專利名稱：有機銅絡合物及其作為抗癌劑和用于保護正常組織免受電離輻射的用途的制作方法
有機銅絡合物及其作為抗癌劑和用于保護正常組織免受電
離輻射的用途本發明涉及有機銅絡合物以及包含該有機銅絡合物的藥用組合物。它們尤其可 用于治療由過度增生細胞引起的疾病，且可保護正常組織免受電離輻射。它們是通過使 丙烯酸銅(copper (II)acyIate)與有機化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸性至中性pH條 件下反應制得的，該有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶肉瘤素)、 其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(tegafur，替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶 (Ieacadin)0過度增生細胞是引起各種疾病的原因，特別是由術語“癌”概述的臨床型疾病，這 些疾病通常具有致命結果。過度增生在組織結構中造成組織新生與細胞可控死亡之間的不 平衡。天然的體內平衡發生紊亂。在組織形成與退化之間的微妙平衡是由細胞凋亡過程調 節的。細胞凋亡是指可由任何細胞進行的程序性細胞死亡。細胞受到特定信號的反應刺激 后，激活細胞內進程，該進程在未引起炎性過程的情況下造成細胞的自衰變。這樣，可避免 細胞和組織的過度增生。對于治療由過度增生細胞引起的疾病，除了外科切除可定域的腫瘤之外，在臨床 實踐中還正嘗試通過諸如化學療法、放射療法和高熱療法的細胞毒素方法摧毀腫瘤細胞和 重建平衡。然而，已發現有部分惡性腫瘤在相當早的階段逐漸具有輻射或化學抗性，甚至起 初難以醫治。腫瘤的發生和轉移在其對特殊治療的響應性能方面有時相當不同。由于這 樣的抗性，很多癌的治療效果始終不能令人滿意。對于治療兒童期急性成淋巴細胞性白血 病(acute lymphoblasticleukemia,ALL)的復發尤其如此。盡管使用具有攻擊性的細胞毒 素療法，仍有約60%身患ALL復發的孩子死亡。其他難以醫治的腫瘤疾病例如還有乳腺腫 瘤、支氣管腫瘤、甲狀腺腫瘤、前列腺腫瘤、以及黑素瘤、成神經細胞瘤、成神經管細胞瘤、星 細胞瘤和成膠質細胞瘤。同樣地，使用細胞生長抑制藥物可治療由過度增生細胞引起的良 性狀況，但仍需顯著提高這些細胞生長抑制藥物的療效。在WO 03/004014A1中已描述美法侖(Melphalan，苯丙氨酸氮芥)、替加氟和 leacadin的單晶二酮銅絡合物，這些絡合物可用作抗癌劑。此外，美法侖(Melphalan，苯丙 氨酸氮芥)、替加氟和leacadin本身就是細胞生長抑制劑。然而，人們對開發出其他能夠有助于提高治療成功率和提高生存可能性的活性物 質具有濃厚興趣和強烈需求。因此，本發明旨在發現某些化合物，這些化合物對于過度增生 的耐藥細胞具有高度選擇性，且適用于治療腫瘤疾病和白血病，而不會對正常細胞造成過 度傷害。本發明的另一目的是提供一些在對人體進行電離輻射的治療期間可保護正常組織 的化合物，以治療疾病或延緩病情發展。可通過新的有機銅絡合物實現本發明的目的，該新有機銅絡合物可通過由丙烯酸 銅與有機化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸性至中性的PH條件下反應獲得。根據本發明， 所述有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(D，L-苯丙氨酸氮芥，溶肉瘤素) 及其氫氯化物、N-(2-fUranidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶(2-氨基甲 酰氮丙啶，leacadin) 0在一優選方式中，丙烯酸銅優選采用醋酸銅(II)或丙酸銅(II)。
