專利名稱：包含具有抗體Fc鏈的穩定、有活性人OB蛋白的結合物的組合物及方法
技術領域：
本發明涉及在高濃度和生理pH或接近生理pH條件下穩定、有活性的人OB蛋白組合物。還提供相關的組合物、制造方法和應用上述組合物的方法。
背景技術：
盡管肥胖的分子基礎大體說來未知，但鑒別出的“OB基因”和所編碼的蛋白(“OB蛋白”)給應用于調節機體脂肪沉積的機制投入了一些曙光。張等，自然372425-432(1994)；也見修改文章，自然374479(1995)。PCT公開號WO 96/05309，1996年2月22日出版，題目“體重調節劑，相應的核酸和蛋白，以及其診斷和治療的用途”完整地公布了OB蛋白和相關的組合物及方法，在此引入僅作參考。人OB蛋白的氨基酸序列在WO 96/05309專利(在此引入僅作參考)的SEQ ID NOS4和6中(該出版公告的第172-174頁)公布，成熟蛋白的第一個氨基酸殘基在22位，是纈氨酸殘基。成熟蛋白為146個殘基(或者如果49位的谷氨酰胺缺乏為145個，SEQ ID NO6)。
OB蛋白在ob/ob突變小鼠(小鼠肥胖是由于產生OB基因的產物缺乏)以及正常、野生型小鼠體內均具有活性。該生物學活性表明OB蛋白在諸多事件中，OB蛋白在體重減少中體現了其生物學活性。一般見，Barinaga，“肥胖”蛋白使小鼠苗條。科學269475-476(1995)和Friedman“體重控制的入門”自然385119-120(1997)。例如，已知在ob/ob突變小鼠中，施用OB蛋白導致血清胰島素水平和血清葡萄糖水平的降低。也已知施用OB蛋白導致體內脂肪下降。該現象在ob/ob突變小鼠以及非肥胖的正常小鼠中均觀察到。Pelleymounter等，科學269540-543(1995)，Halaas等，科學269543-546(1995)。也見Campfield等，科學269546-549(1995)(外周和中樞施用微克劑量的OB蛋白降低ob/ob和食物誘導肥胖的小鼠的食物吸收和體重，但在db/db肥胖小鼠中沒有這些作用)。這些報道中沒有觀察到毒性，甚至在最高劑量下也沒有。
為制備給人體注射的藥用組合物，已經觀察到人該氨基酸序列在生理pH下相對高的濃度是不溶解的，例如每毫升液體大約超過2mg活性蛋白的濃度。在每公斤體重毫克蛋白的劑量范圍，如0.5或1.0mg/kg/天或更低，可預期是給較大的哺乳動物如人注射用的治療有效量。為避免大體積注射增加蛋白濃度是必要的，大體積會使患者不舒適或引起可能的疼痛。
隨著重組DNA技術的進展，在蛋白制劑中治療用途的重組蛋白的可獲得性也取得了進展。描述蛋白修飾和融合蛋白的綜述文章見Francis，生長因子聚焦，34-10(1992)。
上述的一種修飾是使用免疫球蛋白的Fc區。抗體包括功能上互相獨立的二個部分，結合抗原熟知為“Fab”的可變結構域和熟知的“Fc”不變區結構域，不變結構域提供與效應器如補體或吞噬細胞連接的功能。免疫球蛋白Fc部分具有長血漿半衰期，而Fab是短壽的。Capon等，自然337525-531(1989)。
用Fc結構域構建治療蛋白提供較長的半衰期或摻入如Fc受體結合、蛋白A結合、補體固著和胎盤轉移的功能，所有這些功能位于免疫球蛋白的Fc蛋白。同前，例如IgG1抗體的Fc區被融合到CD30-L的N-末端，CD30-L與CD30受體結合，CD30受體在霍金森氏病腫瘤細胞、退行性淋巴瘤細胞、T細胞白血病細胞和其他惡性細胞類型中表達。見美國專利號5,480,981。為了增加細胞因子短循環半衰期，抗炎和抗排斥的藥物IL-10與鼠Fcγ2a融合。鄭，X等，免疫學雜志，1545590-5600(1995)。研究還評價應用腫瘤壞死因子受體與人IgG1的Fc蛋白連接物治療患敗血性休克的病人。Fisher C等，新英格蘭醫學雜志，3341697-1702(1996)；Van Zee K.等，免疫學雜志，1562221-2230(1996)。Fc也和CD4受體融合以產生治療愛滋病的治療蛋白。見，Capon等，自然337525-531(1989)。另外，白介素2N-末端也與IgG1或IgG3的Fc區融合以克服白介素2的短半衰期和其循環毒性。見Harvill等，免疫技術195-105(1995)。
