抗體作為天然抗體存在于血清中，則抗體識別HIV感染細胞，并且與這些感染細胞結合。補體級聯在該局部位點被激活，在該位點IgM與糖抗原結合，導致HIV感染細胞的溶胞作用。這樣，含有上述天然IgM抗體的血清建立一個特定的環境，在該環境下HIV感染細胞不容易增殖。本發明人還發現HIV感染細胞增強了補體敏感性。這些事實不僅在體外得到了證明，而且在感染了HIV且延遲出現AIDS的患者體內也得到了證明。即，實際證明了這些長期生存患者出現屬于IgM類的與HIV感染細胞反應的抗體。
也發現通常抵抗補體的細胞在神經節四糖(Gg4)的抗體結合這些細胞后被補體溶胞。另外，屬于IgM類的具有與感染細胞結合能力的抗體減少了感染細胞，這是補體激活介導的細胞溶解的結果，并且該抗體使HIV感染細胞出現了一個洞孔。于是可以知道施用屬于IgM類的并且具有與HIV感染細胞反應性的抗體對于治療HIV攜帶者是有用的。
因此，本發明提供一種糖鏈識別抗體，其屬于IgM類并且其識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2。
本發明還提供一種治療HIV疾病(AIDS)的含有糖鏈識別抗體作為有效成分的藥物。
本發明還提供一種用糖鏈識別抗體治療HIV疾病的組合物。
本發明還提供糖鏈識別抗體的用途及治療HIV疾病的治療劑的制備方法。
本發明還提供一種治療HIV感染患者的方法，其特征在于對HIV患者施用有效量的糖鏈識別抗體。
附圖的簡要說明

圖1是表明對血清樣品No．1進行表位分析結果的圖示。
圖2是表明對血清樣品No．56進行表位分析結果的圖示。
圖3是表明含有來自健康HIV血清陰性供者的IgM的人血清對HIV感染的MOLT4細胞的溶胞能力的圖示。
圖4是表明一項試驗結果的圖示，在該項試驗中，用來自正常人血清-1(NHS-1)的IgM抗體級分分別處理神經氨酸酶處理的MOLT4細胞，未處理的MOLT4細胞，和HIV-MOLT4細胞，然后用熒光素標記的抗人IgM抗體免疫染色。
圖5是表明被各種糖包被的脂質體吸收的IgM抗體殘留的溶細胞能力的結果，以及被IgM處理的靶細胞的免疫染色的結果的圖示。
圖6是表明測定HIV-感染-MOLT4細胞上補體滅活膜的表達量的流式細胞測量法的結果的圖示。
進行本發明的最佳方式這里所使用的糖鏈用本領域習慣縮寫代表Gg代表神經元系列，Cer代表神經酰胺，Gal代表半乳糖，GalNAc代表N-乙酰基半乳糖，及Glc代表乳糖。本發明抗體可以從人血清中分離，或者可以通過使用Gg4Cer或GM2作為抗原產生抗體的常規方法制備，只要這些抗體識別Gg4Cer或GM2(神經節苷脂GM2II3αNeuAc-GgOse3Cer)并且屬于IgM免疫球蛋白。
為了從人血清中分離本發明抗體，使用常規方法，用Gg4Cer或GM2作為抗原篩選存在的抗體。血清可以是從血清陰性HIV感染患者采集的樣品或是其它的從健康個體采集的樣品。抗Gg4Cer或GM2抗體可以通過常規方法獲得，例如雜交瘤方法或者使用EB病毒無限增殖化方法。
用于篩選的技術包括常規的ELISA，RIA，熒光抗體技術，斑點免疫結合試驗，蛋白質印跡方法，和51Cr-釋放方法。
從上述血清分離出來后，本發明抗體容易用公知的免疫球蛋白純化技術純化。這些方法的例子包括鹽沉淀，凝膠過濾，和親和層析(使用甘露聚糖柱，偶聯甘露糖聚合物來去除甘露糖結合的蛋白質(MBP))。
本發明抗體也可以通過常規的雜交瘤方法用Gg4Cer或GM2作為抗原來制備。本發明抗體可以是單克隆或多克隆抗體，只要他們識別Gg4Cer和／或GM2并且屬于IgM類。
本發明抗體對于治療HIV疾病是有用的，這一點從下文中得到證明。