人們發現，本發明所述的有機銅絡合物對于過度增生的耐藥細胞具有高度選擇 性，適用于治療腫瘤疾病和白血病。令人驚奇的是，它們也能夠例如在腫瘤切除后的放射治 療期間或在腫瘤照射治療中保護正常組織免受輻射損害，因此可用于放射療法。此外，人們 發現，當本發明所述的有機銅絡合物與已知的細胞生長抑制劑結合時，還能在癌的治療中 顯示出協同效應。此外，本發明所述的有機銅絡合物顯示出顯著的抗氧化活性，因此也可在 例如與腫瘤疾病有關的炎性疾病的治療中用作抗氧化劑。本發明所述的銅絡合物優選通過混合和加熱起始物料的溶液的方式制得。絡合物 在冷卻時沉淀析出，可使用由氯仿/甲醇混合物作為溶劑的洗液反復對其清洗凈化，并隨 后使之干燥。為使反應順利進行，必須保持從酸性至中性環境的PH值范圍。這些絡合物是 微晶結構的化合物，其中銅處于四面體中，且有機化合物通過氧和/或氮原子與銅鍵合。本發明所述的方法具有以下優選特點，即將丙烯酸銅和有機化合物均溶于氯仿/ 甲醇混合物中，且該有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶肉瘤素)、 其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶(leacadin)。 在反應結合后，必要時使溶液酸化，且優選加熱至50°C，可選加熱至沸騰。必要時清洗在冷 卻之后生成的沉淀物，且優選在空氣中使之干燥。氯仿/甲醇混合物的比例優選為1 1 至 3 1。根據本發明，優選提供下列有機銅絡合物a)銅-溶肉瘤素氫氯化物絡合物(絡合物A)，熔點為147°C，包含15.0% Cu、 37. 3% C、4. 43% H、24. 4% Cl,6. 74% N、以及0，如通過溶肉瘤素氫氯化物與醋酸銅(II)在 PH約為2至3的條件下反應制得。b)銅-溶肉瘤素絡合物(絡合物B)，熔點為177°C，包含9. 2% Cu、45. 3% C、5. 4% H、20. 6% Cl,8. 1% N、以及0，如通過溶肉瘤素與醋酸銅(II)在pH約為6至7的條件下反
應制得。c)銅-替加氟絡合物(絡合物C)，熔點為127 °C，包含26. 8% Cu、18. 16 % C, 3. 08% H、25. 3% Cl,3. 39% N、以及0和F，如通過替加氟與醋酸銅(II)在pH約為1的條 件下反應制得。這些碳、氮和氯的元素分析值的偏差平均小于3%，且所引述的氫和銅的分析值的 偏差平均最高達4.5%。本發明也旨在提供一種藥用組合物，該藥用組合物包含至少一種新的有機銅絡合 物、以及可選藥用助劑和/或輔料。采用已知的方法制備所述藥用組合物，且本發明所述的絡合物優選與適當的藥物 輔料結合。該組合物中活性物質的含量通常為0. 1%至99.5% (以重量百分比計)，優選為 總混合物的0. 5%至95% (以重量百分比計)。本發明所述的藥用組合物可具有不同的給藥形式。它通常包含至少一種本發明所 述的絡合物以及無毒的藥用耐受輔料，這些無毒的藥用耐受輔料例如以固體、半固體或液 體的形式呈現為混合物或稀釋液，或者例如以容納治療性活性成分的膠囊外囊、片劑包衣、 包袋或其他容器形式的涂層劑。輔料例如可以是為體內藥物吸收的介質，或者制劑助劑、甜 味劑、矯味劑、染料或防腐劑。本發明所述的藥用組合物的給藥途經主要有口服、腹膜內、氣管內、腹內、靜脈內、經過皮膚或肌肉內，或使用微灌腸劑的給藥形式。也可能采取肺部給藥形式。所述藥用組合物的腸胃外給藥可使用無菌注射水溶液、等滲鹽溶液或其他溶液。