對胰島素來說，已經報道了其懸浮制備物。但應用胰島素的那些病情，對可用于任何其他蛋白包括OB蛋白的那些病情沒有預測性。胰島素是一種相當小的蛋白，具有獨特的物理和化學特性，這些特性對確定配制制劑的條件是重要的。Brange，Galenics的胰島素，Springer-Verlag 1987描述了胰島素懸浮液(p.36)；也見，Schlichtkrull等，具有延長效應的胰島素制備物729-777頁，在Hassellblatt等實驗藥理學手冊新系列XXXII-1/2卷Springer-Verlag Berlin，Heidelburg，紐約(1975)。
迄今為止，沒有報道在生理pH下至少約2mg/ml濃度的人OB蛋白的穩定制備物，而更進一步，未見報道至少約50mg/ml或以上穩定濃度的活性人OB蛋白。再者，冷凍或凍干形式可用于改善自身穩定性，但比本發明描述的現成可用型懸浮液形式更不合乎需要。冷凍形式需要穩定冷凍溫度下的貯存條件，由于用戶級冰箱和冷凍器的去霜循環，穩定冷凍溫度是不可能的。再者，凍干形式必須稀釋和混合，是不方便的，可能損害病人的順從性。從生產商的觀點看，冷凍液的制造，貯存和船運花費昂貴，比現成可用型制劑的銷售方式需要更多的監管工作。另外，為凍干制劑制造或否則制取可得到的合適稀釋劑比不需要上述稀釋劑的方法花費更多，并且效率更差。通過小體積注射傳輸含活性OB蛋白的人藥用組合物的濃縮形式，一直來有需求。本發明完全滿足這些需求。
發明概述本發明源于以下觀察，某些懸浮制劑允許在生理pH下至少大約2mg/ml的濃度制備穩定的OB蛋白。至于在此所用的術語“生理pH”指的是大約6.0至大約8.0的pH。應用上述組合物允許OB蛋白治療藥以相對小體積傳輸。正如本發明進一步披露的內容，沉淀藥物的應用使得制備的人OB蛋白懸浮液具有如下特性1.與以溶液形式相同的人OB蛋白相比較，改善了在生理pH下的穩定性。在如下操作性實施例中闡明的是在10mg/ml或較高濃度的人OB蛋白懸浮液，當與溶液中允許溶解的最高pH下相同濃度相比較時(人OB蛋白的天然形式在pH4時溶解，這不是生理pH)，在pH7下具有較好的HPLC(高壓液相層析)圖譜。以下還闡明的是在大約pH7下濃度為5mg/ml的Fc-OB融合蛋白懸浮液，該結果顯示與可比較的Fc-OB融合蛋白溶液相比的貯存條件下較少的降解產物。
2.與溶液形式相同的人OB蛋白相比較持續的注射時間釋放特征。下面的操作性實施例顯示了，使用本發明高度濃縮的人OB蛋白懸浮液的持續釋放效應。上述持續釋放效應對該材料的活性維持相對較長的時期是有益的，因此與溶液中的人OB蛋白相比較具有相對較高的效力而需要注射的次數更少。
因此，本發明的一個目的是一種在生理pH下活性人OB蛋白的穩定制備物，其具有的濃度至少大約2mg蛋白/ml。例如，提供一種濃度至少2.0mg/ml和pH為7.0的活性人OB蛋白穩定制備物。濃度的上限是對人施用有效的那種懸浮液形式，正如下面所述，操作性實施例提供在生理pH下(例如，pH6.0～8.0)濃度高達100mg/ml。
在另一方面，本發明涉及一種穩定的人活性OB蛋白的制備物，其pH范圍大約6.0～8.0，濃度至少約10mg/ml。
仍在另一方面，本發明涉及一種通過連接免疫球蛋白Fc區衍生的人活性OB蛋白的穩定制備物，其濃度至少約0.5mg/ml，pH大約6.0～8.0。更具體而言，提供了大約pH7.5，濃度5mg/ml至50mg/ml的活性Fc-OB融合蛋白的穩定制備物。
