專利名稱：生物活性化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及可溶的合成聚合物結合的蒽環類化合物，它們的制備和含有它們的藥物組合物。
現有技術中已知的及當前用于臨床治療惡性腫瘤的蒽環類化合物的例子有阿霉素、4’-表阿霉素和4-去甲氧基柔紅霉素；見如F.Aramone“Doxorubicin”MedicinalChemistrymonograph，vol，7，AcademicPress1981。
已制備了許多具有抗腫瘤活性的阿霉素聚合物衍生物。這些衍生物中特別有希望臨床應用的是可溶的聚合物結合的阿霉素，它由親水片段和連結阿霉素和2-羥基丙胺的肽鏈組成。通過鹽酸阿霉素與含肽基鏈的甲基丙烯酸聚合物前體(活化為對硝基苯基酯)在三乙胺存在下在二甲亞砜中縮合，然后剩余的酯基用1-氨基-2-羥基丙烷氨解，制備這些聚合物結合的阿霉素。這些物質與鼠溶酶體酶一起孵育，可裂解末端氨基酸與阿霉素之間的酰胺鏈[J.Kopecek等，Biomaterials10，335(1989)；R.Duncan等，Biochem，Pharmacol.，39，1125(1990)；R.Duncan等，J.ControlleolRelease，10，51(1989)；18，123(1992)和19，331(1992)]。
例如上述的傳統方法的問題在于難以從阿霉素聚合物共軛體中去除阿霉素。這是因為結合的和游離的阿霉素之間形成了π-復合物；已表明此物在電泳、分子過濾和凝膠色譜中表現為一個整體[J.Feijen等，J.ControlledRelease1，301(1985)]。
本發明的聚合物結合的蒽環系統是基于含親水片段的甲基丙烯酸聚合物、只連結于蒽環的氨基的肽基側鏈和甘氨酸殘基，或為游離酸形式或為酰胺衍生物形式。這些系統與現有技術相比，其優點是蒽環化合物易于從其所結合的聚合物上釋放出來。另外，本發明的聚合物結合的蒽環類化合物比相應的游離蒽環化合物具有更寬的抗腫瘤活性和更低的全身毒性。
因此，本發明提供式A聚合物結合的蒽環類化合物，其基本由式1、2和3代表的3個單元組成
其中Gly代表甘氨酸；n為0或1x為70-98mol%，y為1-29mol%，z為1-29mol%R1為被一個或多個羥基取代的C1-6烷基；Y為氨基酸殘基或肽間隔基；[NH-D]為氨基糖甙蒽環化合物[NH2-D]的殘基；Z為羥基或如上所定義的式-NHR1的殘基。
其殘基為[NH-D]的氨基糖甙蒽環化合物用[NH2-D]代表，其中D指蒽環氨基糖甙減去糖片段的氨基所剩結構。
聚合物結合的蒽環化合物優選含有90-98mol%的式1單元、1-10mol%的式2單元和1-10mol%的式3單元。
肽基鏈在體內酶水解只使活性藥物D-NH2釋放，而單元3不受影響。
R1代表的適當烷基為被一個或多個羥基取代的C1-4烷基；例如羥乙基、2-羥丙基和3-羥丙基。
肽間隔基Y應易于細胞內水解，而可耐受細胞外水解。肽間隔基的長度可為1-10(例如2-4)個氨基酸殘基。典型的肽間隔基為三肽或四肽。
組成肽間隔基Y的每個手性氨基酸殘基可為D或L光學異構體，或D/L混合物。這里使用表示氨基酸的常規三字系統，其中這些符號表示手性氨基酸的L構型，除非另有說明。肽間隔基Y可以消旋混合物或光學純異構體。
優選地，Y選自Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly、或Leu-Leu-Gly，每例中甘氨酸殘基與氨基糖甙蒽環連結。
適宜的氨基糖甙蒽環殘基[NH-D]為下式Q的蒽環氨基糖甙[NH2-D]的殘基
其中，RⅠ和RⅡ之一為氫原子，另一個為羥基或碘；RⅢ為氫原子或OCH3，及RⅣ為氫原子或羥基。
蒽環氨基糖甙[NH2-D]的優選例為阿霉素、4’-表阿霉素、4’-去甲氧基柔紅霉素、idarubicin和4’-碘、4’-去氧阿霉素。
本發明還提供聚合物結合的蒽環化合物A的制備方法，其中A主要由如上所定義的單元1、2和3組成。此方法包括ⅰ)聚合物中間體B，其中B基本由下式1和4的單元組成 其中式1中的X、n和R如上所定義，w為30-2mol%，R2為羥基或離去基團，與通式5的蒽環衍生物反應其中[NH-D]和Y如上所定義；及ⅱ)必要時，為制備其中式3單元中Z為NHR1的聚合物結合的蒽環化合物，將其中R2為離去基團的步驟ⅰ)的產物與式NH2R1化合物反應，其中R1如上所定義。
