專利名稱：環縮肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及環縮肽及其作為粘著分子表達的抑制劑的治療應用。
例如ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白的細胞粘著分子，是響應包括TNFα、IFNγ、IL1和LPS的促炎介體而在內皮細胞表面以及關于ICAM-1的角質形成細胞表面表達的。相應的反配體，例如LFA-1、VLA-4和SLEX，是在循環血細胞表面表達的。在炎性過程期間白細胞經內皮的遷移，以及血管外的細胞-細胞相互作用，是由于這些粘著分子與其反配體之間的相互作用而被調節的。因此，粘著分子表達的抑制劑有可能治療許多病態。
環縮肽是環狀分子，分子中包括通過肽鍵連接起來的氨基酸殘基和至少一個羥基取代的羧酸殘基，該羧酸殘基通過它的羥基取代基利用酯鍵與鄰近的酸殘基連接。
我們的未決專利申請即公開的國際專利申請WO96/03430中公開了新型的環七縮肽，它們是ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白表達的抑制劑。我們現在進一步發現了該同一大類化合物的新環七縮肽，包括具有特別理想性能的化合物。
本發明提供了式I的環七縮肽，
式中A是乙醇酸(glycolic acid)殘基，它任選被H、甲基、乙基、丙基或乙烯基α取代，所述甲基、乙基、丙基或乙烯基任選被鹵素、烷氧基、任選保護的羥基或氨基、CSNH2、COOR2、乙烯基、-C≡CH或噻唑取代，其中R2是H或低級烷基，任選被烷基、鹵素、環烷基、任選取代的噻唑、COOR2或-C≡CH取代，其中R2同上述定義；B是α-氨基-γ-甲基取代的辛酸殘基；R1是氫或甲基；C是色氨酸殘基或式II的N-甲基-色氨酸殘基，
其中R3表示氫、烷氧基、烷基或芐基，R4表示氫或鹵素，R5表示氫或甲基且
則表示單鍵或雙鍵；X是α-氨基取代的(C2～C14)羧酸殘基，以及Y是α-氨基-或N-甲基-α-氨基取代的(C2～G10)羧酸殘基。
在式I中，氨基酸殘基的N-端至C-端取向呈順時針方向，且該縮肽酯鍵位于殘基A和Y之間。當R1是甲基時，則殘基R1-Leu和Leu分別是N-甲基亮氨酸殘基和亮氨酸殘基。
優選的A是乙醇酸殘基，它被H、甲基、乙基或丙基α取代，其中的甲基、乙基或丙基任選被氨基、羥基、氯、烷氧基、任選取代的噻唑、任選取代的乙烯基、環丙基、CSNH2或-C≡CH取代。
優選的C是式II的N-甲基色氨酸殘基，其中R3表示氫、(C1～C4)烷氧基(特別是甲氧基)或烷基，且R4表示氫或鹵素。
優選的X是α-氨基取代的(C4～C8)羧酸殘基，它任選被β-或γ-(C1～C4)烷基取代。最優選的X是α-氨基-β-或γ-(C1～C4)烷基-(特別是甲基-)取代的辛酸殘基或丁酸殘基。
優選的Y是N-甲基-α-氨基取代的(C2～C4)羧酸殘基，它任選被β-或γ-(C1～C4)烷基取代。最優選的Y是N-甲基丙氨酸殘基或N-甲基纈氨酸殘基。
本發明包括對應于式I化合物的開鏈肽或縮肽；例如，通過解離殘基Y和A之間的酯鍵或者解離任何其它鄰接的酸殘基對之間的酰胺鍵而得到的開鏈分子。優選的開鏈衍生物有式IV和V的化合物，H-C-X-Y-A-B-R1Leu-Leu.OR7IV和HA-B-R1Leu-Leu-C-X-Y.OR7V其中R7表示氫或烷基，如C1-4低級烷基。
按本發明的一個實施方案，優選的化合物是式Ip的化合物
其中Ap是任選被H、乙基或甲基α取代的乙醇酸殘基；Bp是α-氨基-γ-甲基取代的辛酸殘基；R1p是氫或甲基；Cp是色氨酸殘基或N-甲基色氨酸殘基，它任選被N′-(C1～C4)烷氧基取代；Xp是α-氨基取代的(C2～C14)羧酸殘基，以及Yp是α-氨基-或N-甲基-α-氨基取代的(C2～C10)羧酸殘基。
按本發明的另一個實施方案，優選的化合物是式I′p的化合物
其中Bp、R1p、Cp、Xp和Yp同上述定義，而A′p是α羥基取代的丁酸殘基，該殘基被式VI的基團γ取代，
其中R2表示低級烷基，例如C1-4低級烷基。最優選的R2是甲基或乙基。
按本發明的又一個實施方案，優選的化合物是式I″p的化合物
其中Bp、R1p、Cp、Xp和Yp同上述定義，而A″p是α羥基取代的丁酸殘基，該殘基被式VII的基團γ取代，
其中R6表示氫、低級烷基或苯基，或者與噻唑基環的5位一起構成一個碳環。
式I、IV、V、Ip、I′p和I″p的化合物在后文被稱為“本發明的化合物”，該術語還包括呈鹽或酯形式以及呈游離態的本發明的所有化合物。
本發明的化合物含不對稱原子，因而可呈多種差向異構形式。所有可能的差向異構體及其非對映異構混合物都包括于本發明中。對粘著分子表達活性有抑制作用的差向異構體是優選的。一般地，例如用于本發明的藥物應用時，對粘著分子表達活性有抑制作用的差向異構體呈純形式或基本上純形式(即沒有或基本上沒有對粘著分子表達活性缺乏抑制作用的差向異構體)，例如包括至少90％的、如至少95％的活性差向異構體(即包括少于10％的、如少于5％的非活性差向異構體)將是優選的。最優選的本發明的化合物具有與下式VII的特別優選的化合物相同的環縮肽環立體化學構象。
特別優選的本發明的化合物是式VIII、IX和X的化合物
式VIII的化合物已從真菌株F/94-499709的培養物分離出，該真菌株樣品是按布達佩斯條約的規定于1995.9.18保藏于the DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，保藏號為DSM 10275。真菌株F/94-499709的特征在下文的實施例1中作了描述。式VIII的化合物是本發明特別的化合物。
菌株F/94-499709的樣品也可得自Sandoz.Ltd.CH-4002Basel Switzerland.