水性懸浮液中可包含諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基纖維素、藻酸鈉、 聚乙烯吡咯烷酮、黃芪膠或阿拉伯樹膠的助懸劑、諸如聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯基氧化 十六烷醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)、聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯或卵磷脂的分散 劑和潤濕劑、諸如羥基苯甲酸甲酯或羥基苯甲酸丙酯的防腐劑、以及諸如蔗糖、環拉酸鈉、 葡萄糖、轉化糖漿的調味劑和甜味劑。油性懸浮液中例如可包含花生油、橄欖油、芝麻油、椰子油或石蠟油，還可包含諸 如蜂臘、固體石蠟或十六烷醇的增稠劑，以及甜味劑、調味劑和抗氧化劑。水分散性粉末和顆粒中可包含本發明所述的絡合物，它們與分散劑、潤濕劑和助 懸劑構成混合物，例如如上所述，可選還混合有甜味劑、調味劑和染料。除了諸如黃芪膠、阿拉伯樹膠、聚氧乙烯山梨坦單油酸酯的乳化劑之外，乳狀液中 例如還可包含花生油、橄欖油或石蠟油、以及調味劑和甜味劑。水溶液中可包含諸如羥基苯甲酸甲酯或羥基苯甲酸丙酯的防腐劑、以及增稠劑和 調味劑，還可包含諸如蔗糖、甜蜜素、葡萄糖、轉化糖漿的甜味劑、以及著色劑。優選將橄欖油、DMS0、吐溫(TWEEN) 60或80或生理鹽水用作稀釋液和溶劑。例如，容納諸如明膠、分散性粉末、顆粒、水性和油性懸浮液、乳狀液、溶液或糖漿 的片劑、包衣片劑、膠囊可用于口服。片劑中可包含諸如淀粉、乳糖、微晶纖維素、葡萄糖、碳 酸鈣或氯化鈉的惰性填充劑、諸如淀粉PEG、PVP、明膠、纖維素衍生物、藻酸鹽或阿拉伯樹膠 的粘合劑、諸如硬脂酸鎂、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅油或滑石粉的潤滑劑、以及崩解劑、 矯味劑或著色劑。對于口服，所述藥用組合物優選以在油中微細分散的形式存在，或作為靜脈注射 液或輸液，或使用片劑形式。令人驚奇的是，所述有機銅絡合物即使在口服中也仍能發揮它 們的全部療效，這意味著它對于治療和減輕病人的病情具有相當大的優勢。有利地，可將活性物質的藥物制劑調整至所需給藥的單位劑量形式。例如，單位劑 量可以是片劑、膠囊、栓劑或適當體積的粉末、顆粒、溶液、乳狀液或懸浮液或分散體。本發明所述絡合物的每日劑量大體上為0. 01至10mg/kg體重，可選使用多個單劑 量形式，以獲得所需效果。單劑量中包含數量在0. 01至10mg/kg體重之間的絡合物。人們發現，本發明所述的銅絡合物幾乎只在腫瘤組織中累積，此外還能穿越血腦 屏障。因此，新的有機銅絡合物優選用于若干腫瘤疾病的治療中。本發明所述的化合物可用 于各種不同疾病的治療中，尤其是由高度增生細胞引起的疾病，例如可用于骨髓和其他造 血器官、白血病、固體腫瘤、上皮腫瘤、肉瘤以及惡性和半惡性皮膚病的惡性疾病治療中。本 發明所述的絡合物可強烈誘發癌細胞的凋亡，即使這些細胞對于傳統治療劑具有抗性。它 們在惡性細胞中可誘導P53蛋白質的表達、以及環孢菌素A孔的開啟。例如，在對道諾霉素和阿霉素具有抗性的白血病細胞中，本發明所述的有機銅絡 合物與傳統細胞毒素劑相比可使對細胞凋亡的誘導效果增加二至六倍(參見例5和圖12)。另一優選用途是用于放射療法中，主要用于保護正常組織免受電離輻射。放射療 法(也稱為放射法、放射線療法、放射腫瘤法)是一種將電離輻射在人體和動物體上進行醫 學應用、以治療疾病或延緩病情發展的醫學領域。放射療法的目的是直接摧毀腫瘤細胞。放射療法領域也包括為實現放射敏化作用和加強對腫瘤的輻射效果而采用的藥物性和物理 性方法(化、放療)，同時考慮到對正常組織的保護措施。伽瑪射線、X射線軔致輻射和電子 主要用于高能電離輻射。此外，近幾年已研制出使用中子、質子和重離子治療的儀器。根據 本發明，所述有機銅絡合物用于保護正常組織，且可選與眾所周知的放射療法措施和方法 結合。為此，可根據上述給藥形式和劑量使用本發明所述的絡合物。在本發明的另一實施例中，所述有機銅絡合物可與至少一種另外的細胞生長抑制 劑結合使用(腫瘤治療劑)。