R2可代表的適宜的離去基團為苯環上被一個或多個吸電子基團取代的苯氧基。吸電子基團的適當例子包括硝基(-NO2)和鹵原子。R2優選為下式離去基團 其中L為吸電子基團如-NO2或鹵原子如氟或氯，及m為1-5的整數，特別是1-3，優選1-2。R2優選為對硝基苯氧基或2，4-二氯苯氧基。
由于其高親脂性，式5化合物易于從式A的聚合物共軛體中分離出來。因此，如上所述，本發明聚合物結合的蒽環化合物的制備途徑克服了傳統的蒽環與聚合物縮合方法的主要缺點，即難于從聚合物共軛體中分出游離的蒽環化合物。
如上所定義，聚合物中間體B主要由單元1和4組成，其通過下式6和7的甲基丙烯酰化合物的自由基共聚合來制備
其中n、R1和R2如上所定義。
基本由單元1和4組成的一些聚合物是文獻中已知的；例如聚合物B1，它由其中R1代表-CH2CH(OH)CH3，n=0的單元1和其中R2代表對硝基苯酚殘基的單元4組成，通過N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺[6aR1=CH2CH(OH)CH3，n=0]與N-甲基丙烯酰甘氨酰對硝基苯基酯[7aR2=O-C6H4NO2]的自由基沉淀共聚合來制備，如 J.Kopecek，Makromol.Chem.178，2159(1977)中所述。其中R2代表羥基的由單元1和4組成的聚合物中間體可通過自由基均聚合來制備。
式6和7的一些單體為已知的。其中n=0及R1為帶有仲羥基的烷基的式6化合物，一般通過甲基丙烯酰氯與帶有仲羥基的脂肪胺反應來制備。另一方面，其中n=0及R1為含伯羥基的烷基的式6化合物，可從甲基丙烯酸和氨基化合物在縮合劑如1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉存在下制得。
本發明的另一方面是肽基-蒽環衍生物。它們的制備方法是已知的。例如，因為適當的N-保護的肽與蒽環反應很重要，反以一定要選擇在對蒽環穩定的條件下能夠被除去的肽基N-保護基，例如三苯甲基。
式5的肽基蒽環衍生物可通過下述方法制備，它包括(ⅰ)式8或9的N-保護的肽
其中R3為對酸敏感的氨基保護基，P為離去基團，Y為如上所定義的氨基酸殘基或肽間隔基，與如上所定義的蒽環氨基糖甙[NH2-D]反應，生成通式10的中間體
其中[NH-D]、Y和R3如上所定義；及(ⅱ)除去保護基R3，生成游離堿形式的肽基-蒽環衍生物5。
P可為如上R2中所定義和例舉的離去集團。另外，P可為五氟苯氧基或N-羥基-琥珀酰亞氨基。對酸敏感的保護基R3的例子包括三苯甲基和二苯基氨基。
式8和9的肽基衍生物根據有關肽文獻中已知的標準合成步驟來制備。用酸敏感基團如三苯甲基保護氨基官能團典型地根據Theodoro-poulos等[J.Org.Chem.47，1324(1982)]來進行。設計制備化合物8，9和10的反應條件以避免消旋化；這樣生成的肽基衍生物與起始氨基酸的構型相同。
為了制備式5的蒽環衍生物，化合物9可與蒽環化合物鹽酸鹽在無水極性溶劑如二甲基甲酰胺中，在等當量的有機堿如三乙胺存在下，例如在室溫下反應15小時，生成式10中間體，通過色譜純化并在例如75%的乙酸中在室溫下脫保護，得到式5衍生物。
應該注意，在C-14位帶有羥基的蒽環如阿霉素和4’-表阿霉素以鹽酸鹽形式與式9肽基衍生物在有機堿存在下的以應，并需要在極性溶劑中將蒽環的3’-氨基脫保護，生成衍生物10和在糖片段的氨基和在C-14位都被取代的蒽環衍生物的混合物。通過色譜從此混合物中除去二(3’-N，14-O-肽基)衍生物。
還可以通過式8N-保護的肽與鹽酸鹽形式的蒽環化合物，在干燥的極性溶劑如二甲基亞砜中，在等當量的縮合劑如1-乙氧基-羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉存在下反應來制備式10化合物。此步驟不會產生C-14位帶有羥基的蒽環化合物的雙肽基衍生物。
中間體B與式5的肽基蒽環衍生物縮合，然后任選地替換剩余的離去基團，生成基本由單元1、2和3組成的聚合物結合的蒽環化合物。應該強調的是此步驟避免了伯羥基與側鏈甘氨酰活化酯之間形成酯鍵。
如上所定義的，其中單元3的Z殘基代表式NHR1的基團的式A聚合物結合的藥物，優選通過其中R2為如上所定義的離去基團的中間體B與式5蒽環衍生物，在無水極性溶劑如二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中反應來制備。此反應典型地在8-24小時內完成。該反應典型地在15-30℃溫度范圍內進行，優選在室溫進行15小時，然后通過其共軛體與如上所定義的式NH2R1化合物在室溫反應0.5-3小時，以置換剩余的離去基團。