應注意，按Rule 28(4)和(5)EPC的規定，對于DSM10275的樣本的獲得做了限制。
本發明包括呈分離形式的菌株F/94-499709(DSM 10275)及其突變體和衍生物以及由該菌株產生的所有新型環縮肽。
式VIII的化合物及其相關化合物可這樣獲得，即例如按實施例2中所述那樣在營養培養基中培養F/94-499709(DSM 10275)或其突變體或衍生物或類似的真菌種，再從培養基中回收這些化合物。
式VIII的化合物的特征給出于實施例3中。
本發明的化合物可通過式XI或XII(下文將描述)或VIII的化合物的衍生作用制備，它包括a)-其中A被COOR2取代的式I化合物的制備將其中A被CN取代的式I的相應化合物與優選是醇的親核試劑反應，應用合適的堿性或酸性催化劑，優選應用鹽酸，反應在優選為醚的有機溶劑中進行，或者b)-其中A被烷氧基甲基取代的式I化合物的制備將其中A被CH2-OH取代的式I的相應化合物與例如烷基鹵化物或重氮化合物的烷基化化合物反應，可加或不加催化劑，或者c)-其中A被COOR2取代的式I化合物的制備應用標準方法酯化其中A被COOH取代的式I的相應化合物，優選通過用例如亞硫酰氯將它轉化為酰基氯，再用適當的醇在存在或不存在酸結合劑時進行處理，或者d)-其中A被CH2OH取代的式I化合物的制備在有機溶劑中，用金屬氫化物或硼氫化物、優選用甲硼烷二甲硫復合物還原其中A被COOR2取代的式I的相應化合物，或者e)-其中A被任選取代的乙烯基取代的式I化合物的制備將其中A被CHO取代的式I的相應化合物與維悌希試劑反應，或者f)-其中A被CH2NH2取代的式I化合物的制備還原其中A被CH2N3取代的式I的相應化合物，或者g)-其中A被C≡CH取代的式I化合物的制備將其中A被CH＝CBr2取代的式I的相應化合物進行脫氫反應，或者h)-其中A被環丙基取代的式I化合物的制備將其中A被乙烯基取代的式I的相應化合物與重氮甲烷反應，或者i)-其中A被CSNH2取代的式I化合物的制備將其中A被CN取代的式I的相應化合物與硫衍生物、優選與二苯基膦連二硫酸反應，例如將該硫化合物的溶液與其中A被CN取代的式I化合物一起回流，或者j)其中的取代基同前述定義的優選的式I″p化合物的制備
將其中A″p表示α-羥基取代的丁酸殘基(該丁酸殘基被-CS-NH2γ取代)的式I″p化合物與式XIII的α-鹵代羰基化合物反應，Hal-CH2-CO-R6XIII其中R6同前述定義，Hal表示鹵素，或者與式XIII化合物的縮醛反應(該反應可按已知方法進行，例如將式II化合物的溶液在反應條件下為惰性的溶劑中進行反應，例如在二甲基甲酰胺或吡啶中，在優選為60～100℃的較高溫度下。終產物可用慣常方法分離和純化。)，或者k)其中的取代基同前述定義的優選的I′p化合物的制備
將其中A′p表示α-羥基取代的丁酸殘基(該丁酸殘基被-CHOγ取代)的I′p化合物與烷氧基羰基亞甲基三苯基正膦反應，再分離式I′p的化合物；或者1)-其中R3表示氫的式I化合物的制備從其中R3表示OCH3的式I化合物中除去甲氧基，或者m)-其中符號
表示單鍵的式I化合物的制備還原其中符號
表示雙鏈的式I化合物，或者n)-其中R3表示烷基或芐基的式I化合物的制備將這些基團引入其中R3表示氫的式I化合物，或者o)-其中R4表示鹵素的式I化合物的制備將其中R4表示氫的式I化合物進行鹵化，或者
p)-其中R3表示烷氧基且符號
表示雙鍵的式I化合物的制備將其中R3表示氫且符號
表示單鍵的式I化合物與堿化鎢酸鹽和過氧化氫反應，再將該N-羥基-吲哚中間體進行烷基化，且需要的話，分離式I的化合物。
在上述a)～i)的優選實施方案中，式I的化合物是其中A是α-羥基丁酸殘基的化合物，該丁酸殘基適當時被下列基團γ取代COOR2、CN、烷氧基甲基、CH2OH、COOH、任選取代的乙烯基、CHO、CH2NH2、CH2N3、C≡CH、CH＝CBr2、環丙基或乙烯基。
用于制備式I化合物的中間體可這樣制備(i)制備其中A被-CHO取代的中間體氧化其中A被-CH2OH取代的式I的相應化合物，以及(ii)制備其中A被-COOH取代的中間體在水性醇溶液中，用無機酸(如HCl)或用堿水解其中A被COOAlkyl取代的式I的相應化合物。
用于制備其中A被-CN取代的式I化合物的中間體包括天然化合物。例如式XI和XII的化合物
可從真菌株F92-4471/08的培養物分離而得，該菌株按布達佩斯條約的規定于1993年7月2日在the US Department of Agri-culture，NRRL培養物保藏中心保藏，保藏號為NRRL 21123。真菌株F92-4471/08的特性以及化合物XI和XII的分離，在我們的未決專利申請即國際專利申請WO96/03430中作了詳細描述。
本發明的化合物也可用化學合成法制備；例如應用慣常的肽合成技術制備。通常在制備這類化合物時最后的步驟是環化反應步驟，其中通過酰胺鍵或酯鍵形成反應使線型肽或縮肽進行環化，所述肽或縮肽包括以適當順序連接在一起的酸殘基A、B、R1Leu、Leu、C、X和Y。
因此，本發明包括式I的環縮肽的制備方法，該方法包括將含有以適當順序連接在一起的酸殘基A、B、R1Leu、Leu、C、X和Y的線型肽或縮肽進行環化反應。
本發明的化合物顯示藥理活性，因而可用作藥劑。具體地說，本發明的化合物是細胞粘著分子受激表達的抑制劑，尤其是有關E-選擇蛋白的VCAM-1和ICAM-1表達的抑制劑。本發明的化合物也是TNF釋放的抑制劑，例如TNFα釋放的抑制劑。
在實施例之后描述了可用于檢測本發明的化合物對ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白表達的抑制作用以及對TNFα釋放的抑制作用的檢驗方法。
因此，鑒于它們作為細胞粘著分子表達的抑制劑的活性，這類化合物可用于治療或預防涉及細胞粘著分子的表達的疾病過程。這些疾病過程包括其中白細胞活化和運輸在致病過程中起重要作用的許多后天性和遺傳性疾病/失調，最值得注意的是急性和慢性炎癥(例如過敏反應、哮喘、皮炎、牛皮癬、再灌注損傷和敗血癥性休克)，自身免疫病(例如糖尿病、多發性硬化和類風濕性關節炎)以及免疫介導的神經變性(例如獲得性免疫缺陷病)。本發明的化合物適用的其它指征包括轉移瘤(例如黑素瘤、骨癌)，動脈粥樣硬化和同種移植/異種移植排異反應，因為已知對血管粘著分子的抑制可大為改善這些疾病過程的預后。
本發明的化合物對于過度增殖性皮膚病(例如牛皮癬)以及各種惡性腫瘤也有治療潛力，因為在亞微摩爾濃度下，在基于角質形成細胞以及其它增殖的檢查中試驗72小時后，可測知它們的抑制活性。
由p24ELISA估測到本發明的化合物在抑制U1單核細胞系中TNFα/IL-6誘導的HIV生產方面有活性，所以這些化合物適用于治療免疫缺陷病和病毒引起的病，特別是治療艾滋病。
此外，鑒于它們作為TNF釋放的抑制劑的活性，本發明的化合物適用于預防或治療由TNF、特別是由TNFα介導的疾病或病理狀況，例如炎癥，自身免疫病，嚴重感染，以及包括同種移植和異種移植排異反應的器官或組織移植排異反應，例如用于治療心、肺、心-肺結合、肝、腎、胰腺、皮膚或角膜移植物的受體，以及預防移植物抗宿主疾病，例如在骨髓移植之后。