仍在其他方面，本發明提供穩定的人活性OB蛋白的制劑，其濃度為2mg蛋白/ml或更高，pH6.5至pH7.5。更具體而言，提供了pH7.0濃度為20mg/ml至100mg/ml的穩定人活性OB蛋白制劑。
在另一方面，本發明提供濃度為10mg/ml或更高，pH5.0～8.0的穩定人活性OB蛋白的制劑。
仍在另一方面，本發明提供連接免疫球蛋白Fc區而衍生的穩定人活性OB蛋白的制劑，其濃度為0.5mg/ml或更高，pH大約6.0～8.0。更具體而言，提供了大約pH7.5，濃度5mg/ml至50mg/ml的穩定活性Fc-OB融合蛋白的制劑。
而本發明的其他方面包括以上的藥用組合物，制造上述組合物的方法和應用本發明組合物的治療方法，以及制造含有本發明組合物用于上述治療的藥物的方法。
附圖簡述

圖1A和1B是小鼠的劑量反應曲線，圖(1A)為實施例1的本發明人OB懸浮液而圖(1B)如在實施例1描述的人OB蛋白對照溶液。
圖2是按實施例1中所描述的本發明OB蛋白懸浮液和人OB蛋白對照溶液在狗中OB血清水平圖。
圖3是反相高壓液相色譜(RP-HPLC)圖，描記37℃下7周的人OB蛋白制劑實施例1的人OB蛋白鋅懸浮液為中間的描記線，實施例1的人OB蛋白對照溶液是頂線，而-80℃保存56天的人OB蛋白懸浮液在底線。
圖4是描記人OB蛋白制劑在19℃下56天的RP-HPLC圖實施例1的人OB溶液在頂線，實施例2人OB結晶懸浮液在中線，實施例2在-80℃下保持56天的人OB結晶懸浮液在底線。
圖5A-5C是人met Fc-OB蛋白的DNA序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖6A-6C是人met Fc-OB蛋白變體的DNA序列(SEQ IDNO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖7是通過反相HPLC測定的描述重組甲硫氨酰基化的人Fc-OB蛋白在108位asp(根據SEQ ID NO4用的數字為asp 335)形成異asp的速率圖。
發明詳述本發明穩定活性的OB蛋白組合物一般被分類為懸浮液，在該制劑中蛋白組分被沉淀懸浮在液體組分中。組合物含活性OB蛋白組分、沉淀劑、pH調節劑和液體載體。本發明的OB蛋白為無定形或結晶形式。
優選地，在人體中用作治療或美容的組合物，用具有天然人OB蛋白的氨基酸序列的OB蛋白(見Zhang等，自然，同上)，及選擇使用在細菌中表達N-末端有甲硫氨酰殘基的OB蛋白。見PCT出版物WO96/05309，在此引入僅作參考，重組DNA意味著可用于制備本發明的OB蛋白。人們可選擇氨基酸制造變化，只要這些變化保持該蛋白的完整折疊或活性就行。下面的表1列出了根據具體的特性(堿性、酸性、極性、疏水性、芳香族和大小(小))可使用的保守氨基酸替換。一般見，Ford等，蛋白表達和純化295-107，1991，在此引入僅作參考。亦可出現小氨基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸殘基，小的達到約20-25個殘基的連接肽或者便于純化的小延伸，如聚組氨酸束，抗原表位或結合結構域。
表1保守性氨基酸替換

一般來說，能顯示在本發明的懸浮液中增加穩定性的人OB蛋白是那些接觸生理pH時在溶液中暴露疏水區的種類。另外，通過免疫球蛋白Fc區連接到OB蛋白部分而衍生的人OB蛋白表現為在本發明的懸浮液中增加穩定性。