其中單元2的殘基Z代表羥基的式A聚合物結合藥物，優選通過其中R2為羥基的中間體B與式5蒽環衍生物，在無水極性有機溶劑如二甲基甲酰胺或二甲亞砜中反應來制備。此反應典型地在8-24小時內完成。此反應典型地在15-30℃溫度下進行，優選在室溫下進行15小時。
例如，為了制備其中Z為殘基NHR1(如上所定義)的聚合物結合蒽環衍生物，其中R2為離去基團如對硝基苯氧基的中間體B用肽基蒽環5在室溫下處理15小時。適當地使用14%w/v的B和2.3%w/v的5。然后典型地加入0.1%w/v的式NH2R1化合物(如上所定義)反應混合物在室溫保持3小時。用丙酮沉淀此共軛體，用絕對乙醇溶解，典型濃度為8%(w/w)，再用丙酮沉淀，得到目標聚合物結合蒽環衍生物。
在上述方法中避免了在C-14羥基化的蒽環化合物與側鏈甘氨酰活化酯之間形成酯鍵，這是因為在此縮合步驟中沒有任何有機堿存在。
又如，為了制備其中Z為羥基的聚合物結合蒽環A，其中R2為羥基的中間體B(如上所定義)在無水二甲亞砜中，用肽基蒽環化合物5在室溫下處理15小時。適當地使用14%w/v的B和2.3%w/v的5。用丙酮沉淀此共軛體，溶于絕對乙醇中，其典型濃度為8%(w/w)，再用丙酮沉淀，得到如上所定義的式A聚合物結合的蒽環衍生物。
共軛體A的蒽環含量通過分析酸水解后從結合的蒽環中釋放出來的糖苷配基來測定；這樣，亞德里亞霉醌(driamycinone)為阿霉素和4’-表阿霉素的糖甘配基片段，4-去甲氧基柔毛霉醌為4-去甲氧基柔紅霉素的糖苷配基。
本發明的聚合物結合的蒽環化合物具有良好的水溶性、生物相容性、在生理PH下的穩定性，在與溶酶體酶孵育后釋放游離活性藥物，D-NH2。
式A化合物在實驗模型中顯示抗腫瘤活性增強，并且與游離蒽環化合物相比全身毒性降低。
式A的聚合物結合的蒽環化合物具有抗腫瘤活性。因此可用包括服用治療有效量的式A聚合物結合的蒽環化合物的方法來治療人或動物。病人或動物的狀況可因此得到改善。
所采用的劑量范圍取決于給藥途徑和欲治療病人的年齡、體重和狀態。式A的聚合物結合的蒽環化合物典型地通過非胃腸內給藥，例如肌內注射、靜脈注射或大團輸注。適宜的劑量范圍為5-800mg/m2蒽環當量，例如20-500mg/m2。適宜的原則是將25mg蒽環當量/m2的溶液靜脈給藥，體積為10ml/kg體重，給藥周期2周，時間為第5、9和15天。
式A的聚合物結合的蒽環化合物可與藥用載體或稀釋劑一起配制成藥物組合物。一般將此聚合物結合的蒽環化合物配制成用于非胃腸內給藥的劑型，例如溶解于無菌水或注射用水中。
下列實施例進一步說明本發明。
實施例1-6涉及制備式6和7的單體及中間體B的合成步驟。
實施例1[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]2-羥基丙胺(6b) 按照Makromol.Chem.178，2159(1977)中所述方法制得的甲基丙烯酰甘氨酰對硝基苯基酯(7a5.28g，20mmol)，溶解在無水四氫呋喃(20ml)中，用1-氨基-2-羥基丙烷(3.2ml，40mmol)處理。室溫下20分鐘后，減壓除去溶劑，用丙酮/乙酸乙酯結晶后回收標題化合物6b(3.3g，收率82.5%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為二氯甲烷/丙酮(體積比90∶10)Rf=0.47實施例2[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羥乙胺(6c)
攪拌下向1-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(37g，0.15mol)和氨基乙醇(9.75g，0.15mol)在無水甲苯(150ml)中的混合物中，15分鐘內滴加溶于無水甲苯(300ml)中的甲基丙烯酸(14ml，0.165mol)。在室溫下攪拌反應混合物24小時。用正己烷沉淀后回收到標題化合物6c。在Kiesegel板F254(Merck)上的TLC，洗脫系統為二氯甲烷/丙酮(體積比90∶10)，Rf=0.35。