更明確地，本發明所述的有機銅絡合物適用于治療下列腫瘤疾病，為此它們可單 獨使用、或與放射療法措施/方法結合使用、以及/或與傳統腫瘤劑結合使用腸癌、腦部腫 瘤、眼部腫瘤、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、乳癌、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、皮膚癌、睪丸癌、腎腫瘤、 生殖細胞腫瘤、肝癌、白血病、惡性淋巴瘤、神經瘤、成神經細胞瘤、前列腺癌、軟組織腫瘤、 食道癌、以及未知的原發性腫瘤。在一優選方式中，使身患腫瘤疾病的病人服用劑量足以治療各個腫瘤的所述藥用 組合物。所述藥用組合物的服用劑量取決于許多因素，例如特定銅絡合物和可選其他絡合 物的選擇、同時服用的藥物、給藥方式(口服、輸液、注射等)、腫瘤疾病的性質和嚴重程度、 以及病人的年齡、重量和一般狀況。腫瘤疾病領域的醫務人員在考慮上述因素的情況下容 易確定劑量。通常優選在單劑量治療期間服用所述銅絡合物，該單劑量在0. 01至10mg/kg 病人體重的范圍內，更優選在0. 5至5mg/kg病人體重的范圍，尤其優選在0. 5至1. 5mg/kg 病人體重的范圍。在此所用的術語“腫瘤”包括任何組織體積的局部增大，且包括生長調節不再正 常、并發生不受控制的細胞分裂的細胞，即以同體組織的自發的、各種不受抑制的、自主的 和不可逆性過度生長的形式形成的組織新生物(例如腫大、胚細胞瘤、瘤形成)，通常與特 定細胞和組織功能的不同顯著性喪失有關。在此使用的術語“腫瘤治療”至少包括下列特征之一減輕與腫瘤疾病有關的癥 狀、降低腫瘤疾病的嚴重程度(例如減緩腫瘤的生長)、穩定腫瘤疾病的狀況(例如阻止腫 瘤的生長)、進一步避免腫瘤疾病的擴散(例如轉移)、避免腫瘤疾病的發生或復發、減慢腫 瘤疾病的病情發展(例如減緩腫瘤的生長)、或改善腫瘤疾病的狀況(例如減小腫瘤的大 小)。可通過制備方法、元素分析、熔點、以及UV/VIS、IR、EPR和NMR光譜清楚地表征本 發明所述物質的特性。本發明所述的絡合物許多重要性能具有顯著優勢，由此明顯優于傳 統的化療劑。本發明所述的銅絡合物幾乎只在腫瘤組織中累積，從而使本發明所述絡合物的治 療副作用較低。此外，這使得有可能使用本發明所述的絡合物檢測惡性細胞。因此，當使用 本發明所述的絡合物和諸如熒光顯微鏡技術的傳統方法時，通過使用本領域技術人員熟知 的適當熒光染料標記本發明所述的絡合物，可檢測出組織中的惡性細胞。同樣地，可使用本 發明所述的絡合物在體外檢測出分離組織中的惡性細胞。本發明所述的絡合物能夠穿越血腦屏障，因此也可用于治療腦部腫瘤。此外，本發 明所述的有機銅絡合物可用于包被腫瘤，從而有助于對該腫瘤的外科切除。本發明也旨在提供組合制劑，該組合制劑中包含本發明所述的銅絡合物、以及就其本身而言已知的細胞生長抑制劑，例如阿糖胞苷、克拉屈濱、依托泊苷、氟達拉濱或伊達 比星。本發明所述的有機銅絡合物當與其他傳統的細胞生長抑制劑結合使用時具有以下優 點，即與使用單制劑相比可顯著增強協同效應。因此，根據本發明，將有機銅絡合物與傳統 的細胞生長抑制劑結合使用。可同時或連續服用兩個成分的組合制劑。傳統細胞毒素劑優 選選自諸如氮芥衍生物、N-亞硝基化合物、環乙亞胺(氮丙啶)衍生物、鉬絡合物的烷基化 和交聯化合物、諸如蒽環類、博來霉素和絲裂霉素的細胞生長抑制性抗生素、諸如葉酸拮抗 劑、嘧啶和嘌呤類似物的抗代謝物、諸如長春花生物堿和紫杉烷的抗有絲分裂物質、以及荷 爾蒙和荷爾蒙拮抗劑。因此，例如，人們發現，銅-溶肉瘤素氫氯化物(絡合物A)與抗代謝物即阿糖胞苷 (AraC)的組合可使療效提高129%。值得注意的是，低于治療劑量的本發明所述絡合物A 已顯示出協同效應(參見例7和圖14)。因此，本發明所述的組合制劑理想地適用于對腫瘤疾病的治療。由于在制劑中存 在本發明所述的絡合物，該組合制劑也可在放射治療期間用于保護正常組織。與附圖結合的下列例子旨在更詳細地說明本發明。