本發明人獲得了具有引起HIV-1感染的T細胞系細胞溶解能力的人血清樣品。發現用HIV-1的HTLV-ⅢB菌株感染的人T細胞系(MOLT4)被來自HIV血清陰性健康個體的新鮮正常人血清(NHS)溶胞，但是檢驗的大多數血清，包括HIV感染攜帶者的血清對溶解HIV感染的Molt4沒有活性。當采集最初樣品一年后又采集新鮮樣品時，具有溶解HIV感染細胞能力的血清仍然具有相同程度的效能。通過將血清在56℃加熱30分鐘破壞NHS-1的細胞毒性能力，并且通過加入沒有溶胞的新鮮血清(NHS-5)來儲存，表明細胞溶解是由補體激活介導的，因為已知熱處理可以滅活補體。
血清中甘露糖結合的蛋白質(MBP)據報道與HIV的gp41(C．F．Ebenbichler等，J．Exp．Med．，174，1417(1991))和gp120(C．Sual等，J．Immunol．Med．，152，6028(1994))反應，從而顯示出補體活性。但是，當用甘露聚糖柱從NHS-1中去除MBP時，不降低細胞溶解能力。
通過在TSK凝膠G3000SW柱上凝膠過濾分離NHS-1后，發現IgM級分具有使HIV感染MOLT4細胞(HIV-MOLT4)對于通過未溶胞的人血清例如NHS-5的細胞溶解敏感的能力。完全喪失其增敏能力的級分通過與小鼠抗人IgM單克隆抗體偶聯的親和柱而被破壞。這解釋了IgM是造成HIV-MOLT4對血清補體引起的細胞溶解敏感的原因。但是在蛋白質印跡分析中該IgM不與HIV抗原反應。因此本發明人推測被該抗體識別的抗原表位可能是由于HIV感染而產生改變的糖部分。然后本發明人試圖用神經氨酸酶處理未感染的MOLT4細胞，并且發現被處理的細胞與識別一種唾液酸糖綴合物的IgM反應。而且用這些神經氨酸酶處理的MOLT4細胞吸收IgM級分明顯降低了對由正常人血清引起的細胞溶解的敏感性。
IgM級分顯示出與某些糖苷的反應性，例如Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)，其可以通過從GM1中去除唾液酸而產生。而且帶有Gg4的脂質體吸收了IgM對于細胞溶解的敏感能力。通過用小鼠抗Gg4單克隆抗體的免疫染色證明在HIV-MOLT4細胞上和神經氨酸酶處理的MOLT4細胞上存在Gg4抗原識別位點。用識別GM2的抗原或HIV感染的V-937細胞的IgM也證明了這些作用。
另一方面，已知補體活性被特異性膜抑制劑抑制，所述特異性膜抑制劑是例如(1)一種衰變加速因子，其是一種膜補體抑制劑(DAF；A．Nicholson-Weller，J．Burge，D．T．Fearon，P．F．Weller，K．F．Austen，J．Immunol．，129，184(1982))，(2)膜輔因子蛋白(MCP；T．Seya，J．R．Tumer，J．P．Atkinson，J．Exp．Med．，163，837(1986))，和(3)CD59(HRF20；20KDa同源限制性酶切因子，N．Okada，R．Harada，T．Fujita，H．Okada，Int．Immunol．，1，205(1989)；A．DaVis等，J．Exp．Med．，170，637(1989))。
其中Fas抗原被表達的條件下，DAF，MCP，和CD59的表達是負調節的，而HLA-DR的表達保持不變。特則是，CD59在HIV感染的細胞上的表達不大于未感染的MILT4細胞的表達的50％。CD59表達的負調節也可以由Northern印跡分析測定的mRNA的水平而證實。
而且，使抗補體反應抗性由于減少的CD59表達而減弱的HIV感染的-MOLT4進行由IgM和正常人血清補體引起的選擇性細胞溶解。溶胞和未溶胞細胞之間gp120表達程度沒有不同。DAF，MCP，和特別是CD59的負調節可能作用于由被抗原-IgM配合物激活的人補體引起的HIV感染細胞的細胞溶解。而且HIV感染細胞的膜上的末端唾液酸的量的減少可能有利于補體的激活。但是HIV感染細胞，即使這些細胞結合IgG，也不被HIV-血清陰性血清補體溶胞，這可以通過熒光素標記的抗人IgG抗體檢測。