實施例3[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]2，3-二氯苯基酯(7b) 從如Makromol.chem.178，2159(1977)中所述制得的甲基丙烯酰甘氨酸(2.66g，20mmol)和2，4-二氯苯酚在無水四氫呋喃(50ml)中，在DCC(4.2g，21mmol)存在下制得標題化合物7b。化合物7b(4.7g，收率80%)從乙酸乙酯和正己烷中結晶。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為乙醚，Rf=0.47。
實施例4N-甲基丙烯酰胺-2-羥基丙烷和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(B2)
將N-甲基丙烯酰胺-2-羥基丙烷(25.2g，0.18mol)、甲基丙烯酰甘氨酸(2.86g，20mmol)和α，α’-偶氮(二)異丁腈(5.9g)溶解在無水甲醇(164ml)中。混合物在60℃、氮氣下保持20小時，然后攪拌下將反應混合物加入丙酮(2000ml)中。收集沉淀，用丙酮洗滌，干燥至恒重，得到標題聚合物B2(26g)。羧基含量(w)10mol%。
實施例5[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]L-羥基丙胺和N-(甲基丙烯酰甘氨酰)2，4-二氯苯基酯的共聚物(B3) 如Mdkromol.Chem.178，2159(1977)中所述，化合物6b(14.4g，72mmol)和化合物7b(5.19g，18mmol)在無水丙酮(300ml)中在α，α’-偶氮(二)異丁腈(1g，6mmol)存在下聚合為標題化合物B3。從反應混合物中過濾回收聚合物，溶解在絕對乙醇中并用丙酮再沉淀。氯含量計算值6.89mol%，實測值2.84mol%(w)。
實施例6[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羥乙胺和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(B4) 如實施例2中所述，從N-甲基丙烯酰胺-2-羥乙烷(6c23.2g，0.18mol)、甲基丙烯酰甘氨酸(2.86g，20mmol)和α，α’-偶氮(二)異丁腈(5.9g)在無水甲醇(164ml)中制備標題聚合物中間體B4。羧基含量(w)10%。
實施例7-12涉及制備式5的肽基-蒽環化合物的方法。
實施例7N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰4-硝基苯基酯將如J.Org.Chem，47，1324(1982)中所述制得的N-三苯甲基-L-苯丙氨酸(20.3g，50mmol)溶解在無水四氫呋喃(150ml)中，并加入無水N-羥基苯并三唑(8gr)。將此混合物冷卻至0℃并用1，3-二環己基碳化二亞胺(11.7gr，50mmol)處理，10分鐘后，滴加L-亮氨酰甘氨酸乙酯對甲苯磺酸鹽(20g，50mmol)在無水四氫呋喃(100ml)和N-甲基嗎啉(7ml)的混合物中的溶液。反應混合物在0℃下保持1小時，再在室溫下過夜，然后過濾，減壓除去溶劑。粗品用乙酸乙酯溶解，依次用冷的5%檸檬酸水溶液(3×100ml)、冷的5%碳酸氫鈉水溶液和水洗滌，然后濃縮，在硅膠上層析，用二氯甲烷和甲醇的混合物(體積比99∶1)洗脫，得到N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰丙氨酸乙酯(18g，30mmol)，后者在95%乙醇(400ml)中室溫下用1N氫氧化鈉(30ml)處理2小時。轉化為相應的酸8a(17g)。
在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為二氯甲烷/甲醇(體積比80∶20)，Rf=0.53。
1H-NMR(200 MHz，CDCl3)0.88(d，J=5.9Hz，6H，δ+δ′Leu);1.2-1.6(m，3H，B+_Leu);2.00(dd，J=5.7Hz，J=13.4Hz，1H，BPhe);2.83(dd，J=5.2Hz，J=13.4Hz，1H，B′Phe);3.51(t，J=5.4，1H，aPhe);3.99(d，J=4.4Hz，2H，a+a′Gly);4.55(m，1H，aLeu);6.8-7.4(m，22H，NHgly，NHLeu，4-C6H5).