一般來說，免疫球蛋白Fc區可遺傳性或化學性融合到人OB蛋白上。優選地，Fc區被融合到OB蛋白的N-末端。見共同未決的美國專利申請系列號08/770,973，提交日期1996年12月20日，針對優選的Fc-OB融合蛋白在此引入僅作參考優選地，可用具有人免疫球蛋白IgG-1重鏈的氨基酸序列的Fc區(見Ellison J.W.等，核酸研究，104071-4079(1982))。優選的Fc區在SEQ ID NO2(見圖5)中給出。SEQ ID NO2的重組Fc-OB序列是378個氨基酸的Fc-OB蛋白(未計入甲硫氨酸殘基)。在圖5中Fc-OB蛋白的第一個氨基酸殘基谷氨酸，以甲硫氨酸為-1位則為+1位。Fc部分的變體或類似物可通過例如進行氨基酸殘基或堿基對的不同替換構建。
半胱氨酸殘基能被缺失或用其他氨基酸取代，以防止Fc序列的二硫交叉聯鍵的形成。特別是，SEQ ID NO2的第5位氨基酸是半胱氨酸殘基。人們可以移去在第5位的半胱氨酸殘基或用1個或多個氨基酸替換它。例如，丙氨酸殘基可替換第5位的半胱氨酸殘基，結果形成變異的氨基酸序列。同樣地，SEQ ID NO2第5位的半胱氨酸可用絲氨酸或其他氨基酸殘基替換或缺失。
變體或類似物也可通過在1、2、3、4和5位的氨基酸缺失制備，結果得到373個氨基酸的Fc-OB蛋白(未計入甲硫氨酸殘基)。該序列在SEQ ID NO4中給出(見圖6)。在這些部位的替換也能進行，包括在本發明的范圍之中。
也可進行修飾以導入4個氨基酸替換以消除Fc受體結合位點和補體(C1q)結合位點。根據SEQ ID NO4的數字順序，這些變異修飾包括第15位的亮氨酸用谷氨酸替換，第98位的谷氨酸用丙氨酸替換，第100和102位的賴氨酸用丙氨酸替換。
同樣，一個或多個酪氨酸殘基也能被苯丙氨酸殘基取代。正如以上所描述，人們可選擇氨基酸形成變化，只有這些變化保持融合蛋白的完整折疊或活性就可。
而且，Fc區也可通過化學或變化長度的氨基酸“接頭”組分與Fc-OB融合蛋白的人OB蛋白連接在一起。上述化學接頭在本領域眾所周知。氨基酸接頭序列包括但不局限于(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly，gly；(f)gly，gly，gly，gly，gly；(g)gly，gly，gly，gly，gly，gly，gly；
(h)gly-pro-gly；(i)gly，gly，pro，gly，gly；和(j)(a)至(i)的任何組合。
本發明的沉淀劑可以是具有陽離子成分的鹽類并且可從鈣、鎂、鋅、鈉、鐵、鈷、錳、鉀和鎳中選取。優選地，該鹽類兼用于藥用組合物中。
另外的沉淀劑可選自現在熟知沉淀蛋白藥用可接受的制劑，如聚乙二醇或如下段給出的其他水溶性聚合物。有用的沉淀劑能誘導OB蛋白在中性pH下沉淀，但沉淀是可逆的或者用生理上相容的溶劑稀釋能重新溶解。沒有合適的沉淀劑，OB蛋白在中性pH沉淀成如下形式，該形式用生理學相容溶劑稀釋是不可逆的。
pH范圍優選地從大約pH4.0至大約pH8.0，而較優選地從大約6.5至大約7.5。對藥用組合物最優選的pH是在該pH中，所用的OB蛋白在所選擇的蛋白濃度可保持其最大的生物學活性。在非生理pH，本發明OB蛋白懸浮液也可具有優點。在pH5.0以下，本發明OB蛋白懸浮液比在相等pH溶液中相等濃度的OB蛋白更穩定(從壽命來看)。例如在pH4.0和濃度為50mg/ml時，本發明的懸浮液在體內施用時比相等濃度的溶液具有更大的生物學活性。
緩沖劑可選自能保持所需的pH而不改變組合物沉淀特性的那些類型。優選地，緩沖劑為藥用制劑可接受的。Tris MES和PIPES對無定形和結晶形二種形式均可接受。磷酸鹽是結晶形式的優選緩沖劑。
為方便治療施用，最終的懸浮液優選的濃度為5mg/ml至100mg/ml。
使用方法治療治療用途包括體重調節，治療或預防糖尿病，降低血脂(和治療相關的病情)，增加體內瘦物質和增加胰島素的敏感性。此外，本發明的組合物可用于制造1或多種藥物，用于治療或減輕以上的病情。施用方法一般通過注射，盡管其他方法例如肺傳輸也可使用。見PCTWO 96/05309，在此引入供參考，例如83頁et seq.。本發明的懸浮液可以噴霧干燥成顆粒，其平均體積小于10微米，或更優選地，0.5～5微米。