對于通過典型途徑來激活補體，需要兩個IgG分子，它們以鄰近效應相互反應。另一方面只有一個分子IgM就足以用于補體激活。因此，補體激活通過IgM觸發比通過IgG觸發有效得多而且IgM引發的補體激活有可能通過靶細胞膜上的補體抑制分子而逃避限制性酶切，因為IgM是900kDa的大分子，與該分子結合的補體成分可能不能接近DAF，MCP，或膜上的其它補體抑制分子。另一方面，由補體激活產生的膜攻擊復合體結合在細胞膜的脂雙層上。CD59限制結合在這些膜上的這些抗原-IgM復合體的生成，從而防止細胞損傷。HIV感染細胞上CD59減少的表達回復細胞抗膜攻擊復合體的抗性并促進細胞溶解。
用其它T細胞系例如CEM和MT4細胞對于MOLT4細胞獲得了相同的結果。HIV感染的CEM細胞顯示出減少的CD59表達以及對于由IgM和補體引起的細胞溶解敏感。但是，在巨噬細胞系例如HIV感染的U937細胞中沒有發現CD59表達的減少，并且這些細胞系抵抗由IgM和補體介導的細胞溶解。
IgM和補體介導的細胞溶解反應在體內在HIV感染的T細胞的減少中起作用。如果個體具有與出現在HIV感染的T細胞上的糖抗原例如Gg4和GM2反應的天然IgM抗體，則認為HIV感染的擴展在HIV感染時被抑制。盡管HIV感染的巨噬細胞可以從涉及IgM和補體的攻擊反應中幸存下來，但是感染的T淋巴細胞將被去除。因此，血清IgM可能是決定一些HIV攜帶者長期存活的機理的關鍵因素。事實上，當對12個HIV感染后生存了12年或更長時間的長期存活者進行研究時，發現他們所有的人都擁有IgM，而在短期內出現癥狀的5個人只擁有IgG而沒有IgM。
對于黑素瘤患者也發現了類似的IgM保護機理(Ones，P．C．，Sze，L．L．，Morton，D．L．和Irie，R．F．，J．Natl．Cancer Inst．，66，249，1980)。
如上所述，對HIV感染患者施用本發明糖鏈IgM在于體內保留天然抗體方面將是有效的，因此在治療和防止AIDS中是有效的。
本發明IgM一般摻合到合適的藥物制劑中，一般是腸胃外制劑例如注射液，并對需要治療的患者給藥。可以通過常規方法獲得這些制劑，用于制劑的賦形劑是常規的，一般是例如糖，氨基酸，和蛋白質。除了本發明IgM外，這些制劑還含有合適量的合適的添加劑，例如各種無機鹽。不同形式本發明制劑中的劑量沒有特別的限制。一般優選確定劑量使具有活性并殺死HIV感染的細胞，因此IgM存在的量是體外對于有效成分糖鏈(IgM效能)來說在10μl／ml至50μl／ml的范圍。
因此本發明抗體對于防止和治療HIV感染患者是有用的。即當對個體施用本發明糖鏈特異性抗體時，體內提高了天然抗體滴度，從而提供抗AIDS的治療和預防效果。
實施例下面將通過實施例更加詳細地描述本發明。實施例1細胞的培養在補加有10％小牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100IU／ml青霉素和100mg／ml鏈霉素的RPMI1640培養基中培養一種人T細胞系的MOLT4細胞，并使沒有支原體。細胞用HTLV-ⅢV(HIV-1)感染，并在作為HIV感染的靶細胞源使用之前培養4星期或更長時間。通過流式細胞計量器使用單克隆抗體0．5β(即一種gp120 HTLV-ⅢV的抗體)檢測測得大于95％的細胞是HIV-env抗原(gp120)陽性，從而證明大多數細胞中成功地被HIV-1感染。
分別用51Cr標記5×106HIV感染的MOLT4細胞和未感染的對照MOLT4細胞(正常MOLT4細胞)。標記后將兩種細胞沖洗并懸浮于沒有RPMI1640培養基的血清中，濃度是2×105／ml。