將化合物8a溶解在無水四氫呋喃(450ml)中，并加入對硝基苯酚(5.5g，40mmol)。混合物被冷卻至0℃，滴加1，3-二環己基碳化二亞胺(8.24g，40mmol)，4℃下保持過夜。然后過濾混合物并減壓除去溶劑。將殘余物溶解在乙酸乙酯中，冷卻至0℃。一小時后過濾此混合物并除去溶劑，從乙醚中結晶后得到標題化合物9a(20g，收率97%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為乙醚Rf=0.80。
FD-MSm/z699[M+H]+1H-NMR(200MHz，CDCl3)0.86(d，J=6.2Hz，3H，δLeu);0.88(d，J=6.4Hz，3H，δ′Leu);1.2-1.8(m，3H，B+_Leu);1.90(dd，J=5.9Hz，J=13.5Hz，1H，BPhe);2.89(dd，J=4.6Hz，J=13.5Hz，1H，B′Phe);3.52(dd，J=4.6Hz，J=5.9Hz，1H，aPhe);4.0-4.4(m，3H，aLeu，a+a′Gly);6.78(t，J=5.7Hz，1H，NHGly);7.04(d，J=7.7Hz，1H，NHLeu);6.8-7.4(m，22Hz，4-C6H5and 2，6 COO NO2);8.25(m，2H，5，5 COO NO2).
實施例8N-三苯甲基-甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰對硝基苯基酯如實施例7所述方法制備的中間體N-三苯甲基-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酸乙酯(6g，10mmol)，在室溫下用75%乙酸水溶液處理一小時，得到L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰乙酯，后者與N-三苯甲基-甘氨酸(3g，10mmol)在N-羥基苯并三唑和1，3-二環己基碳化二亞胺存在下縮合，然后水解并用對硝基酚以如實施例7的方法活化，得到標題化合物9b(3.8g，收率50%)。在Kiesel-gel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為乙醚Rf=0.63。FD-MSm/g755[M+H]+。
實施例93’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a) 溶解于無水二甲基甲酰胺(50ml)和三乙胺(0.5ml)中的阿霉素鹽酸鹽，與如實施例7所述方法制備的N-三苯甲基-丙氨酰亮氨酰甘氨酰對硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)反應。反應混合物在室溫下保持過夜，然后用乙醚和正己烷1∶1的混合物沉淀。固體通過硅膠柱純化，用二氯甲烷和甲醇(體積比98∶2)的混合物洗脫，得到N-保護的肽基阿霉素10a(4.6g)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為二氯甲烷/甲醇(體積比95∶5)Rf=0.35。
FD-MSm/g1103[M+H]+化合物10a用75%乙酸水溶液(250ml)在室溫下溶解一小時，然后用水和二氯甲烷的1∶1混合物(2500ml)稀釋，用固體碳酸氫鈉調PH到7。分離有機相，減壓除去溶劑，得到標題化合物5a(3.45g，收率80%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，用二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(體積比80∶20∶7∶3)展開。
R=0.5.FD-MS:m/z 861[M+H]+1H-NMR(400MHz，DMSO)0.80(d，J=6.4Hz，3H，δLeu);0.83(d，J=6.4Hz，3H，δ′Leu);1.10(d，J=6.8Hz，3H，6′CH3);1.3-1.6(m，4H，B+_Leu and 2′eqH);1.83(ddd，J=2.8Hz，J=13.2Hz，J=13.2Hz，1H，2′axH);2.09(dd，J=6.0Hz，J=14.5Hz，1H，8axH);2.18(d，J=14.5Hz，1H，8-eq);2.8-3.2(m，4H，10CH2and BPhe);3.36(m，1H，4′);3.64(m，2H，aGly);3.95(s，3H，OCH3);3.9-4.1(m，2H，3′and aPhe);4.15(q，J=6.4Hz，1H，5′H);4.29(q，J=7.7Hz，1H，aLeu);4.55(s，2H，14CH2);4.7-5.0(m，3H，7H and 4′OH and 14OH);5.20(d，J=3.4Hz，1H，1′H);5.46(s，1H，9OH);7.1-7.3(m，5H，Ar-Phe);7.54(d，J=8.5Hz，1H，3′NH);7.63(m，1H，3H);7.88(m，2H，1H and 2H);8.17(m，4H，NH+and NHGly);8.70(d，J=8.1Hz，1H，NHLeu);13.23(s，1H，11OH);14.00(s，1H，6OH).