體重調節本發明的組合物和方法可用于降低體重。從另一方面考慮，本發明的組合物可用于維持所需的體重或肥胖水平。如在鼠模型所說明的那樣(見上)，本發明OB蛋白的施用引起體重減少。體內物質丟失主要是脂肪組織或脂肪。上述體重減少和伴隨的病情治療有關，例如以下的那些病情，因此能組成治療應用。此外，如果體重調節僅為了改善身體外形，本發明提供美容的用途。
治療糖尿病本發明組合物和方法可用于預防和治療II型糖尿病。II型糖尿病和肥胖有關，應用本發明降低體重(或維持所需的體重，或降低或維持肥胖水平)也能減輕或預防糖尿病的加重。再者，甚至缺乏足以導致體重減少的劑量，本發明的組合物可用于預防或改善糖尿病。
血脂調節本發明的組合物和方法可用于血脂水平的調節。理想地，僅希望降低血脂水平或希望維持血脂水平的情況中，該劑量不足以導致體重減少。因此，在肥胖病人治療的初始過程中，可使用如下劑量，即獲得體重減少及伴隨的血脂水平降低。一旦獲得足量的體重減少，可施用下列劑量即足以預防重新獲得體重而足以維持所需的血脂水平或例如在此給出的其他水平。這些劑量能通過經驗確定，因為OB蛋白的效應是可逆的，如Compfield等，科學269546-549(1995)547頁。因此，如果觀察到某劑量導致體重減少而恰恰體重減少是不希望發生的，人們可施用更低的劑量，以便獲得所需的血脂水平而維持所需的體重。如見PCT出版物WO 97/06816在此引入僅作參考。
增加瘦物質或胰島素敏感性理想地，僅希望增加體內瘦物質的情形，該劑量不足以導致體重減少。因此，在肥胖病人治療的初始階段，可施用的劑量為因此得到體重減少和伴隨脂肪組織降低/瘦物質增加。一旦達到足量的體重減少，可施用一種劑量足以防止重新增加體重而足以維持所需的瘦物質增加(或預防瘦物質缺乏)。為增加個體對胰島素的敏感性，可采取相似的劑量考慮方案。可獲得瘦物質增加而體重不減少，足以降低胰島素(或支鏈淀粉，支鏈淀粉拮抗劑或激動劑，或噻唑烷二酮(thiajolidinediones)，或其他潛在的糖尿病治療藥物)的用量，該個體可進行糖尿病治療。為增加整個強度，可考慮使用相似的劑量，可達到瘦物質增加而伴隨整個強度的增加，該劑量不足以導致體重減少。其他優點如增加血液紅細胞(和血液載氧量)降低骨重新吸收或骨質疏松，在不缺乏體重減少的情況下也可達到。如見PCT出版物No.WO97/18833，在此引入僅作參考。
綜合治療本發明的組合物和方法可用于和其他療法結合，如改變飲食和鍛煉，其他藥物，如用于治療糖尿病的那些種類(如，胰島素和可能的支鏈淀粉，其拮抗劑或激動劑，噻唑烷二酮)(如見PCT出版物No.WO 98/08512，在此引入僅作參考)，降低膽固醇和血壓的藥物(如那些降低血脂水平或其他心血管藥物)，增加活性的藥物(如苯丙胺)，利尿藥(消除液體)和食欲抑制劑(如對神經肽γ受體起作用的藥物或5-羥色胺重吸收抑制劑)。上述施用可同時或依次進行。此外，本發明可以和外科方法結合使用，如旨在改變身體整個外形的美容手術(如，吸脂肪或旨在降低身體內物質的激光外科手術或旨在增加身體外部物質的植入外科手術)。伴隨應用本發明的組合物和方法可增加心臟手術的健康效益，如設計作緩解由如動脈斑塊等脂肪沉積阻塞血管壁引起的有害病情而使用的分流手術或其他手術。消除膽石的方法如超聲或激光方法也可在本發明治療方法過程之前、之中或之后使用。而且，本發明的方法可作為輔助物，用于骨折、肌損傷的外科手術或治療，或用于增加組織瘦物質改善病情的其他治療。