100μl等份的細胞懸浮液和100μl新鮮的或熱滅活的血清置于U-底微型板的每一個孔中。血清是從4個HIV-血清陽性患者和13個健康HIV-血清陰性供者獲得的這些平板在37℃保溫1．5小時并離心。用下面的公式計算51Cr釋放到沒有細胞的上清液中的百分數％51Cr釋放={(用新鮮血清釋放-用熱滅活血清釋放)／(用5％TritonX100釋放-用熱滅活血清釋放)}×100實施例2用神經氨酸酶處理向100μl細胞懸浮液(2×106)中加入100μl神經氨酸酶，并在37℃培養45分鐘。向2×106MOLT4，Neu-MOLT4，或HIV-MOLT4細胞小丸加入250μl來自NHS-1的IgM級分--NHS-1是具有強細胞溶解活性的血清，并在4℃培養30分鐘。離心后將上清液轉移到另一些試管中測定它們的增敏能力。沖洗細胞并用FITC-綴合的小鼠抗人IgM染色并在FACScan上分析。
用MOLT4，Neu-MOLT4，或HIV-MOLT4培養后獲得的上清液與HIV-MOLT4一起在沒有溶胞的人血清(NHS-5)存在下培養，以測定細胞溶解活性。
實施例3根據實施例1的描述篩選來自健康個體的95個血清樣品，其中使用用51Cr標記的感染的MOLT4細胞作為靶細胞。作為結果，發現16個個體具有對于感染細胞的15％或更高的細胞溶解活性。接著通過使用感染的U937和MOLT4細胞，對兩個血清樣品進行選擇，這兩個血清樣品具有對于這兩個感染的細胞系的細胞溶解活性。收集血清的IgM級分并在下面的試驗中使用。
根據《免疫》(Immunology)，48129-140(1983)中說明的方法制備脂質體。簡要地說，以1∶1∶0．1混合膽固醇，二肉豆蔻酰-卵磷脂，和要插入的各種脂質中的一種，并用旋轉蒸發器蒸發溶劑氯仿，從而在玻璃瓶內表面生成一層脂質膜。由膽固醇，二肉豆蔻酰-卵磷脂(1∶1)制備對照脂質體。
向脂質膜加入PBS，膜在渦流混合器中劇烈振動以形成脂質體(多層)。向多層脂質體加入PBS用于離心洗滌，從而獲得脂質體懸浮液。
從得到的脂質體懸浮液中取含有10nmol糖脂的等份并進行離心從而得到脂質體小丸。棄除上清液。向小丸加入IgM級分(200μg／200μl)(血清陽性血清通過使用TSK-3000的凝膠過濾分級后)。攪拌混合物，并在室溫下靜置60分鐘，以吸收存在于脂質體膜上面的糖脂的抗體。反應后，離心混合物，沉淀脂質體，并回收上清液。
對上述吸收過程之后IgM級分測定細胞對于HIV感染的MOLT4細胞(HIV-MOLT4)的破壞活性。簡要地說，向100μl51Cr-標記的HIV-MOLT4(即51Cr-HIV-MOLT4，2×55／ml)或者對照情況下，向相同量的未感染的51Cr-MOLT4加入50μlIgM級分和50μl血清陰性正常人血清(作為補體來源)，其中IgM級分進行了或者沒有進行吸收過程。混合物在37℃反應90分鐘，然后離心平板。測定釋放到上清液中的51Cr的量，測得對于細胞的破壞程度。
即在試驗中分別使用了對照脂質體，Gg4脂質體，和GM2脂質體，它們是純脂質體，脂質體加Gg2，和脂質體加GM2。通過使用一種類型的脂質體，新鮮的血清，和25％IgM級分引起抗原-抗體反應。在上清液中測得細胞的溶胞活性(細胞溶解百分率)結果見圖1和圖2。在樣品No．1和No．2兩種情況下，在“對照”和“Gg4脂質體”中保持溶胞活性，與GM2脂質體接觸后該活性完全消失。這些結果證明在來自正常個體的血清中，GM2是產生的抗HIV感染的細胞的IgM天然抗體的抗原表位。實驗實施例1來自正常血清陰性供者個體的人血清(含有IgM)對HIV-MOLT4細胞的細胞溶解作用結果見圖3。x-軸代表細胞溶解百分率，y-軸代表來自供者的血清(NHS-1至NHS-13和PS-1至PS-4)。圖3附有圖(a)和(b)，它們給出血清樣品(NHS-1，NHS-5或PS-1)與HIV-MOLT4細胞反應后進行的免疫染色的結果(x-軸熒光強度；y-軸細胞數)，其中圖(a)是其中使用IgM的情況，圖(b)是其中使用IgG的情況。這些圖證明了下面的發現。