實施例103’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰甘氨酰)阿霉素(5b)
將鹽酸阿霉素(2.9g，5mmol)與如實施例8所制備的N-三苯甲基-甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰對硝基苯基酯(9b3.8g，5mmol)反應，然后如實施例9所述用75%乙酸水溶液處理，得到標題化合物5b(4g，收率90%)。
在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，用二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(體積比80∶20∶7∶3)展開，Rf=0.44，FD-MSm/g938[M+H]+實施例114-去甲氧基-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)柔紅霉素(5c) 采用實施例9中指述的相同步驟，從4-脫甲氧基柔紅霉素鹽酸鹽(2.9g，5mmol)和N-三苯甲基-苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰對硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)制備了標題化合物5c(3g，收率75%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(體積比80∶20∶7∶3)展開，Rf=0.51。
FD-MS:m/z 815[M+H]+1H-NMR(200 MHz，CDCl3)0.84(d，J=6.0Hz，3H，δLeu);0.88(d，J=6.0Hz，3H，δ′Leu);1.27(d，J=6.4Hz，3H，6′CH3);1.4-1.7(m，3H，B+Leu);1.7-2.0(m，2H，2′CH2);2.06(dd，J=4.2H，J=14.9Hz，1H，8axH);2.32(d，J=14.9Hz，1H，8eqH);2.40(s，3H，COCH3);2.70(dd，J=8.6Hz，J=13Hz，1H，BPhe);3.12(dd，J=4.2Hz，J=13.7Hz，1H，B′Phe);2.94，3.23(two d，J=19.2Hz，2H，10CH2);3.5-3.8(m，3H，4′H，aPhe and aGly);3.9-4.3(m，4H，a′Gly，aLeu，5′H，3′H);5.19(m，1H，7H);5.45(d，J=2.7Hz，1H，1′H);6.9-8.4(m，12H，1H，2H，3H，4H，ArPhe，3′NH，NHGly，NHLeu).
實施例124’-表-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5d) 用實施例9中描述的相同步驟，從4’-表阿霉素鹽酸鹽(2.9g，5mmol)和N-三苯甲基-苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰對硝基苯基酯(9a3.5g，5mmol)制備了標題化合物5d(3.25g，收率86%)。在Kieselgel板F254(Merck)上的TLC，展開系統為二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(體積比80∶20∶7∶3)展開，Rf=0.46，FD-MSm/g861[M+H]+。
1H-NMR(400 MHz，DMSO)0.79(d，J=6.3Hz，3H，δLeu);0.81(d，J=6.3Hz，3H，δ′Leu);1.19(d，J=5.9Hz，3H，6′CH3);1.3-1.6(m，4H，2′Hax，B，B′Leu，_Leu);1.82(dd，J=4.7Hz，J=12.5Hz，1H，2′Heq);2.1-2.3(m，2H，8-CH2);2.59(dd，J=8.2Hz，J=13.7Hz，1H，BPhe);2.9-3.1(m，4H，B′Phe，10-CH2，h′H);3.41(dd，4.7Hz，J=8.2Hz，aPhe);3.54(dd，J=5.5Hz，J=16.4Hz，1H，aGly);3.67(dd，J=6.2Hz，J=16.4Hz，1H，a′Gly);3.80(m，1H，3′H);3.90(m，1H，5′H);3.95(s，3H，OCH3);4.18(m，1H，aLeu);4.55(m，2H，14-CH2);4.3-5.0(m，3H，14-OH，7H，4′-OH);5.17(d，J=3.1Hz，1H，1′H);5.46(s，1H，9-OH);7.1-7.3(m，5H，Ar-Phe);7.53(d，J=8.2Hz，1H，NH-Gly);7.60(m，1H，3H);7.86(m，2H，1H，2H);8.05(d，J=6.4Hz，1H，NH-Leu);8.11(t，J=5.9Hz，1H，NH-Gly).
實施例133-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A1)
將如實施例4中所述方法制備的聚合物前體B2(7.15g，5mmol的-COOH)、和3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a2.36g，2.5mmol)溶解在無水二甲基甲酰胺(100ml)中，然后加入N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(0.7g，2.5mmol)。攪拌下，混合物在室溫保持24小時，然后傾入乙醚(800ml)中。沉淀用乙醇(100ml)溶解，再用丙酮(800ml)沉淀，干燥至恒重，得到標題化合物A1(7g)。鹽酸阿霉素含量9%(w/w)。