本發明的化合物特別適用于治療、預防或改善自身免疫病和炎癥，尤其是病因中包括自身免疫組分的炎癥，例如關節炎(如類風濕性關節炎、arthritis chronica progrediente和arthritis deformans)和風濕病。可應用本發明的化合物的具體自身免疫病包括自身免疫血液病(例如包括溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細胞性貧血和特發性血小板減少癥)，全身性紅斑狼瘡，多軟骨炎，硬皮病，韋格納肉芽腫病，皮肌炎，慢性活性肝炎，重癥肌無力，牛皮癬，史蒂文斯-約翰遜綜合征，特發性口炎性腹瀉，自身免疫炎性腸病(例如包括潰瘍性結腸炎和局限性回腸炎)，內分泌性眼病，格雷夫斯病，肉樣瘤病，多發性硬化，肥大性肝硬變，青少年糖尿病(I型糖尿病)，葡萄膜炎(前葡萄膜炎和后葡萄膜炎)，干性角膜結膜炎和vernal keratocon-junctivitis，間質性肺纖維變性(interstitial lung fibrosis)，牛皮癬性關節炎，以及腎小球性腎炎(伴有或沒有腎變病綜合征，例如包括特發性腎變病綜合征或最小變化的腎病)。
本發明的化合物還適用于治療、預防或改善哮喘、支氣管炎、塵肺、肺氣腫，以及其它氣道阻塞病或氣道炎癥。
本發明的化合物適用于治療由TNF、特別是由TNFα介導的不希望的急性和超急性炎性反應，例如急性感染，如敗血癥性休克(例如內毒素性休克和成人呼吸窘迫綜合征)，腦膜炎，肺炎；以及嚴重燒傷；還適于治療惡病質或與病態TNF釋放相關的、感染、癌或器官功能異常后發作的消耗性綜合征，尤其是與艾滋病相關的惡病質，例如與HIV感染相關的或在HIV感染后發作的惡病質。
因此，本發明還包括本發明的化合物的治療應用，以及含本發明的化合物的治療組合物。
具體地說，本發明包括治療或預防涉及粘著分子表達的疾病的方法，這些方法包括給受治療者施用治療上或預防上有效量的本發明的化合物。
本發明還包括治療組合物，它含治療上有效量的、本發明的化合物。
此外，本發明包括本發明的化合物在制備用于治療或預防涉及粘著分子表達的疾病的藥劑中的應用。
特別地，本發明還提供了系列實施方案A.一種方法，它可抑制可溶性TNF、尤其是TNFα的生產，或減輕需要該治療的受治療者(例如哺乳動物，尤其是人)的炎癥，該方法包括給所述受治療者施用有效量的、本發明的化合物；或者治療任何上述疾病的方法，特別是治療炎癥或自身免疫病(例如多發性硬化或類風濕性關節炎)或者減輕一種或多種任何上述病的癥狀的方法。
B.用作藥劑的本發明的化合物，例如作為免疫抑制劑或抗炎劑用于預防或治療由TNF介導的疾病或病理狀況，或者用于預防、改善或治療上述任何疾病或病況，如自身免疫病或炎癥。
C.含有與藥物上可接受的稀釋劑或載體結合的本發明的化合物的藥物組合物，例如作為免疫抑制劑或抗炎劑用于預防或治療由TNF介導的疾病或病理狀況，或者用于預防、改善或治療上述任何疾病或病況，如自身免疫病或炎癥。
D.本發明的化合物在制備用于預防或治療由TNF介導的疾病或病理狀況的藥劑(例如作為免疫抑制劑或抗炎劑)方面的應用，或者在制備用于預防、改善或治療上述任何疾病或病況，如自身免疫病或炎癥的藥劑方面的應用。
該組合物可作腸胃外的、口服的、氣霧劑、吸入劑或局部用藥，其中通常包括一種或多種藥物上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，還可包括例如穩定劑等的添加劑。
應用的這類化合物劑量可根據下列因素變化，即涉及的病況或疾病，是作治療用還是預防用，尤其是施藥方式和途徑。不過，要達到滿意效果的一般口服劑量是約0.05～約10mg/kg/天，優選是約0.1～約7.5mg/kg/天，更優選是約0.1～約2mg/kg/天，日服一次或分成2～4次的均分劑量。也可腸胃外施藥，例如通過靜脈滴注或輸注，可應用的劑量是約0.01～約5mg/kg/天，優選是約0.05～約1mg/kg/天，更優選是約0.1～約1.0mg/kg/天。
這樣，病人口服(p.o.)合適的日劑量是約2.5～約500mg，優選是約5～約250mg，更優選是約5～約100mg；或者靜脈注射的日劑量是約0.5～約250mg，優選是約2.5～約125mg，更優選是約2.5～約50mg。
這類化合物可通過任何合適的途徑施藥，包括經腸地、腸胃外地和局部地或通過吸入器。合適的經腸施藥形式有供飲用的溶液、藥片或膠囊。合適的腸胃外形式有注射液或懸浮液。合適的局部施藥形式包括乳膏、洗劑等等，這類制劑的濃度范圍是0.01-10wt％，優選是0.1～1wt％。口服的適當單位劑量形式可包括1～50mg該化合物，通常是1～10mg。
本發明通過只是闡釋性的下述實施例而得以進一步描述，這些實施例參照附圖，其中

圖1示出式VIII的化合物的UV光譜；圖2示出式VIII的化合物的IR譜；圖3示出式VIII的化合物的FD-質譜；圖4示出式VIII的化合物的FD-質譜(加有LiI)，以及圖5示出式VIII的化合物在CDCl3中的質子NMR譜。
實施例實施例1菌株F/94-499709(DSM 10275)的鑒定應用下列培養基來鑒定菌株F/94-499709，其中的培養基組分以去離子水中的“重量/體積”表示，在121℃下加熱滅菌20分鐘。
MEA2％麥芽提取物，0.4％酵母提取物，2％瓊脂。
在培養皿中的MEA上進行點接種(point-inoculate)再在暗處培養后，菌株F/94-499709表現出如下特性生長的最佳溫度是24～30℃。培養14天后菌落的直徑在24℃下為25～32mm，在27℃下為30～37mm，在33℃下為7～15mm。高于37℃和低于13℃時，菌株F/94-499709一點也未生長。
在27℃的暗處生長的菌落一般是米色至淺黃色，呈頗為扁平至稍微凸起的形狀，其中央長出少量的、范圍有限的氣生菌絲體，它帶白色至淡灰色。徑向溝紋可變得很明顯，當從底部觀看時，深灰色中央區可變得突出。在陳化培養物時，菌落中央部分中的氣生菌絲體和底物菌絲體可變成暗灰色，而菌落邊沿保持米色至淺黃色。
顯微鏡檢查時未看到芽孢形成結構，于是暫時將菌株F/94-499709稱為不育菌絲體(mvcelium sterilum)。
實施例2菌株F/94-499709的發酵下列培養基和方法適用于通過菌株F/94-499709的發酵生產式VIII化合物的方法中。除非另有說明，所有培養基組分以去離子水中的“重量/體積”表示，并在121℃下加熱滅菌20分鐘。
PCM(預培養和中間培養基)2％麥芽提取物，0.4％酵母提取物，0.1％瓊脂。
PRM(生產培養基)2％可溶性淀粉，0.5％酵母提取物，2％葡萄糖，2％玉米浸泡液的濃縮液，0.5％胨，0.2％碳酸鈣。
預培養物的生產將2ml菌株F/94-499709的液氮種子懸浮液融化后，將它們接種入含200ml PCM的500ml錐形瓶，再在24℃下、200RPM的旋轉式搖蕩器上培養7天。
為了生產原代中間培養物，將各含200ml PCM的14個500ml錐形瓶各用5ml預培養物接種。
繼代中間培養物是通過用1.4升原代中間培養物接種兩個含PCM的50升發酵罐而生產的。在下列條件下發酵6天24℃，1升空氣/分鐘/升培養基，槳式攪拌器轉速為150RPM，以及0.5巴的壓力。為了生產式VIII的化合物及相關化合物，在含PRM的三個500升發酵罐中，各用13升繼代中間培養物接種。發酵條件如下21℃，1升空氣/分鐘/升培養基，槳式攪拌器轉速為100RPM逐漸加快達150RPM，以及0.5巴的壓力。96小時后，收獲和合并1500升該發酵產物以回收所需的式VIII的化合物和相關化合物。