給出的下列實施例更充分地說明本發明，而不能解釋為限制本發明的范圍。實施例1給出pH7.0濃度為100mg/ml的無定形(與結晶形相反，如下面)的人OB蛋白懸浮液制備方法。實施例2給出結晶形OB蛋白懸浮液的制備方法。實施例3說明與OB蛋白溶液相比較，OB蛋白懸浮液改進的劑量反應。實施例4說明在狗模型中本發明的懸浮液延遲的時間作用特征。實施例5給出無定形Fc-OB蛋白懸浮液的制備方法。實施例6和7說明本發明懸浮液改進的穩定性。
實施例1無定形OB蛋白懸浮液的制備本實施例說明制備一種本發明人OB蛋白懸浮液。無定形人OB蛋白懸浮液通過用鋅鹽沉淀的方法制備。得到最終pH6.0～pH 8.0，濃度為100mg蛋白/ml的液體。也給出了pH4.0人OB蛋白溶液的對照組合物。
組合物蛋白組分PCT出版物WO 96/05309的SEQ ID NO4中說明的重組甲硫氨酰基人OB蛋白(“rmetHu-leptin”)，氨基酸數從22位(Val)開始而在氨基酸數167位結束，具有在N-末端一個甲硫氨酰基殘基。
沉淀劑氯化鋅緩沖液Tris、MES和Pipes最終pH6.0-8.0制備方法重組甲硫氨酰基人OB蛋白(“rmetHu-leptin”)溶液在水中注射濃縮到大約40mg/ml，用HCl酸化至pH3.0。加入氯化鋅，然后通過加合適的緩沖液調整pH接近中性(大約pH7.0)而形成懸浮液。成功使用Tris、MES和PIPES緩沖液。最終條件一般是10-15mM緩沖液，20-1000μM鋅，pH6.0～8.0和10mg/ml rmetHu-leptin。濃縮懸浮液使顆粒在4℃沉降幾小時，然后移去上清液。該方法可重復幾次直至達到最大濃度，使用得到的約100mg/ml的懸浮液。
對照組合物在pH4.0含有10mM乙酸鹽和5％ w/v山梨醇中20mg/ml的重組甲硫氨酰基人OB蛋白(如上)溶液用作對照組合物。
實施例2制備結晶OB蛋白懸浮液本實施例說明制備本發明的結晶OB蛋白懸浮液。
蛋白組分如上實施例1用重組的甲硫氨酰基人OB蛋白。
方法濃度15mg/ml在1mM HCl中的rmetHu-leptin以1∶1比例與4M NaCl，100mM Tris，pH8.5，2％ v/v乙醇在4℃溫合。通過緩慢地調整溫度在14℃和25℃幾小時，根據保溫至最終溫度的持續時間維持該溫度至少2小時，自發地形成結晶。通過離心收獲晶體，懸浮在合適的結晶穩定溶劑中，“母液劑”(即晶體在其中生長的液體)用注射法被更穩定的溶劑取代。合適的取代溶劑是20-25％聚乙二醇(具有分子量大約4000道爾頓至大約20,000道爾頓，措詞“大約”意指商業PEG制備物的大約平均分子量)，合適中性pH緩沖液，優選地大約pH6.0至大約pH8.0，和優選的pH6.0～7.5的10mM磷酸鹽緩沖液，以及2％ v/v乙醇。在一典型的制備物中，某些殘留的鹽類，通常小于0.25M可以保留。
實施例3與OB蛋白溶液相比OB蛋白懸浮液改進的劑量反應本實施例說明本發明OB蛋白懸浮液比溶液中OB蛋白更有效。正常瘦小鼠每天注射連續5天給予重kg體重1、10和50mg蛋白的本發明懸浮液或給予相同劑量的OB蛋白溶液。以所給的OB蛋白質量的每單位重量計算，給予懸浮液的小鼠比給予相等劑量溶液制劑的小鼠失去重量更多。該結果在圖1A和圖1B中說明。圖1A表示當給予實施例1的懸浮液時體重變化的百分率。圖1B表示當給予實施例1的對照溶液時體重變化的百分率。
本結果說明本發明的懸浮液在相同劑量下比以溶液形式所給的蛋白更有效。盡管不希望被理論束縛，本結果可能由于與溶液相比較，懸浮液較慢的吸收率有關。懸浮液在進入血液前必須溶解，結果該維持釋放的效應導致更高的效率。以質量基礎考慮，懸浮液中需要被施用的蛋白比溶液更少。進一步，在溶液中，在第5天10和50mg/kg劑量之間沒有差異(給劑量的最后一天)(見如下表2)。懸浮液比溶液給出更確定的劑量反應曲線。
表2從第0天起重量變化百分率