(A)來自健康HIV-血清陰性的13個血清樣品中，只有一個(NHS-1)引起51Cr-標記的HIV-MOLT4細胞的細胞溶解歸因于人血清。
NHS-1顯示出43％細胞溶解這樣高的百分率，而沒有來自健康個體的其它血清(12個個體NHS-2至NHS-13)顯示出任何注意得到的細胞溶解。來自HIV-血清陽性患者的血清(PS-1至PS-4)幾乎沒有顯示出細胞溶解。
(B)HIV-MOLT4細胞與等體積血清樣品NHS-1，NHS-5或PS-1一起在室溫下培養30分鐘，然后沖洗細胞，并通過使用FITC-標記的抗人IgM抗體或FITC-標記的抗人IgG抗體免疫染色。
結果在圖3中的圖(a)和(b)中給出。用NHS-1處理的HIV-MOLT4細胞結合抗IgM抗體，而結合抗IgG抗體的PS-1不與抗IgM抗體反應。實驗實施例2
神經氨酸酶處理的MOLT4細胞，未處理的MOLT4細胞，或HIV-MOLT4細胞用來自NHS-1的IgM抗體級分處理，然后用熒光素標記的抗人IgM抗體免疫染色。結果在類似于圖3中的圖(a)的圖4中給出。與HIV-MOLT4細胞反應的IgM抗體也與神經氨酸酶處理的HIV-MOLT4細胞反應。
作為結果，如圖4中的圖(a)所示，來自NHS-1的IgM級分與Neu-MOLT4細胞反應和其與HIV-MOLT4細胞的反應一樣強。如圖4中的圖(b)所示，抗-gp120單克隆抗體(抗-gp120，0．5β)只染色HIV-MOLT4細胞。
IgM級分增敏人血清細胞溶解的能力通過用Neu-MOLT4細胞處理而被吸收，就象用HIV-MOLT4細胞處理而吸收一樣。換句話說，用吸收其細胞溶解能力的這些細胞處理的IgM級分喪失了用細胞溶解能力傳遞健康人血清(NHS-5)的效能。實驗實施例3對HIV-MOLT4有反應性的IgM與Gg4Cer反應。
(A)7種不同類型的下面說明的糖脂在塑料TLC平板上層析，通過使用地衣二酚-硫酸試劑和由NHS-1(a)獲得的IgM級分通過免疫染色檢測斑點，也可以使用由NHS-1獲得的IgM級分通過TLC免疫染色檢測斑點。
1．LacCer，2．Gg3Cer，3．nLc4Cer，4．Lc4Cer，5．Gb4Cer，6．Gy4Cer，7．IV3Galα-nLc4Cer．Gg4Cer明顯被染色。LacCer，Gg3Cer，和LcCer稍有染色。但是IgM級分幾乎沒有與nLc4Cer，Gb4Cer，IV3Galα-nLc4Cer，唾液基化的糖脂例如GM3，GM2，GM1，GD1a，GT1b，GQ1b，IV3NeuAcα-nLc4Cer，唾液基化的Lea和唾液基化的Lex反應。
將Gg4Cer染色水平作為100，LacCer，Gg3Cer，nLc4Cer，Gb4Cer，和IV3Galα-nLc4Cer的染色水平分別是25．8，31．8，0，29．3，0，和24．6。
根據Okada和其它人的說明(Okada，N．，Yoshida，T．，和(Okada，H．，《自然》(Nature)，299，261(1982))制備脂質體。IgM級分(50μg／200μl)與5nmol各種脂質體制劑混合。離心后根據實施例2描述的方法測定上清液的細胞溶解活性。
IgM級分對于由非溶胞人血清(NHS-5)引起的HIV-MOLT4細胞的細胞溶解的能力通過用Gg4-脂質體處理而吸收到小于一半的水平(圖5，A)。
盡管抗Gg4的小鼠單克隆抗體不與正常的MOLT4細胞反應，但是根據流式細胞計量器測定，其更易與HIV-MOLT4和Neu-NOLT4細胞反應(圖5，B)。實驗實施例4HIV-MOLT4細胞上CD59表述的明顯減少(A)通過流式細胞計量器測定，發現HIV感染的細胞上的補體調節膜因子(DAF，MCP，和CD59)的表達減少。HIV感染后Fas抗原和HLA-DR的表達保持不變(圖6)。