實施例3從菌株F/94-499709中分離式VIII的縮肽將得自1500升發酵作用的培養液與1700升乙酸乙酯一起在Dispax反應器中均化并強烈攪拌3小時。借助于Westfalia分離器分離有機相。重復該提取步驟，合并有機相后減壓蒸發得2745g提取物。用40升甲醇/水混合物(9∶1)和40升環己烷通過三步提取使該提取物脫脂。合并甲醇部份并減壓蒸發至干得960g脫脂的提取物。將該提取物在裝有于甲醇溶液中15kg Sephadex LH20的柱上進行色譜分離，共得135g含式VIII的縮肽的級分。用該全部135g級分浸漬300g硅膠，再將浸漬了的硅膠加到1.5kg硅膠Merck(0.04～0.063mm)的柱頂，用1升1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的甲基叔丁基醚/環己烷，3升MTBE和3升95∶5的MTBE/甲醇進行色譜分離。收集1升級分并用HPLC和TLC分析。合并級分8和9再蒸發至干。從乙醚中結晶得21.9g純的式Ⅷ的縮肽。用色譜法在硅膠H Merck(750g)上按前述同樣方法進一步純化母液和級分10～13，得另一批晶狀式Ⅷ的環縮肽。從乙醚中純化后，測得該縮肽的熔點(mp)為143-146℃，旋光度[α]D20＝-233.9°(c＝0.908，甲醇)。在VCAM-1細胞ELISA中測得式Ⅷ的縮肽的IC50約為2nM。
分子式C51H83N7O9(938.2)在甲醇中的UV光譜λmax(ε′)＝290(5.4)，279(5.08)，220(38.1)，197(55.7)-參見圖1IR(KBr)譜示于圖2MS FAB譜示于圖3MS FAB譜(含LiI)示于圖4在CDCl3中的質子NMR譜示于圖5MTBE＝甲基叔丁基醚VCAM＝血管粘著分子實施例4式Ⅶ化合物的N1′-脫甲氧基衍生物的合成把4.9mg式Ⅷ化合物的溶液溶于3ml甲醇，加入8mg鈀/活性炭(10％)。在氫氣氣氛中將該混合物攪拌2小時，通入氬氣，過濾并蒸發得無色泡沫狀的標題化合物。用薄層色譜法和NMR光譜法分析該化合物，得如下結果。
TLC硅膠，甲苯/甲醇9/1，Rf＝0.28。
1H-NMR(3種構象異構體(conformer)56∶37∶7，以
標記，給出如下特征信號)8.72*(d，J＝10Hz，NH)；8.08*(s，br，吲哚NH)；6.97*，6.90°(2d，J=2Hz，吲哚H-2)；6.34°(d，J＝9.5Hz，NH)；6.00*(d，J＝6.5Hz，NH)；5.83′(d，NH)；5.32°(ddd，PrLeu α-H)；5.12°，5.08*(2q，J＝7Hz，乳酸Me)；4.50*(dd，MeLeu α-H)；4.10*(ddd，Leu α-H)；3.42(q，J＝7Hz，MeAla α-H)；3.43°，3.19°，3.12*，2.93*，2.53*，2.35°(6s，NMe)；1.54*，1.50°(2d，J＝7Hz，MeAla α-H)，1.38°，1.24*(2d，J＝7Hz，乳酸α-H)；0.57*，-0.01*(2d，J＝6.5Hz，Me)，-0.19*(ddd，Leu β-H).
實施例5式VIII化合物的N1′-甲基衍生物的合成將5mg實施例4的產物于0.5ml干DMF中的溶液與100ml碘代甲烷混合，再加入3mg雙(三甲基甲硅烷基)氨基化鈉于0.3mlDMF中的溶液。在室溫下攪拌該反應混合物達1.5h后，將該混合物傾入0.1M HCl水溶液，用乙酸乙酯提取，再在乙酸乙酯和飽和碳酸氫鹽水溶液間分配。用鹽水洗滌該有機相，在硫酸鈉上干燥后真空蒸發。用色譜法在硅膠上純化該粗產物(梯度甲苯/甲醇＝100/0.25～100/2.5)得無色泡沫狀標題化合物。用薄層色譜法和NMR譜分析該化合物，得下列結果。
TLC硅膠，甲苯/甲醇9/1，Rf＝0.40。
1H-NMR(2個構象異構體60∶40，以*0標記，給出下列特征信號)8.72*(d，J＝10Hz，NH)；6.79*，6.74°(2s，吲哚H-2)；6.35°(d，J＝9.5Hz，NH)；5.98*(d，J＝6.5Hz，NH)；5.32°(ddd，PrLeu α-H)；5.12°，5.08*(2q，J＝7Hz，乳酸Me)；4.50*(dd，MeLeuα-H)；4.06*(ddd，LeuαH)；3.73(s，吲哚NMe)；3.44°，3.19°，3.15*，2.93*，2.53*，2.35°(6s，NMe)；1.55*，1.51°(2d，J＝7Hz，MeAla α-H)，1.39°，1.24*(2d，J＝7Hz，乳酸α-H)；0.57*，-0.09*(2d，J＝6.5Hz，Me)，-0.32*(ddd，Leu β-H).
實施例65-[8，11-二異丁基-14-(1-甲氧基-1H-吲哚-3-基甲基)-7，13，19，20-四甲基-5，17-雙-(2-甲基-己基)-3，6，9，12，15，18，21-七氧-1-氧雜-4，7，10，13，16，19-六氮雜-環二十一烷-2-基]-戊-2-烯酸甲基酯將185mg式XV(見下文)的化合物和1.26g甲氧基羰基亞甲基三苯基正膦于甲苯中的溶液在室溫下攪拌1小時。然后真空蒸發掉溶劑，將殘余物在甲醇中的LH-20凝膠過濾柱上進行色譜法純化，真空蒸發含各級分的產物，進一步用色譜法在硅膠上純化(洗脫劑梯度甲苯/甲醇＝99.5/0.5～96/4)得無色固態泡沫體標題產物。將產物從苯中冷凍干燥。1H-NMR(CDCl3，特征信號，3個構象異構體53∶41∶6，以*0′標記)8.67*(d，J＝10Hz，C9AA NH)；7.87*(d，J＝10Hz，C9AA NH)；7.80°(d，J＝10Hz，NH)；7.69°(d，J＝10Hz，NH)；7.45-7.35(4d，MeMeOTrp H-4′，H-7′)；7.23*，7.22°(2m，MeMeOTrp，H-6′)；7.4(2m，MeMeOTrp H-5′)；7.06*，7.00°(2s，MeMeOTrp H-2′)；6.88°(ddd，J＝15Hz，J＝7Hz，-CH＝)；6.76*(ddd，J＝15Hz，J＝7Hz，-CH＝)；6.24°(d，J＝10Hz，Leu NH)；6.04*(d，J＝6Hz，Leu NH)；5.82°，5.78*(2d，J＝15Hz，＝CH-CO)；5.29°(ddd，MeAla a-H)；5.07-4.98(m，a-H)；4.92(dd，MeMeOTrp a-H)；4.86*(ddd，C9AA a-H)4.78*(dd，Leu a-H)；4.71(m，a-H)；4.48*(dd，MeLeu a-H)；4.17*(ddd，Leu a-H)；4.06*，4.03′，4.02°(3s，N-OMe)；3.75*，3.74°(2s，COOMe)；3.43°(s，N-Me)；3.20*(s，MeAla NMe)；3.17°(s，N-Me)；2..92*(s，MeMeOTrp N-Me)；2.52*(s，MeLeu N-Me)；2.47°(s，N-Me)；1.51*，1.48°(2d，J＝7Hz，MeAla β-Me)；1.04(d，J＝6....5Hz，MeLeu Me)；0.98-0.84(m)；0.63*(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；0.56′，0.39′(2d)；0.06*(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；-0.11*(ddd，Leuβ-CH).