實施例143-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和(N-甲基丙烯酰甘氨酰)2-羥基丙胺的共聚物(A2)
按Makromal.chem.178，2159(1977)中所述方法制備的聚合物前體B1(10g，2.7×10-3當量的對硝基苯基酯)，溶解在干燥的二甲基甲酰胺(60ml)中，加入3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5a0.53g，1.72mmol)。攪拌下混合物在室溫保持24小時，然后加入1-氨基丙醇(0.13ml)。一小時后，將反應混合物中加入攪拌下的丙酮/乙醚(體積比3/1，1.21)的混合物中，并過濾。沉淀用乙醇(150ml)溶解，用丙酮/乙醚(1.21，體積比4/1)沉淀，得到式A2的聚合物10g。鹽酸阿霉素含量9%(w/w)。實施例13-18說明制備式A的聚合物結合的蒽環衍生物的步驟。
實施例153-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、4-去甲氧基-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)柔紅霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A3)
如實施例13，4-去甲氧基-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)柔紅霉素(5d1.48g，1.72mmol)與聚合物前體132(10g)在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(0.48g)存在下，在無水二甲基甲酰胺中反應，得到標題化合物A3。
4-去甲氧基柔紅霉素鹽酸鹽含量9%(w/w)。
實施例163-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羥基丙烷的共聚物(A4)
如實施例14，4’-表-3’-N-(甘氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e1.48g，1.72mmol)與聚合物前體B1反應，然后與1-氨基丙醇(0.13ml)反應，得到式A4的4’-表-阿霉素聚合物共軛體(10g)。4’-表阿霉素鹽酸鹽含量9%(W/W)。
實施例173-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A5)
如實施例13，從聚合物中間體B2、4’-表-3’-N-(甘氨酰亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e)和N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉在無水二甲基甲酰胺中反應，制備了標題化合物。
實施例18[N-(甲基丙烯酰甘氨酰)]-羥基乙胺、3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和N-甲基丙烯酰甘氨酸的共聚物(A6)
如實施例13所述方法，通過聚合物中間體B4和3’-N-(甘氨酰-亮氨酰-L-苯丙氨酰)阿霉素(5e)，在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉存在下，在無水二甲基甲酰胺中縮合，制備了標題化合物聚合物前藥A6。
實施例19化合物A1對M5076的抗腫瘤活性實施例13描述的A1的抗腫瘤活性測試如下材料和方法1.給藥所有藥物溶液都在使用前即時制備。在第5、9和15天靜脈內給藥10ml/kg體重，進行治療。蒽環化合物溶解在無菌水中，用分光光度法測定其濃度。冷干的聚合物溶解在水中形成25mg蒽環當量/ml的起始溶液，根據所報導的濃度，用水進行進一步稀釋。
2.實體瘤通過系列肌內通道得到M5076鼠網狀肉瘤，并皮下植入(5×105細胞/鼠)(75B1/6鼠以評估對原發腫瘤的活性。
3.測定抗腫瘤活性和毒性腫瘤生長用測經器測量，腫瘤重用Geran等的方法估測，見Cancerchemother.Rep.3，1(1972)。
抗腫瘤活性用腫瘤重達到一克所需時間(天)來測定，報告為腫瘤生長延遲(TGD)。
用下式計算存活時間的平均增長值(T/C%)T/C%= (治療組的平均存活時間)/(對照組的平均存活時間) ×100在體重減小、肉眼觀察和手觸摸到的肝脾縮小來評價毒性。神經毒性用喪失運動機能的鼠的數目來測定。
結果列于表1中表1化合物劑量1TDG2A.U.C T.C.3Tox4LTS5無腫瘤者6mg/kg(1g)抑制率%%對照--150/100/10阿霉素7.535901480/260/260/2610.0391001533/260/260/26A130.0801003780/104/103/1040.0nd100>3690/106/105/1050.0nd100>3692/10*7/107/10
皮下注射5×105個細胞/鼠nd=未測定*神經毒性1在第5、9、15天給藥治療2TDG=腫瘤增長延遲3被治療鼠的平均存活時間/對照組的平均存活時間×1004中毒死亡數目/鼠總數5長時間存活者6實驗結束時無腫瘤的鼠實施例20化合物A3對M7076的抗腫瘤活性用實施例19的方法和材料測試實施例15描述的A3的抗腫瘤活性。結果示于表2中