(B)對于補體調節膜因子的Northern印跡分析，根據Thomas，P．S．，《酶學方法》(Method Enzymol．)100，255-2(1983)的說明提取5μg來自未感染的(N)和HIV感染的(H)MOLT4細胞的全RNA，并用乙二醛變性。用CD59，DAF，MCP，和GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脫氫酶)的cDNA片段作為探針。清楚地發現CD59mRNA的減少。
1×106個細胞與NHS-1在37℃培養30分鐘后，對HIV-MOLT4進行兩個顏色分析。通過用propiodium iodide(PI)染色測定死亡細胞數。這可以區分用PI染色的死亡細胞和不能用PI染色的存活細胞。用這些抗原的FITC標記的單克隆抗體染色C5b-9(MAC)，CD59，和gp120。結果總結如下。
(a)與NHS-1培養后PI染色的細胞(死亡細胞)比PI染色的陰性細胞染色稍微強一點，后者細胞表明這些細胞被大量C5b-9處理并且沒有被殺死。
(b)在10mM EDTA存在下NHS-1不誘導PI陽性死亡細胞。
(c)表達減少量的CD59的細胞在用NHS-1處理后用PI染色，表明表達減少量的CD59的細胞優先被殺死。
(d)gp120的表達在PI染色的細胞(死亡細胞)和未染色細胞(存活細胞)之間基本上相同，表明抗-gp120抗體的量和NHS-1的細胞殺傷能力不直接相關。
工業上的實用性
因為對HIV感染的個體施用糖鏈識別抗體引起補體激活介導的HIV感染細胞的細胞溶解作用，因此本發明糖鏈識別抗體在治療和防止AIDS中是有用的。
權利要求
1．一種糖鏈識別抗體，其屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2。
2．一種治療HIV疾病的藥物，其含有屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體為活性成分。
3．權利要求2的藥物，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細胞的溶胞。
4．一種治療HIV疾病的組合物，其含有屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體。
5．權利要求4的組合物，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細胞的溶胞。
6．屬于IgM免疫球蛋白亞類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體在制備治療HIV疾病的治療劑中的用途。
7．權利要求7的用途，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細胞的溶胞。
8．一種治療HIV感染患者的方法，特征在于對所述患者施用有效量的屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體。
9．權利要求8的方法，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細胞的溶胞。
10．權利要求8的方法，用于防止AIDS病癥的出現。
全文摘要
本發明涉及出現在HIV感染細胞上的屬于IgM同種型并且識別Gg4Cer(Galβ1－3GalNAcβ1－4Galβ1－4GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體,并且涉及含有這些IgM的用于治療HIV疾病的藥物。
文檔編號C07K16/28GK1205642SQ9619912
公開日1999年1月20日 申請日期1996年12月17日 優先權日1995年12月18日
發明者岡田秀親, 岡田則子 申請人:大塚制藥株式會社