按與實施例6中所述類似的方法可獲得其乙基酯。
式XV的起始原料
是已知的(WO96/03430)。在該式中取代基具有下列意義
i)-其中A被CSNH2取代的式I化合物的制備將其中A被CN取代的式I的相應化合物與硫衍生物、優選與二苯基二硫代膦酸反應，例如將該硫化合物的溶液與其中A被CN取代的式I化合物回流，或者j)其中的取代基同權利要求8中定義的優選的式I″p化合物的制備
將其中A″p表示α-羥基取代的丁酸殘基而該丁酸殘基被-CS-NH2γ取代的式I″p化合物與式XIII的α-鹵代羰基化合物反應，Hal-CH2-CO-R6XIII其中R6同權利要求8中定義，Hal表示鹵素，或者與式XIII化合物的縮醛反應，或者k)其中的取代基同權利要求7中定義的式I′p化合物的制備
將其中A′p表示α-羥基取代的丁酸殘基而該丁酸殘基被-CHOγ取代的I′p化合物與烷氧基羰基亞甲基三苯基正膦反應，或者1)-其中R3表示氫的式I化合物的制備從其中R3表示OCH3的式I化合物中除去甲氧基，或者m)-其中符號
表示單鍵的式I化合物的制備還原其中符號
表示雙鏈的式I化合物，或者n)-其中R3表示烷基或芐基的式I化合物的制備將這些基團引入其中R3表示氫的式I化合物，或者
實施例7式IX的化合物(即式I的化合物，其中A＝A″，R8＝噻唑-2-基，B＝B′，R1＝CH3，C＝C″，R3＝OCH3，
＝雙鍵，X＝X′，Y＝Y′)將400mg式I化合物(其中A＝A″、R8＝-CSNH2、B＝B′、R1＝CH3、C＝C″、R3＝OCH3、
＝雙鍵、X＝X′、Y＝Y′)和0.5ml氯乙醛(choroacetaldehyde)水合物于8ml干二甲基甲酰胺中的溶液與0.5g4分子篩一起攪拌并加熱至60℃達5小時。然后用乙酸乙酯稀釋該混合物，過濾后用0.1N HCl萃取。用鹽水洗滌該有機相，干燥，再真空蒸發。將粗產物在硅膠上進行色譜法純化(洗脫劑梯度甲苯/甲醇＝99.5/0.5～98/2)得固態泡沫體的標題化合物。
按與實施例7所述類似的方法獲得下列式I化合物(A＝A″、B＝B′、R1＝CH3、C＝C″、R3＝OCH3、
＝雙鍵、X＝X′、Y＝Y′)
按如下方法制備起始原料，即其中A＝A″、R8＝-CSNH2、B＝B′、R1＝CH3、C＝C′、R4＝OCH3、
＝雙鍵、X＝X′、Y＝Y′的式I化合物將1.1g式XI的化合物(A是α羥基取代的丁酸殘基，該殘基被-CNγ取代，其中B＝B′、R1＝CH3、C＝C′、R4＝OCH3、
＝雙鍵、X＝X′、Y＝Y′)和1.8g二苯基二硫代膦酸(diphenylphospinodithioicacid)于25ml異丙醇中的溶液加熱回流達7小時。將該反應混合物真空蒸發，溶于乙酸乙酯，再用碳酸氫鈉溶液和鹽水萃取。蒸發掉有機層后，將粗產物用色譜法在硅膠上純化(洗脫劑梯度甲苯/甲醇＝99.5/0.5～98/2)得無色泡沫體狀的起始化合物。
在VCAM-1細胞ELISA中測得實施例4～11的化合物具有類似于式VIII化合物的活性。
1H-NMR譜(CDCl3)實例7. 3個構象異構體46∶51∶3，以
標記8.70*(d，J＝10Hz，LeuPr NH)；7.89*(d，10Hz，NH)；7.83°(d，J＝9Hz，NH)；7.69，7.66(2d，J＝3.3Hz，old H)；7.58(d，J＝10Hz，NH)；7.53*，7.47°(2dm，J＝7Hz，MeTrpOMe H-4′)；7.38*，7.37°(2dm，J＝8Hz，MeTrpOMeH-7′)；7.22*，7.20°(2tm，MeTrpOMe，H-6′)；7.17，7.16(2d，J＝3.3Hz，噻唑-H)；7.09(s，MeTrpOMe H-2′)；7.03*，7.00°(2dd，MeTrpOMe H-5′)；6.98°(s，MeTrpOMe H-2′)；6.18°(d，J＝10Hz，Leu NH)；6.03*(d，J＝7Hz，Leu NH)；5.80′(d，J＝10Hz，Leu NH)；5.30°(ddd，LeuPra-H)；5.11*(dd，羥基丁酸a-H)；5.05-4.98(m，a-H)；4.94(dd，MeTrpOMea-H)；4.86°(ddd，LeuPra-H)；4.73(m，a-H)；4.49*(dd，MeLeu a-H)；4.23*(ddd，Leua-H)；4.02，4.00(2s，N-OMe)；3.84°(m，a-H)；3.59-3.40(m)；3.38(q，J＝7Hz，MeAlaa-H)；3.33(s，N-Me)；3.2-2.85(m)；3.21(s，N-Me)；3.07(s，N-Me)；2.93*(s，MeTrpOMe N-Me)；2.53*(s，MeLeu N-Me)；2.49(s，N-Me)；2.43-2.28(m)；2.18(m)；1.98(m)；1.81(m)；1.7-1.1(m)；1.48，1.46(2d，J＝7Hz，MeAlaβ-Me)；1.06*(d，J＝6.5Hz，MeLeu Me)；1.00-0.84(m)；0.61*(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；0.54′(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；0.35′(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；0.10*(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；-0.12*(ddd，Leuβ-CH).8. 3個構象異構體47∶48∶5，以
標記8.64*(d，J＝10Hz，LeuPr NH)；7.82(2d，10Hz，NH)；7.63°(d，J＝10Hz，NH)；7.23，7.17，7.08，6.97(4t，芳環H)；7.32，7.28(2s，噻唑-H)；7.07(s，MeTrpOMe H-2′)；6.81(s，MeTrpOMe H-2′)；6.22°(d，J＝10Hz，Leu NH)；6.07*(d，J＝7Hz，Leu NH)；5.80′(d，J＝10Hz，Leu NH)；5.29°(ddd，LeuPra-H)；5.20*(dd，MeTrpOMea-H)；5.12°(dd，羥基丁酸a-H)；5.03°(ddd，LeuPra-H)；4.97*(ddd，LeuPra-H)；4.85(m，羥基丁酸+LeuPra-H)；4.71°(ddd，Leu a-H)；4.52*(dd，MeLeu a-H)；4.21*(ddd，Leua-H)；4.02，3.90(2s，N-OMe)；3.34(s，N-Me)；3.22(s，N-Me)；3.02(s，N-Me)；2.93(s，N-Me)；2.53(s，N-Me)；2.48(s，N-Me)；1.43，1.42(2d，J＝7Hz，MeAlaβ-Me)；1.06*(d，J＝6.5Hz，MeLeu Me)；0.62*(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；0.10*(d，J＝6.6Hz，Leu Me)；-0.04*(ddd，Leuβ-CH).9. 3個構象異構體42∶52∶6，以