數據是每處理5只小鼠的平均值方法動物用正常CD-1小鼠基礎體重大約20克施用方式動物在相同部位每天被注射SC共5天。飼養方法動物以組分籠，隨意喂食。組合物溶液用實施例1的rmetHu-leptin溶液，濃度為20mg/ml。懸浮液用實施例1的rmetHu-leptin懸浮液，pH7.0，10mMMES緩沖液，500mM Zn，20mg/ml。
PBS磷酸鹽緩沖液用作安慰劑。
(用單獨的懸浮液液體和溶液液體不含蛋白的劑量反應與PBS相似，數據未顯示)。
實施例4在狗中OB蛋白的血清水平本實施例說明本發明懸浮液的延遲時間作用特征。
方法小兔獵狗被施與懸浮液或溶液的rmetHu-leptin。在如圖2說明所示的時間吸取血清，測定OB蛋白水平。
表3<

所用的組合物溶液根據實施例1使用溶液，劑量為5mg/kg/天。
懸浮液根據實施例2使用懸浮液。見表。
動物在表3中給出的數據是3只動物的平均值，動物為正常小免獵狗。
飼養方式每只動物單只籠養，隨意喂食。遵守良好動物飼養操作規則。
分析用Hotta等，生物化學雜志271255327-25331(1996)中所用的抗體分析法。
結果如圖2所示，溶液濃度峰值在施用蛋白后1至2小時，而懸浮液濃度峰值更晚，在施用后10-12小時。這說明懸浮液維持最低有效劑量較長的時期。
實施例5制備無定形Fc-OB蛋白懸浮液本實施例說明制備一種本發明的人Fc-OB蛋白懸浮液。無定形人Fc-OB蛋白懸浮液通過鋅鹽沉淀制備。也給出pH7.5人Fc-OB蛋白溶液的對照組合物。
組合物蛋白組分在SEQ ID NO4說明的重組甲硫氨酰基人Fc-OB蛋白(“rmetHu-Fc-leptin”)，是一種373個氨基酸的融合蛋白，該蛋白的Fc部分為1-227位氨基酸而該蛋白的人OB蛋白部分為228-373位氨基酸，其N-末端具有甲硫氨酰基殘基沉淀劑氯化鋅緩沖劑100mM Tris最終pH7.5制備方法rmetHu-Fc-leptin溶液在100mM Tris緩沖液，pH7.5中濃縮到大約5mg/ml。加入氯化鋅以形成懸浮液。
對照組合物含100mM Tris pH7.5 5mg/ml的rmetHu-Fc-leptin溶液(如上)用作對照組合物。
實施例6本發明人OB蛋白懸浮液的穩定性本實施例說明本發明懸浮液的無定形和結晶形兩種形式在加速穩定測定的條件下比材料在溶液中更穩定。
圖3說明比較在37℃下7周時間本發明懸浮液的鋅無定形(如在實施例1中)和溶液形式(也在實施例1中)的RP-HPLC描記圖。可以看出，本發明的懸浮液(中線)比溶液形式(頂線)有較少的峰(顯示較少的斷裂產物)。作為比較，底線表示貯存在-80℃7周的鋅無定形。
圖4說明比較實驗例2的結晶懸浮液形式與溶液形式(實施例1)的RP-HPLC描記圖。材料貯存在19℃56天。(貯存在37℃不是相關條件，因為在37℃下結晶形喪失其結晶結構)，表明溶液形式(主峰＝86％)比懸浮液形式(主峰＝94％)更多的降解。在底線的對照是貯存在-80℃56天的結晶形。相似的結果在4℃也觀察到，盡管降解作用發生較緩慢。
主要降解產物似乎是在108位氨基酸的天冬氨酸(參照在PCTWO 96/05309的SEQ ID NO4，用“Val”殘基為位置數1)。人們可以通過實驗在這個部位選擇較穩定的化學組分，例如另一個氨基酸以改善該分子的穩定性。總之，本發明的懸浮液比OB蛋白在溶液中更穩定。
實施例7本發明人Fc-OB蛋白懸浮液的穩定性本實施例說明本發明Fc-OB蛋白懸浮液的無定形在加速穩定測定條件下比材料在溶液中更穩定。
本發明懸浮液的鋅無定形(如實施例5中)和溶液形(也如實施例5中)用于穩定研究，將懸浮和溶液形式貯存在4℃、29℃和37℃ 2周后進行。如圖7所示，貯存在29℃和37℃的Fc-leptin懸浮液比分別貯存在相同溫度的Fc-leptin溶液，顯示為較低百分率的OB蛋白第108氨基酸天冬氨酸有關的降解產物。
