針對甲型流感病毒h1n1的重鏈抗體vhh及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種針對甲型流感病毒H1N1的重鏈抗體VHH，所述的抗體具有核苷酸序列：SEQIDNO.36、37、38、39或40，它們編碼本發明所述的甲型流感病毒H1N1的重鏈抗體VHH；所述的抗體具有氨基酸系列：包括框架區FR和互補決定區CDR，即框架區FR選自下組的FR的氨基酸序列和互補決定區CDR氨基酸序列。還公開了該甲型流感病毒H1N1的重鏈抗體VHH用于診斷甲型H1N1流感的應用及一種宿主細胞。本發明通過所公布的納米抗體基因序列及宿主細胞，該納米抗體能夠在大腸桿菌內高效表達，特異識別甲型流感病毒H1N1，能夠用于甲型H1N1流感檢測試劑的研發。
【專利說明】針對甲型流感病毒H1N1的重鏈抗體VHH及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學或生物制藥【技術領域】，涉及一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH。
【背景技術】
[0002]HlNl屬于正粘病毒科，甲型流感病毒屬。典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80nm-120nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是紅細胞血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)和基質蛋白M2。病毒顆粒內為核衣殼，呈螺旋狀對稱，直徑為10nm。為單股負鏈RNA病毒，基因組約為13.6kb，由大小不等的8個獨立片段組成。甲型流感病毒HlNl是人類最常感染的流感病毒之一。一些HlNl的種類可以在人類間傳播，包括1918年的流感大爆發，另一些可在雀鳥和豬之間傳播。2009年3至4月，墨西哥爆發HlNl疫潮，導致過百人感染。疫情其后傳播到全世界。2009年4月30日凌晨，世界衛生組織把全球流感大流行警告級別提高到第5級。我國甲型HlNl流感相當嚴重，根據官方統計，從2009年5月11日確診首例甲型HlNl流感至2010年8月10日24時，中國內地累計報告甲流感確診病例128033例，死亡805例。衛生部已將甲型HlNl流感納入《傳染病防治法》規定的乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預防、控制措施。目前針對人間甲型HlNl流感大流行的防控措施主要采用化學藥物和疫苗，但是化學藥物的過量使用產生的副作用及疫苗開發往往滯后于疫情暴發和疫苗只能對易感人群起預防作用的弊端顯著。作為化學藥物和疫苗的有效補充，由抗體介導的預防和診斷已顯現良好的效果，其應用前景得到專家的認同。但是常規抗體仍然存在穩定性差，溶解性低及獲得較麻煩等方面的問題。1993年比利時科學家首次在Nature報道駱駝血液中存在不含輕鏈的抗體，這些缺失輕鏈的“單域重鏈抗體”(VHH)能像正常抗體一樣與抗原等靶標緊密結合，而且不會像scFv那樣互相沾粘，甚至聚集成塊，另外不會因為含有傳統抗體的Fe段而引起補體反應。這種抗體只包含一個重鏈可變區和兩個常規的CH2與CH3區，更重要的是單獨克隆并表達出來的VHH具有很好的結構穩定性與抗原結合活性。由于此種VHH的分子量只是普通抗體的1/10，所以VHH也稱Nanobody (納米抗體)；與此同時納米抗體化學性質也更加靈活，穩定性好，可溶性高且容易獲得，同時方便偶聯其他分子，因此應用甲型流感病毒HlNl納米抗體研發甲型HlNl流感診斷試劑具有廣闊的前景。

【發明內容】

[0003]發明目的:本發明所要解決的技術問題是提供一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，同時提供該重鏈抗體VHH的編碼序列及該重鏈抗體VHH在制備檢測試劑中的應用。
[0004]技術方案:本發明的技術方案為:即:
本發明的第一方面 ，提供了一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，包括框架區FR和互補決定區⑶R，所述的框架區FR由四個框架區組成，分別為FR1、FR2、FR3和FR4，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
FRl為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.17所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.18所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列；
所述的互補決定區⑶R由三個互補決定區組成，分別⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
CDRl為SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.22所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.23所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.24所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.25所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.26所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.27所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.28所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.31所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.32所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.33所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.34所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.35所示的氨基酸序列。
[0005]優選地，所述的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，它具有SEQ ID NO:36、37、38、39或40所示的氨基酸序列。
[0006]本發明第二方面，一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，它針對甲型HlNl病毒表面抗原，包括兩條具有SEQ ID N0:36、37、38、39或40所示氨基酸序列的VHH鏈。