標記8.67*(d，J＝10Hz，LeuPr NH)；7.83，7.80(2d，10Hz，NH)；7.63°(d，J＝10Hz，NH)；7.55，7.42，7.39，7.36(4d，MeTrpOMe芳環)；7.22，7.18，7.05，6.97(4dd，MeTrpOMe H-5′，H-6′)；7.06°(s，MeTrpOMe H-2′)；6.88*(s，MeTrpOMe H-2′)；6.22°(d，J＝10Hz，Leu NH)；6.02*(d，J＝7Hz，Leu NH)；5.77′(d，J＝10Hz，Leu NH)；5.30°(ddd，LeuPr a-H)；5.21*(dd，MeTrpOMe a-H)；5.0(m，a-H)；4.85(m，a-H)；4.65(ddd，Leu a-H)；4.49*(dd，MeLeu a-H)；4.13*(ddd，Leu a-H)；4.03，3.98(2s，N-OMe)；3.70(m)；3.55(m)；3.45(q，J＝7Hz，MeAla a-H)；3.37，3.20，3.11，2.93，2.52，2.43(6s，N-Me)；2.73(m，四氫苯并噻唑)；1.50，1.48(2d，J＝7Hz，MeAlaβ-Me)；1.04*(d，J＝6.5Hz，MeLeu Me)；0.58*(d，J＝6.6Hz，LeuMe)；0.50′(d，J＝6.6Hz，LeuMe)；0.30′(d，J＝6.6Hz，LeuMe)；0.03*(d，J＝6.6Hz，LeuMe)；-0.22*(ddd，Leuβ-CH).10. 3個構象異構體44∶51∶5，以
標記8.66*(d，J＝10Hz，LeuPr NH)；7.83，7.81(2d，10Hz，NH)；7.63°(d，J＝10Hz，NH)；7.57*，7.43°，7.38*，7.36°(4d，J＝8Hz，吲哚-H)；7.21*，7.18°，7.05，6.97(4t，吲哚-H)；7.06*(s，MeTrpOMe H-2′)；6.88°(s，MeTrpOMeH-2′)；6.70°，6.69*(2q，J＝1Hz，噻唑-H)；6.23°(d，J＝10Hz，Leu NH)；6.05*(d，J＝7Hz，Leu NH)；5.80′(d，J＝10Hz，Leu NH)；5.29°(ddd，LeuPra-H)；5.11°(dd，羥基丁酸a-H)；5.01(m)；4.97(dd，a-H)；4.85(m，2x a-H)；4.69°(ddd，Leu a-H)；4.57′(dd，a-H)；4.48*(dd，MeLeu a-H)；4.16*(ddd，Leu a-H)；4.03，3.98(2s，N-OMe)；3.43(q，J＝7Hz，MeAla a-H)；3.37，3.20，3.10，2.92，2.52，2.46(6s，N-Me)；2.40，2.39(2d，J＝1Hz，Me-噻唑)；1.48，1.47(2d，J＝7Hz，MeAla β-Me)；1.05*(d，J＝6.5Hz，MeLeu d-Me)；0.60*(d，J＝6.6Hz，Leu d-Me)；0.52′，0.33′(2d，J＝6.5Hz Leu d-Me)；0.05*(d，J＝6.6Hz，Leu d-Me)；-0.14*(ddd，Leuβ-CH).11. 3個構象異構體47∶50∶3，以
標記8.69*(d，J＝10Hz，LeuPr NH)；7.79，7.78(2d，10Hz，NH)；7.65°(d，J＝10Hz，NH)；7.51*，7.41°，7.39*，7.38°(4d，J＝8Hz，吲哚-H)；7.23*，7.20°，7.07，7.00(4t，吲哚-H)；7.04*(s，MeTrpOMe H-2′)；6.85°(s，MeTrpOMeH-2′)；6.71°*(s，噻唑-H)；6.25°(d，J＝10Hz，Leu NH)；6.04*(d，J＝7Hz，Leu NH)；5.80′(d，J＝10Hz，Leu NH)；5.30°(ddd，LeuPr a-H)；5.10°(dd，羥基丁酸 a-H)；5.02(m)；4.97(dd，a-H)；4.85(m，2x a-H)；4.72°(ddd，Leu a-H)；4.60′(dd，a-H)；4.50*(dd，MeLeu a-H)；4.17*(ddd，Leu a-H)；4.04，4.00(2s，N-OMe)；3.48(q，J＝7Hz，MeAla a-H)；3.41，3.21，3.17，2.92，2.53，2.47(6s，N-Me)；0.97，0.96(2s，t-Bu-噻唑)；1.50，1.49(2d，J＝7Hz，MeAla β-Me)；1.06*(d，J＝6.5Hz，MeLeu d-Me)；0.62*(d，J＝6.6Hz，Leu d-Me)；0.53′，0.35′(2d，J＝6.5Hz Leu d-Me)；0.07*(d，J＝6.6Hz，Leu d-Me)；-0.08*(ddd，Leuβ-CH).A)3個構象異構體44∶30∶26，以
標記8.85(d，CSNH2)；8.60(d，LeuPr NH)；8.17(d，CSNH2)；8.03，8.00(2d，NH)；7.88(m，CSNH2)；7.6-7.1(芳m)；6.28*(d，10Hz，LeuNH)；6.07°(d，7Hz，Leu NH)；5.87′(d，9Hz，Leu NH)；5.26*(ddd，LeuPr a-H)，5.22(dd，羥基酸 a-H)；5.15-4.95，5.08*(dd，羥基酸 a-H)；4.83°(ddd，LeuPr a-H)；4.50*(ddd，Leu a-H)；4.37*(dd，MeTrpOMe a-H)；4.25°(ddd，Leu a-H)；4.09，4.05，4.03*(3s，OMe)；3.89(m，a-H)；3.65*，3.63′，3.52°(3q，7Hz，MeAla a-H)；3.57(m)，3.17，3.16，3.15，3.22，3.20，3.05，2.92，2.55，2.53(9s，N-Me)；1.8-1.1；1.05(d，7Hz)；0.99-0.82，0.60°，0.55′，0.23′，0.17°(4d，7Hz，Leu d-Me)；-0.15°，-0.17′(ddd，Leu b-CH).PKF285-916(噻唑)
生物活性在分析中測試本發明的化合物的活性以測定其細胞毒性和對于ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白表達、細胞增殖的抑制作用，以及對于TNF釋放的抑制作用和相應的細胞毒性分析。
分析方法如下HaCaT細胞，即自發轉化的、具有正常角質形成細胞的高度保守性表型分化特性的非致瘤性人角質形成細胞系(Boukamp等，1988，J.Cell Biol.106，761-771)，被用作細胞增殖分析和ICAM-1細胞Elisa。
A.ICAM-1細胞-ELISA分析I.角質形成細胞ICAM-1細胞Elisa用于測定對ICAM-1表達的抑制作用的ICAM-1細胞Elisa基本上如Winiski和Foster描述的(1992，J.Invest.Dermatol.，99，48-52)那樣。將HaCaT細胞接種于96孔微量滴定板(2×104個細胞/孔，于下列培養基中DMEM，其中含5％FCS，100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉)，待長到鋪滿后在新鮮的試驗培養基(如上述培養基，但其中含0.5％而不是5％FCS)中培養約24小時，其中加有或不加IFN-γ/TNF-α刺激培養基(試驗培養基+1000U/ml IFN-γ/3ng/ml TNF-α)，二者都分為存在或不存在試驗化合物的情況。然后洗去培養基，用1％多聚甲醛固定該細胞單層。將該單層與飽和量的初級(小鼠抗ICAM-1單克隆)抗體和次級(山羊抗小鼠過氧化物酶綴合)抗體一起培養。隨后的過氧化物酶反應中應用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作底物，生成不溶性的有色產物，它容易用標準的微量滴定板讀出器測定。