圖1 絡合物A的衍射分析
圖2:絡合物A的UV/VIS光譜
圖3:絡合物A的IR光譜
圖4 絡合物A的Era光譜
圖5:絡合物B的UV/VIS光譜
圖6 絡合物B的IR光譜
圖7:絡合物B的Era光譜
圖8 絡合物C的UV/VIS光譜
圖9 絡合物C的IR光譜
圖10絡合物C的Era光譜
圖11在BJAB模型組上使用絡合物A發生的DNA片段
圖12絡合物A與其他細胞生長抑制劑之間在初級成淋巴細胞中DNA片段方面的比較
圖13在使用絡合物A治療后BJAB細胞中線粒體膜電勢的變化
圖14在淋巴瘤細胞中絡合物A與阿糖胞苷的協同效應
圖15在對小鼠的口服給藥中絡合物A對人類淋巴瘤細胞(BJAB)的效應
圖16當使用絡合物A治療時Walker癌肉瘤的ETO光譜
圖17絡合物A和C對患Ehrlich腹水癌的大鼠的胸腺細胞的NADH狀態和鈣體內平衡的影響
圖18以小鼠的脾為例說明絡合物A和C對電離輻射效應的影響
圖19絡合物A和C的抗氧化劑性能
圖20與溶肉瘤素相比絡合物A對環孢菌素A傳感孔的誘導
圖21絡合物A對人體喉癌Hep-2的細胞培養的影響(核磁共振)
圖22 絡合物A對人體乳腺癌細胞的體外影響(照片1 在4分鐘培育之后；照片 4 在18分鐘培育之后；照片9 在43分鐘培育之后)
實施例例 1制備4_[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸氫氯化物(即溶肉瘤素氫氯化物)的 有機銅絡合物(絡合物A)將0. 0125mol的溶肉瘤素氫氯化物溶于50ml的由1份甲醇與3份氯仿構成的混 合物中(溶液A)。將0. Olmol的醋酸銅(II)同樣溶于50ml的上述混合溶劑中(溶液B)。將溶液B加入到溶液A中，并連續攪拌和加熱至沸騰溫度。將該混合物繼續保持 在沸騰溫度達30分鐘，同時攪拌，并隨后冷卻至室溫。混合物的pH值為2至3。在幾個小時之內沉淀析出綠色微晶沉淀物，隨后使用玻璃粉過濾分離該沉淀物， 再使用上述混合溶劑清洗幾次，并在空氣中在65°C至70°C下干燥。生成的銅絡合物(絡合物A)是微晶粉末，熔點為147°C。由元素分析顯示出下列 成分:Cu 15. 0%, C 37. 3%, H 4. 43%, CI 24. 4%, N 6. 74%, 0 10. 3%0圖1至圖4中顯示絡合物A的其他物理性能。絡合物A不溶于水和大多數有機溶劑中。它溶于二甲基亞砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)中，可在植物油中乳化，且可借助于適當乳化劑(吐溫60和吐 溫80)在水介質中乳化。即使暴露在氧氣中，它在室溫下也是穩定的。M 2制備4_[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(=溶肉瘤素)的有機銅絡合物(絡 合物B)將0. 0125mol的溶肉瘤素溶于50ml的由3份氯仿與1份甲醇構成的混合物中(溶 液A)。將0. Olmol的醋酸銅(II)溶于50ml的上述混合溶劑中(溶液B)。將溶液B加入到溶液A中，并連續攪拌和加熱。將該混合物保持在50°C達約20分 鐘，同時攪拌，并隨后冷卻至室溫。混合物的PH值為6至7。在幾個小時之內沉淀析出藍色微晶沉淀物，使用玻璃粉過濾該沉淀物，并使用溶 劑清洗幾次，且在空氣中在65°C至70°C下干燥。生成的銅絡合物(絡合物B)是微晶粉末，熔點為177°C。由元素分析顯示出下列 成分:Cu 9. 2%, C 45. 3%, H :5. 4%, CI -.20. 6%, N :8. 1%, 0 :11. 6%0圖5至圖7中顯示絡合物B的其他物理性能。絡合物B不溶于水和許多有機溶劑中。它溶于DMS0中，可分散在油中，且可借助 于適當乳化劑(Tween 60和吐溫80)在水介質中乳化。例 3銅絡合物(絡合物C)5-氟_1-(四氫-2-呋喃)尿嘧啶(=替加氟)的制備變異體1將0. Olmol的醋酸銅(II)溶于50ml的氯仿中(溶液A)。