[0007]本發明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質:本發明所述的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH。
[0008]優選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:
SEQ ID NO:41、42、43、44 或 45。
本發明的第四方面，提供了一種表達載體，它含SEQ ID NO:41、42、43、44或45所示的核苷酸序列。
[0009]本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的表達載體。
[0010]本發明的第六方面，提供了本發明所述的針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH用于診斷甲型HlNl流感的潛在應用。
[0011]有益效果:
與現有技術相比，本發明的優點如下:本發明將滅活的甲型HlNl流感病毒免疫新疆雙峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細胞建立了針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH基因庫，試驗中將滅活的甲型HlNl流感病毒偶聯在酶標板上，以此形式的甲型HlNl流感病毒表面抗原利用噬菌體展示技術篩選免疫性的納米抗體基因庫，從而獲得了針對甲型HlNl流感病毒的特異性納米抗體基因，將此基因轉至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH的基因電泳圖；
圖2是對于所構建的甲型HlNl流感病毒特異性的單域抗體文庫進行的菌落PCR電泳
圖；
圖3是用噬菌體的酶聯免疫方法(ELISA)篩選特異性單個陽性克隆的模式圖；
圖4是表達的針對甲型流感病毒HlNl的#12重鏈抗體VHH，經鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的SDS-PAGE的電泳圖；其中泳道I是破菌后蛋白總的粗提液樣品，泳道2是總的蛋白粗提液過鎳柱后的樣品，泳道3是含50毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品，泳道4和5是含100毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品，6-7是250毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品，8-11是500毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品；
圖5是表達的全部5顆針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，其中泳道I是蛋白分子標準，泳道2是甲型流感病毒H1N1-#12重鏈抗體VHH，泳道3甲型流感病毒H1N1—#51重鏈抗體VHH，泳道4是甲型流感病毒H1N1—#71重鏈抗體VHH，泳道5是甲型流感病毒HlNl-#121重鏈抗體V HH，6是甲型流感病毒H1N1—#125重鏈抗體VHH。
【具體實施方式】
[0013]本發明首先將滅活的甲型HlNl流感病毒免疫一只新疆雙峰駝，經過4次免疫之后提取該雙峰駝外周血淋巴細胞并構建了甲型HlNl流感病毒特異的單域重鏈抗體文庫。將滅活的甲型HlNl流感病毒偶聯在NUNC酶標板上，展示蛋白質的正確空間結構，使得滅活的甲型HlNl流感病毒表面的抗原表位得以暴露出來，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術篩選甲型HlNl流感病毒免疫性的納米抗體基因庫，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0014]本發明的第一方面，提供了一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，包括框架區FR和互補決定區⑶R，所述的框架區FR由四個框架區組成，分別為FRl、FR2、FR3和FR4，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
FRl為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列；
或FRl為SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列；或FRl為SEQ ID N0.17所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.18所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列；
所述的互補決定區⑶R由三個互補決定區組成，分別⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列:
⑶Rl為SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列，⑶R2為SEQ ID N0.22所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.23所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.24所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.25所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.26所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.27所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.28所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.31所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.32所示的氨基酸序列；
或CDRl為SEQ ID N0.33所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.34所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.35所示的氨基酸序列。
[0015]優選地，所述的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，它具有SEQ ID NO:36、37、38、39或40所示的氨基酸序列。
[0016]本發明第二方面，一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，它針對甲型HlNl病毒表面抗原，包括兩條具有SEQ ID N0:36、37、38、39或40所示氨基酸序列的VHH鏈。