II.細胞毒性的測定當完成測定ICAM-1的AEC反應之后，用PBS(200mL)漂洗該HaCaT單層，從板上傾掉PBS，然后將板在毛巾紙頂部輕拍至干以除去過剩的液體。用濕紙巾輕輕地擦干微量滴定板底面，然后再用干紙巾擦，在492nm處讀取吸光度。在這些單層變干之前，往每個孔中加入0.1ml 0.1％結晶紫于PBS中的溶液(先濾過0.2mm濾器)。接著在室溫下將這些板培養10分鐘，用PBS充分洗滌5次，按前述方法除去過剩的流體，再在這些單層變干之前又一次在492nm處讀取吸光度。將染色前后的光密度相減得因為結晶紫染色而產生的值，從而與孔中存在的細胞單層量相關聯。應用這些值來校正AEC值。
B.內皮細胞VCAM-1、ICAM-1和E-選擇蛋白細胞-Elisa分析該分析基于96孔細胞Elisa方法，其中應用人微血管內皮細胞系HMEC-1和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)。用試驗化合物對細胞預處理4小時，然后用TNFα刺激6-16小時，再用多聚甲醛固定，隨后用間接的免疫過氧化物酶染色法估測VCAM-1、ICAM-1或E-選擇蛋白表達。細胞毒性效果的測定是這樣進行的，即通過計數暴露于試驗物質后的相對細胞數(吉姆薩核染液)，與對照孔(只有溶劑和培養基)比較。如果化合物表現為≥50％VCAM-1、I-CAM-1或E-選擇蛋白抑制而細胞損失＜25％，則將它們記為陽性。
方法學I.細胞系VCAM-1和ICAM-1分析中應用無限增殖化(SV-40病毒大T抗原)人微血管內皮細胞系(HMEC-1；Ades等，J.Invest.Dermatol.99683-690，1992)。HMEC-1細胞組成性地表達低水平的、被炎癥介質上調的ICAM-1。然而，它們只在細胞因子刺激之后表達VCAM-1。進行了劑量—響應實驗和時間過程實驗以測定誘導VCAM-1和ICAM-1表達的最佳條件。
II.生長條件使HMEC-1細胞在標準條件(37℃，5％CO2)下生長于T-75燒瓶(Nunc)中，生長密度為1.5×106個細胞/ml培養基(CM＝內皮細胞基本培養基[EBM；Clonetics]，補加有10％FCS、10ng/ml人EGF(Boehringer)、1mg/ml氫化可的松(Sigma#0888)、2.2g/l NaHCO3、15mM Hepes、0.11g/l丙酮酸鈉、4mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素)。在適度胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶+0.1％EDTA，達8min)和重懸浮之后，每2-3天以1∶3分割比再接種細胞。
III.VCAM-1和ICAM-1細胞-Elisa將96孔平底微量滴定板預涂上牛纖連蛋白(FN；Sigma#F1141)，然后以2×104個細胞/孔的密度接種在EBM生長培養基中并培養一夜。第二天，將該培養基(CM)先用200ml/孔的EBM分析培養基(CM中補加5％而不是10％FCS)置換，隨后用180ml含下列3組物質之一的培養基置換(1)適當濃度的試驗化合物，(2)相應濃度的溶劑/甲醇萃取的培養基，或(3)只有EBM分析培養基，并在37℃下培養4hr。每個96孔分析都重復一次。再加入20ml濃細胞因子溶液(2000U/ml TNFα)刺激這些細胞，接著在37℃下培養16hr。
然后將該細胞單層用含1％多聚甲醛的EBM培養基洗滌，室溫(RT)下在2％的多聚甲醛中固定15min，再用PBS漂洗數次。從細胞中除去PBS，將該單層在含10％正常山羊血清(NGS)的PBS中培養30min。用100ml/孔的抗VCAM-1或ICAM-1單克隆抗體置換該NGS溶液，再在4℃下培養一夜。然后除去該mAb溶液，用PBS將這些細胞漂洗數次，接著在RT下與含10％NGS的PBS一起培養30-60min。除去該NGS溶液，添加100ml辣根過氧化物酶綴合的山羊F(Ab′)2抗小鼠IgG抗體(Tago；在含5％NGS的PBS中稀釋至1∶500)，在RT下將這些板培養1hr。然后除去次級抗體，用PBS漂洗細胞，再用150ml/孔新制備并過濾了的AEC溶液(3-氨基-9-乙基咔唑；Sigma)代替PBS，接著將這些板在RT下培養45-60min。除去過氧化物酶底物，用PBS漂洗細胞。在微量滴定板讀出器上讀取550nm處的AEC吸光度并用690nm處的“空白”或參比值修正。
IV.E-選擇蛋白分析用新分離的HUVEC進行該E-選擇蛋白分析，基本上按VCAM-1或ICAM-1分析中所述方法，但采用更短時間的TNFα刺激(6-8小時)。
V.細胞毒性的測定(基于核染色劑的細胞損失)
用95％乙醇置換PBS達20min(每10min變更一次)使內皮細胞脫色，其間用顯微鏡檢法來控制。然后在蒸餾水(Aquadest)中漂洗這些細胞，在RT下用33％Giemsa溶液于Aquadest中覆蓋該細胞單層達5min。再用Aquadest洗滌這些孔，隨后風干至少15min。應用顯微鏡檢法來檢查只有核被染色，而胞質基本上沒染色。在微量滴定板讀出器上讀取550nm處的Giemsa吸光度值，并以690nm處的“空白”值(沒有細胞的幾排孔)修正。
VI.數據評估組成性VCAM-1或E-選擇蛋白表達的AEC值(未刺激的對照孔)基本上等于同種型配對的對照mAb的值并代表本底染色劑(background stain)。在每個96孔板中，從每個細胞因子刺激的組(EBM和溶劑對照物，以及試驗物質)的平均AEC值減去平均固有值，所得值表示上調的ICAM-1和誘導型VCAM-1或E-選擇蛋白細胞粘著分子(CAM)表達(稱為AEC-CAM)。然后將每個AEC-CAM值除以相應的平均Giemsa值，由所得值可估測對給定的細胞密度、基于核數的CAM相對表達水平(稱為AEC∶Giemsa比)。
AEC(刺激的)-AEC(未刺激的)＝AEC-CAMAEC-CAM/Giemsa＝AEC∶Giemsa比因此，“實際的”CAM IC50值是通過將試驗物質的AECGiemsa值與刺激的對照物(EBM，溶劑)的值進行比較而測定的。然后將這些值相對于只有Giemsa的IC50值進行分析。嚴格的判據可確定CAM抑制作用對細胞毒性(Giemsa)曲線是否表明所希望的“真正”成功。
C.HaCaT細胞增殖分析將HaCaT細胞在其中補加有下列物質的DMEM(Gibco#074-02100)中培養2.2g/l NaHCO3、0.11g/l丙酮酸鈉、15mM Hepes、5％胎牛血清(FCS)、青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100mg/ml)以及谷氨酰胺(將最終濃度增大4mM)。為進行該增殖分析，采用胰蛋白酶消化使細胞脫附，懸浮于新鮮培養基中，再接種入96孔微量滴定板，最終密度為4000個細胞/0.2ml/孔。24小時(第0天)后，用含梯度濃度的試驗化合物的新鮮培養基置換該培養基。在37℃/5％CO2下培養3天后，通過比色分析法測定與溶劑對照物相比細胞增殖的程度，該分析法中應用染料sulforhodamine B測定相對細胞量(Ske-han等，1990，J.Natl.Cancer Inst.82，1107-1112)。“起始細胞數”是通過測定第0天相對細胞量而測定的。將結果表示為％抑制＝100-％對照吸光度(其中溶劑對照物＝100％)，它代表3次測定的平均值±標準偏差。用半對數法描繪劑量—響應曲線，再通過線性內插法確定半最大抑制所需的濃度(IC50)。以“起始細胞數”表示沒有細胞凈損失時的最大抑制，它通常為90～98％。
D.TNF釋放的抑制I.