盡管本發明已經用優選的實施方案方式描述，可以理解對本領域的技術人員來說可進行各種變化和修飾。因此，可以認為所附的權利要求書覆蓋全部上述等值的變化，這些變化正如權利要求所要求的屬于本發明的范圍。
權利要求
1.pH大約6.0至大約8.0和濃度至少0.5mg/ml的人OB蛋白懸浮液，其中OB蛋白通過免疫球蛋白的Fc區連接到OB蛋白部分的N-末端衍生而成。
2.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，其中所述的Fc-OB蛋白的Fc部分選自(a)在SEQ ID NOS2和4給出的Fc氨基酸序列；(b)(a)的氨基酸序列，具有在1個或多個下列位置的不同氨基酸替換或缺失(參照SEQ ID NO2用的數字編號)(i)1個或多個半胱氨酸殘基被丙氨酸或絲氨酸殘基所取代；(ii)1個或多個酪氨酸殘基被苯丙氨酸殘基所取代；(iii)在第5位的氨基酸用丙氨酸取代；(iv)在第20位的氨基酸用谷氨酸取代；(v)在第103位的氨基酸用丙氨酸取代；(vi)在第105位的氨基酸用丙氨酸取代；(vii)在第107位的氨基酸用丙氨酸取代；(viii)在第1、2、3、4和5位的氨基酸缺失；(ix)1個或多個殘基取代或缺失以消除Fc受體結合位點；(x)1個或多個殘基取代或缺失以消除補體(C1q)結合位點；和(xi)i-x的組合；以及(c)(a)或(b)的氨基酸序列，其N-末端具有一個甲硫氨酰基殘基。
3.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，其中所述的濃度至少為5mg/ml。
4.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，其中所述的濃度在5mg/ml和50mg/ml之間。
5.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，其中所述的pH為pH7.0。
6.權利要求2的人OB蛋白懸浮液，其中所述的人OB蛋白是rmetHu-Fc-leptin。
7.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，含有藥用沉淀劑。
8.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，含有的沉淀劑選自鹽類和水溶性聚合物。
9.權利要求1的人OB蛋白懸浮液，含有的沉淀劑選自鈣、鎂、鋅、鈉、鐵、鈷、錳、鉀和鎳。
10.通過施用有效劑量的根據權利要求1的人OB懸浮液治療患某一病情的個體的方法，所述的病情選自(a)體重調節，(b)肥胖調節，(c)糖尿病，(d)血脂水平調節，(e)增加瘦物質，和(f)增加胰島素的敏感性。
11.制備人OB蛋白懸浮液的方法，包括在合適條件下，把沉淀劑和在溶液中的人OB蛋白組合在一起，其中所述的OB蛋白通過一種免疫球蛋白的Fc區連接到OB蛋白部分的N-末端衍生而成；使所述的人OB蛋白沉淀，收集所述的沉淀人OB蛋白；和任選地，把所述的人OB蛋白重新懸浮在稀釋劑中。
12.權利要求11的方法，其中所述的人OB蛋白重新懸浮在pH6.0～8.0稀釋劑中。
13.權利要求11的方法，其中所述的人OB蛋白是rmetHu-Fc-leptin。
全文摘要
本發明涉及OB蛋白組合物和相關的方法。在此提供在生理pH下穩定并具有活性的OB蛋白懸浮液。上述OB蛋白懸浮液用于治療或調節體重肥胖水平、糖尿病和其他病情。
文檔編號C07K14/47GK1274289SQ98804225
公開日2000年11月22日 申請日期1998年4月16日 優先權日1997年4月17日
發明者D·N·布雷姆斯, D·L·弗倫奇, M·A·斯皮德 申請人:安姆根有限公司