`[0017]本發明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質:本發明所述的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH。
[0018]優選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:
SEQ ID NO:41、42、43、44 或 45。
本發明的第四方面，提供了一種表達載體，它含SEQ ID NO:41、42、43、44或45所示的核苷酸序列。
[0019]本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的表達載體。
[0020]本發明的第六方面，提供了本發明所述的針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH用于診斷甲型HlNl流感的潛在應用。
[0021]本發明將滅活的甲型HlNl流感病毒免疫新疆雙峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細胞建立了針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH基因庫，試驗中將滅活的甲型HlNl流感病毒偶聯在酶標板上，以此形式的甲型HlNl流感病毒表面抗原利用噬菌體展示技術篩選免疫性的納米抗體基因庫，從而獲得了針對甲型HlNl流感病毒的特異性納米抗體基因，將此基因轉至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達的納米抗體株。
[0022]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0023]實施例1:針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH文庫的構建:
(I)由滅活的甲型HlNl流感病毒每次免疫將20mg滅活甲型HlNl流感病毒與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆雙峰駝(句容圣龍家畜養殖廠)，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐劑，剩余幾次全部使用弗式不完全佐劑，免疫過程中刺激B細胞表達抗原特異性的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH。(2) 4次免疫結束后，提取駱駝外周血淋巴細胞100ml并提取總RNA。(3)將提取的RNA反轉錄成cDNA并利用套式PCR擴增VHH鏈，結果如圖2顯示，該片段的大小約為400bP。通過數次免疫新疆雙峰駝，我們提取駱馬它外周血淋巴細胞總RNA,并反轉錄合成cDNA,經過兩步PCR成功的獲得編碼納米抗體的基因，從左到右的DNA條帶分別是:第一為IOObP的分子Marker，第二納米抗體基因電泳帶約為400bp。(4)使用限制性的內切酶PstI及NotI酶切20μ8 pComb3噬菌體展示載體(Biovector供應)及10 μ g VHH并連接兩個片段。(5)將連接產物電轉化至電轉感受態細胞TGl (北京神州紅葉科技有限公司)中，構建甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH噬菌體展示文庫并測定庫容，庫容的大小為5*108;與此同時，通過菌落PCR檢測所建文庫的插入率檢測結果插入率約95%，圖2顯示菌落PCR結果。文庫構建完成后，為檢測文庫的插入率，我們隨機的選取24顆克隆做菌落PCR。結果顯示:只有I顆為空載體，即我們的插入率已達到95%以上。
[0024]實施例2:針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH篩選過程:
(I)將溶解在100毫摩爾pH 8.2NaHC03中的滅活甲型HlNl流感病毒200微克偶聯在NUNC酶標板上，4°C放置過夜，同時設立負對照。(2)第二天兩個孔中分別加入100微升
0.1%酪蛋白，室溫封閉2小時。(3) 2小時后，加入100 μ I噬菌體(8*10ntfu免疫駱駝納米抗體噬菌展示基因庫)，在室溫下作用I小時。(4)用PBST (PBS中含有0.05%吐溫20)洗5遍，以洗掉不結合的噬菌體。(5)用三乙基胺(100 mM )將與甲型流感病毒HlNl特異性結合的噬菌體解離下，并感染處于對數期生長的大腸桿菌TG1，產生并純化噬菌體用于下一輪的篩選，相同篩選過程重復3-4輪。在不斷地篩選的過程中，陽性的克隆將不斷的被富集，從而達到了利用噬菌體展示技術篩取抗體庫中甲型流感病毒HlNl特異抗體的目的。該實驗的原理模式圖如圖3所示。
[0025]實施例3:用噬菌體的酶聯免疫方法(ELISA)篩選特異性單個陽性克隆:` (I)從上述3-4輪篩選后含有噬菌體的細胞培養皿中，挑選96個單個菌落并接種于含有100微克每毫升的氨芐青霉素的TB培養基(I升TB培養基中含有2.3克磷酸二氫鉀，12.52克磷酸氫二鉀，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生長至對數期后，加終濃度I毫摩爾的IPTG，28°C培養過夜。(2)利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉移到經抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置I小時。(3)用PBST洗去未結合的抗體，加入一抗mouse ant1-HA tag antibody(抗鼠抗HA抗體,購自北京康為世紀生物科技有限公司),在室溫下放置I小時。(4)用PBST洗去未結合的抗體,加入ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (山羊抗小鼠堿性磷酸酶標記抗體，購自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置I小時。(5)用PBST洗去未結合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長，讀取吸收值。(6)當樣品孔OD值大于對照孔OD值3倍以上時，判為陽性克隆孔。(7)將陽性克隆孔的菌轉搖在含有100微克每毫升的LB液體中以便提取質粒并進行測序。
根據序列比對軟件Vector NTI分析各個克隆株的基因序列，把⑶R1，⑶R2，⑶R3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，最終共有5株不同的抗體。其抗體的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 36、37、38、39或40所示。
[0026]實施例4:納米抗體在宿主菌大腸桿菌中表達、純化:
(I)將前面測序分析所獲得不同克隆株的質粒電轉化到大腸桿菌WK6中，并將其涂布在含有100微克每毫升氨芐青霉素和2%葡萄糖LB固體培養基的板上，37°C過夜，(2)挑選單個菌落接種在15毫升含有氨芐青霉素的LB培養液中，37°C搖床培養過夜，(3)接種Iml的過夜菌種至330mlTB培養基中，37 °C搖床培養，培養到OD值達到0.6-1時，加入IPTG，28°C搖床培養過夜，(4)第二天，離心收菌，(5)將菌體利用滲透法使菌體蛋白釋放出來以獲得抗體粗提液，(6)經鎳柱離子親和層析純化抗體蛋白，為獲得高純度的抗體，采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫液(50毫摩爾，100毫摩爾)用于洗去雜帶，高濃度咪唑洗脫液(250毫摩爾，500毫摩爾)最終可制備純度達90%以上的蛋白。圖4是表達的針對甲型流感病毒HlNl的#12重鏈抗體VHH，經鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的SDS-PAGE的電泳圖；其中泳道I是破菌后蛋白總的粗提液樣品，泳道2是總的蛋白粗提液過鎳柱后的樣品，泳道3是含50毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品，泳道4和5是含100毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品，6-7是250毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品，8-11是500毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫的樣品；圖5是表達的全部5顆針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，其中泳道I是蛋白分子標準，泳道2是甲型流感病毒H1N1-#12重鏈抗體VHH，泳道3甲型流感病毒H1N1—#51重鏈抗體VHH，泳道4是甲型流感病毒H1N1—#71重鏈抗體VHH，泳道5是甲型流感病毒HlNl-#121重鏈抗體VHH，6是 甲型流感病毒H1N1—#125重鏈抗體VHH。結果顯示，納米抗體經過該純化后，其純度可達到95%以上。
[0027]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出:對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，包括框架區FR和互補決定區⑶R，其特征在于，所述的框架區FR由四個框架區組成，分別為FR1、FR2、FR3和FR4，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列: FRl為SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列； 或FRl為SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列； 或FRl為SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.10所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.11所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列； 或FRl為SEQ ID N0.13所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.14所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.15所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列； 或FRl為SEQ ID N0.17所示的氨基酸序列，FR2為SEQ ID N0.18所示的氨基酸序列，FR3為SEQ ID N0.19所示的氨基酸序列，FR4為SEQ ID N0.20所示的氨基酸序列； 所述的互補決定區⑶R由三個互補決定區組成，分別⑶R1、⑶R2和⑶R3，它們的氨基酸序列選自以下的氨基酸序列: CDRl為SEQ ID N0.21所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.22所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.23所示的氨基酸序列； 或CDRl為SEQ ID N0.24所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.25所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.26所示的氨基酸序列； 或CDRl為SEQ ID N0.27所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.28所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.29所示的氨基酸序列； 或CDRl為SEQ ID N0.30所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.31所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.32所示的氨基酸序列； 或CDRl為SEQ ID N0.33所示的氨基酸序列，CDR2為SEQ ID N0.34所示的氨基酸序列，CDR3為SEQ ID N0.35所示的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，其特征在于，它具有SEQ ID N0.36、37、38、39或40所示的氨基酸序列。
3.一種針對甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH，其特征在于，它針對甲型流感病毒HlNl表面抗原的納米抗體，包括兩條具有SEQ ID N0.36、37、38、39或40所示氨基酸序列的VHH 鏈。
4.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質:權利要求1或2所述的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH。
5.根據權利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列: SEQ ID N0.41、42、43、44或45所示的氨基酸序列。
6.—種表達載體,其特征在于,它含SEQ ID N0.41、42、43、44或45所不的核苷酸序列。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它可以表達甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH。
8.根據權利要求1或2所述的甲型流感病毒HlNl的重鏈抗體VHH用于檢測甲型HlNl流感的應用。
【文檔編號】C07K16/10GK103804493SQ201410038652
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】萬亞坤, 歐衛軍, 嚴俊榮, 孫燕燕 申請人:南通市伊士生物技術有限責任公司