單核細胞的制備應用來自健康志愿者的外周血，采用Hansell等的ficoll-hypaque密度分離法(J.Imm.Methods(1991)145∶105.)；使用的細胞濃度為于RPMI1640+10％FCS中105個細胞/孔。先用系列稀釋的試驗化合物在37℃下培養細胞達30分鐘，隨后加入IFNγ(100U/ml)和LPS(5mg/ml)，再進一步培養3小時。然后在1400RPM下離心10min終止培養。應用商購的ELISA(In-notest hTNFα，得自Innogenetics N.V.，Zwijnaarde，比利時)測定上清液中的TNFα。在0～10mM的濃度下測試這些化合物。例舉的式I化合物，尤其是式Ip、I′p、I″p、VII、IX和X的優選化合物，在該分析中抑制TNF釋放的IC50從約5至高達約nM。
II.細胞毒性對THP1細胞(5×104個/孔)測定細胞毒性，在IFNγ(100U/ml)和LPS(5mg/ml)存在下，分別存在和不存在試驗化合物時，于37℃下將這些細胞培養24小時。采用比色讀出器(MTT)估測活細胞和死細胞百分數，如Mosman在J.Imm.Methods(1983)65∶55中所述，它是通過測定活細胞中的線粒體脫氫酶而進行分析的。該分析中測知本發明的優選化合物一般具有較低的細胞毒性，例如IC50從約100至約1000nM。
權利要求
1.呈游離態、鹽或酯形式的式I的環縮肽，
其中A是乙醇酸殘基，它任選被H、甲基、乙基、丙基或乙烯基α取代，所述甲基、乙基、丙基或乙烯基任選被鹵素、烷氧基、任選保護的羥基或氨基、CSNH2、COOR2、乙烯基、-C≡CH或噻唑取代，其中R2是H或低級烷基，任選被烷基、鹵素、環烷基、任選取代的噻唑、COOR2或-C≡CH取代，其中R2同上述定義；B是α-氨基-γ-甲基取代的辛酸殘基；R1是氫或甲基；C是色氨酸殘基或式II的N-甲基-色氨酸殘基，
其中R3表示氫、烷氧基、烷基或芐基，R4表示氫或鹵素，R5表示氫或甲基，
表示單鍵或雙鍵；X是α-氨基取代的(C2～C14)羧酸殘基，以及Y是α-氨基-或N-甲基-α-氨基取代的(C2～C10)羧酸殘基。
2.權利要求1的環縮肽，其中A是乙醇酸殘基，它被H、甲基、乙基或丙基α取代，其中的甲基、乙基或丙基任選被氨基、羥基、氯、烷氧基、任選取代的噻唑、任選取代的乙烯基、環丙基、CSNH2或-C≡CH取代。
3.權利要求1或2的環縮肽，其中C是式II的N-甲基色氨酸殘基，其中R3表示氫、(C1～C4)烷氧基特別是甲氧基、或烷基，R4表示氫或鹵素。
4.權利要求1、2或3的環縮肽，其中X是α-氨基-β-或γ-(C1～C4)烷基特別是甲基取代的辛酸殘基或丁酸殘基。
5.權利要求1至4中任一項的環縮肽，其中Y是N-甲基丙氨酸殘基或N-甲基纈氨酸殘基。
6.式Ip的化合物
其中Ap是任選被H、乙基或甲基α取代的乙醇酸殘基；Bp是α-氨基-γ-甲基取代的辛酸殘基；R1p是氫或甲基；Cp是色氨酸殘基或N-甲基色氨酸殘基，它任選被N′-(C1～C4)烷氧基取代；Xp是α-氨基取代的(C2～C14)羧酸殘基；以及Yp是α-氨基-或N-甲基-α-氨基取代的(C2～C10)羧酸殘基。
7.式I′p的化合物
其中Bp、R1p、Cp、Xp和Yp同權利要求6中的定義，而A′p是α羥基取代的丁酸殘基，該殘基被式VI的基團γ取代，
其中R2表示低級烷基，例如C1～4低級烷基。
8.式I″p的化合物
其中Bp、R1p、Cp、Xp和Yp同權利要求6中的定義，而A″p是α羥基取代的丁酸殘基，該殘基被式VII的基γ團取代，
其中R6表示氫、低級烷基或苯基，或者與噻唑基環的5位構成一個碳環。
9.呈游離態或鹽形式的式VII、IX或X的環縮肽
10.如上文中所述，作為DSM 10275保藏的真菌株F/94-499709或其突變體或衍生物。
11.制備權利要求1的化合物的方法，它包括在營養培養基中培養菌株F/94-499709(DSM 10275)或者其突變體或衍生物或者類似真菌菌種，再從其中回收該化合物。
12.具有基本上如圖1～5中所示光譜特征的化合物。
13.制備權利要求1的化合物的方法，它包括a)-其中A被COOR2取代的式I化合物的制備將其中A被CN取代的式I的相應化合物與優選是醇的親核試劑反應，應用合適的堿性或酸性催化劑，優選應用鹽酸，反應在優選為醚的有機溶劑中進行，或者b)-其中A被烷氧基甲基取代的式I化合物的制備將其中A被-CH2-OH取代的式I的相應化合物與例如烷基鹵化物或重氮化合物的烷基化化合物反應，可加或不加催化劑，或者c)-其中A被COOR2取代的式I化合物的制備應用標準方法酯化其中A被COOH取代的式I的相應化合物，優選通過用例如亞硫酰氯將它轉化為酰基氯，再用適當的醇在存在或不存在酸結合劑時進行處理，或者d)-其中A被CH2OH取代的式I化合物的制備在有機溶劑中，用金屬氫化物或硼氫化物、優選用甲硼烷二甲硫復合物還原其中A被COOR2取代的式I的相應化合物，或者e)-其中A被任選取代的乙烯基取代的式I化合物的制備將其中A被CHO取代的式I的相應化合物與維悌希試劑反應，或者f)-其中A被CH2NH2取代的式I化合物的制備還原其中A被CH2N3取代的式I的相應化合物，或者g)-其中A被C≡CH取代的式I化合物的制備將其中A被CH＝CBr2取代的式I的相應化合物進行脫氫反應，或者h)-其中A被環丙基取代的式I化合物的制備將其中A被乙烯基取代的式I的相應化合物與重氮甲烷反應，或者i)-其中A被CSNH2取代的式I化合物的制備將其中A被CN取代的式I的相應化合物與硫衍生物、優選與二苯基二硫代膦酸反應，例如將該硫化合物的溶液與其中A被CN取代的式I化合物回流，或者j)其中的取代基同權利要求8中定義的優選的式I″p化合物的制備
將其中A″p表示α-羥基取代的丁酸殘基而該丁酸殘基被-CS-NH2γ取代的式I″p化合物與式XIII的α-鹵代羰基化合物反應，Hal-CH2-CO-R6XIII其中R6同權利要求8中定義，Hal表示鹵素，或者與式XIII化合物的縮醛反應，或者k)其中的取代基同權利要求7中定義的式I′p化合物的制備
將其中A′p表示α-羥基取代的丁酸殘基而該丁酸殘基被-CHOγ取代的I′p化合物與烷氧基羰基亞甲基三苯基正膦反應，或者1)-其中R3表示氫的式I化合物的制備從其中R3表示OCH3的式I化合物中除去甲氧基，或者m)-其中符號
表示單鍵的式I化合物的制備還原其中符號
表示雙鏈的式I化合物，或者n)-其中R3表示烷基或芐基的式I化合物的制備將這些基團引入其中R3表示氫的式I化合物，或者o)-其中R4表示鹵素的式I化合物的制備將其中R4表示氫的式I化合物進行鹵化，或者p)-其中R3表示烷氧基且符號
表示雙鍵的式I化合物的制備將其中R3表示氫且符號
表示單鍵的式I化合物與堿化鎢酸鹽和過氧化氫反應，再將該N-羥基-吲哚中間體進行烷基化，且需要的話，分離式I的化合物。
14.制備權利要求1的化合物的方法，它包括線型肽或縮肽的環化，其中的線型肽或縮肽包含以適當順序連接在一起的、如權利要求1中定義的酸殘基A、B、R1Leu、Leu、C、X和Y。
15.權利要求1的化合物的治療應用。
16.用作藥物的權利要求1的化合物。
17.包括治療有效量的權利要求1的化合物的治療組合物。
18.權利要求1的化合物在制備用于治療或預防疾病的藥劑方面的應用，其中的疾病涉及粘著分子表達水平的升高和/或是由TNF介導的。
全文摘要
式(Ⅰ)的環縮肽,其中A、B、R
文檔編號C07K1/02GK1202904SQ96198477
公開日1998年12月23日 申請日期1996年11月20日 優先權日1995年11月21日
發明者M·德雷福斯, T·費爾, C·A·福斯特, D·蓋爾, B·奧伯哈瑟 申請人:諾瓦提斯公司