表2化合物劑量1TDG2A.U.C T.C.3Tox4LTS5無腫瘤者6mg/kg(1g)抑制率%%對照--150/100/104-去甲氧1.019471420/90/90/9基柔紅霉素1.528801600/90/90/9A34.0491001980/100/100/105.0501002050/100/100/106.0551002120/90/90/9皮下注射5×105個細胞/鼠*神經毒性1在第5、9、15天給藥治療2TDG=腫瘤增長延遲3被治療鼠的平均存活時間/對照組的平均存活時間×1004中毒死亡數目/鼠總數5長期存活者
6實驗結束時無腫瘤的鼠化合物A4(3-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羥基丙烷的共聚物)的抗腫瘤活性與4’-表阿霉素鹽酸鹽比較對4’-表阿霉素鹽酸鹽和化合物4用相同的處理方法，測試其抗腫瘤活性。
對早期M5076鼠網狀肉瘤，化合物4在所有試驗劑量下都比游離藥物活性高(表3)表3.化合物4與4’-表阿霉素鹽酸鹽相比，對M5076鼠網狀肉瘤的抗腫瘤活性。
化合物劑量1TDG2A.U.C. T.C.3TOX4mg/kg(1g)抑制率%%4'-表阿霉522511050/9素鹽酸鹽7.534901240/91040991250/9A4/920621002190/930711002290/9皮下注射5×105個細胞/鼠1在第5、9、15天給藥治療2TDG=腫瘤增長延遲3被治療鼠的平均存活時間/對照組的平均存活時間×1004中毒死亡數目/鼠總數化合物4-(3-甲基丙烯酰氨基-2-羥基丙烷、4’-表-3’-N-(甲基丙烯酰甘氨酰-L-苯丙氨酰-L-亮氨酰甘氨酰)阿霉素和1-N-(甲基丙烯酰甘氨酰)-2-羥基丙烷的共聚物)的毒性與4’-表阿霉素鹽酸鹽比較對健康的C57B1F鼠靜脈給以單一劑量的4’-表阿霉素鹽酸鹽(13.2-16.15-19-20.6-25.2和33.2mg/kg)和化合物A4(50-63-79-100-120-140mg/kg)來評價其毒性。
恢復三周后進行Probit分析，以確定在健康C57 B1F鼠體的LD10和LD50。
用下式計算治療指數治療指數= (DE50(半數有效量))/(LD50(半數致死量))半數有效量為使腫瘤生長減少50%的劑量。觀察90天內動物的安全性。
在C57 B1/F鼠中的LD10和LD50值如下化合物 LD10LD50(mg/kg)(mg/kg)4'-表阿霉素鹽酸鹽16.421.4A4128.0389(外推值)化合物A4的低毒性允許給藥劑量更大，達到與4’-表阿霉素鹽酸鹽等同更好的效果，得到更好的治療指數。4’-表阿霉素鹽酸鹽和化合物A4的治療指數分別為3和40。
權利要求
1.式A的聚合物結合的蒽環化合物，其基本由式1、2和3代表的三個單元組成 其中Gly代表甘氨酸；n為0或1；x為70-98mol%，y為1-29mol%，z為1-29mol%，R1為被一個或多個羥基取代的C1-6烷基；Y為氨基酸殘基或肽間隔基；[NH-D]為蒽環氨基糖甙[NH2-D]的殘基；及Z為羥基或式-NHR1的殘基，其中R1如上所定義。
2.根據權利要求1的聚合物結合的蒽環化合物，其中[NH-D]為下式Q的蒽環氨基糖甙的殘基 其中RⅠ和RⅡ之一為氫原子，另一個為羥基或碘原子，RⅢ為氫原子OCH3，RⅣ為氫原子或羥基。
3.根據權利要求1或2的聚合物結合的蒽環化合物，其中x為90-98mol%，y為1-10mol%，z為1-10mol%。
4.根據權利要求1、2或3的聚合物結合的蒽環化合物，其中R1為羥乙基、2-羥丙基或3-羥丙基。
5.根據前述權利要求中任一項的聚合物結合的蒽環化合物，其中Y為Gly-Phe-Gly、Gly-Leu-Gly、Phe-Leu-Gly、Gly-Phe-Leu-Gly、或Leu-Leu-Gly。
6.根據前述權利要求中任一項的聚合物結合的蒽環化合物，其中[NH-D]為阿霉素、4’-表阿霉素、4’-去甲氧基-柔紅霉素、idarubicin或4’-碘、4’-脫氧阿霉素的殘基。
7.權利要求1中定義的式A聚合物結合的蒽環化合物的制備方法，該方法包括ⅰ)聚合物中間體B，其中B基本由下式1和4的單元組成 其中式1中x、n和R1如權利要求1中所定義，W為30-2mol%，R2為羥基或離去基團；與通式5的蒽環衍生物反應其中[NH-D]和Y如權利要求1中所定義；和ⅱ)必要時為制備其中式3的單元中Z為-NHR1的聚合物結合的蒽環化合物，將其中R2為離去基團的ⅰ)步的產品與式NH2R1的化合物反應，其中R1如上所定義。
8.式5的蒽環衍生物其中[NH-D]和Y如權利要求1或2中所定義。
9.如權利要求8所定義的式5的蒽環衍生物的制備方法，該方法包括(ⅰ)式8和9的N-保護的肽其中R3為對酸敏感的氨基保護基，P為離去基團，Y如權利要求7中所定義，與蒽環衍生物[NH2-D]反應，生成通式10的中間體。其中[NH-D]如權利要求1或2中所定義，Y和R3如上所定義，及ⅱ)除去保護基R3，得到游離堿形式的肽基-蒽環衍生物5。
10.藥物組合物，其含有藥用載體或稀釋劑，和作為活性成分的權利要求1-6中任一項要求的聚合物結合的蒽環化合物或權利要求8所要求的式5的蒽環衍生物。
全文摘要
本發明提供式A的聚合物結合的蒽環衍生物，其基本由式1、2和3代表的三個單元組成，其中Gly為甘氨酸；n為0或1；x為70—98mol％；y為1—29mol％；z為1—29mol％，R
文檔編號C07K5/107GK1108454SQ94190242
公開日1995年9月13日 申請日期1994年4月8日 優先權日1993年5月11日
發明者F·安吉勤克, M·格蘭迪, A·蘇拉托 申請人:法米塔利亞·卡洛·埃巴有限責任公司