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將0. 02mol的替加氟溶于50ml的由氯仿與甲醇按體積比1 1構成的混合物中 (溶液B)。在水浴中將溶液A和溶液B加熱至沸騰，同時連續攪拌和使用鹽酸酸化。允許將 該混合物置于開口容器中，且置于黑暗中，直到溶劑已蒸發完。通過使用氯仿清洗除去起始 物料中的殘渣，且在空氣中干燥剩余的綠色晶體。生成的銅絡合物(絡合物C)是微晶粉末，熔點為127°C。變異體2將0. Olmol的醋酸銅(II)溶于50ml的按體積比1 1構成的氯仿/甲醇溶液中 (溶液A)。將0. 02mol的替加氟溶于50ml的上述溶劑中(溶液B)。將這兩種溶液加熱至沸騰，且將溶液A加入到溶液B中并連續攪拌。繼續將該混 合物保持在沸騰溫度達30分鐘，同時通過計量方式加入濃縮的HC1將pH值保持在1。在室 溫下蒸發反應混合物，且使用_18°C的甲醇通過玻璃粉清洗干燥的殘渣達3至4次。清液中 包含本發明所述的絡合物C，該絡合物C在甲醇蒸發之后成為殘渣。對絡合物C的元素分析顯示出下列成分:Cu 26. 8%, C 18. 16%, H 3. 08%, CI 25. 3%,N:3. 39%。氧和氟分別被確定為18. 2%和2. 09%。不過，氟的分析值波動范圍大， 且氧的分析值可失真為較低值。圖8至圖10中顯示絡合物C的其他物理性能。絡合物C易于溶于水、生理鹽水、甲醇、乙醇、DMS0和吐溫80中。它不溶于醚和氯 仿中。它在室溫下在干燥的空氣中是穩定的。使用下列程序確定在例1、例2和例3中列出的分析值使用FlashEA 1112CHNS/0自動元素分析儀同時分析C、H和N。在相同的儀器上 單獨確定氧值，在該確定過程中，使樣品在高溫且無氧氣存在的條件下分解，且測量生成的 CO。由于生成氧化物，大量銅的存在可造成氧值的失真。對于Cu的確定，可使用硝酸分解樣品，且使用由Perkin Elmer提供的ICP Optima 2100DV發射光譜儀通過發射光譜法確定溶液中的Cu。根據SchrSdinger分解得到的溶液進行電勢滴定，從而確定氯。對于氟的確定，同樣根據SchrSdinger使所述物質分解，且隨后使用由Metrohm 提供的761 Compact IC Autosampler離子色譜儀通過陰離子色譜法對溶液進行分析。每個引述的分析值代表多次測量的平均值。C、N和C1的各個值的偏差平均小于 測量值的3%，H和Cu的偏差平均最高達測量值的4. 5%。F的分析值顯示出明顯的變化， 且難以確定其可靠的變化范圍。M 4絡合物A對細胞凋亡誘導的影響使用溶于DMS0的濃度逐漸增加的絡合物A處理濃度為1 X 105/ml的BJAB細胞 (淋巴瘤細胞系)，且將其在37°C下在5% C02中培育達72小時。在使用碘化丙啶染色之 后，使用流式細胞計量術(FACS分析)檢測DNA片段。K0 (未經處理的細胞懸液)和DMS0 經受等效處理。結果如圖11中所示。可看出，絡合物A引起濃度依賴性細胞凋亡誘導，在 0. lmmol絡合物A的作用下細胞值達到43. 5%。
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Ml絡合物A在初級成淋巴細胞內的體內效應在從ALL病人身上提取成淋巴細胞之后，使用市場上的細胞生長抑制劑和絡合物 A最初隔離并隨后處理該成淋巴細胞。選擇濃度，以使當使用NALM-6白血病細胞系時該濃 度在LC50范圍內不變。此后，將細胞在37°C下在5% C02中培育達60小時，隨后使用碘化 丙啶染色，且使用FACS流式細胞計量術確定數量。結果如圖12中所示。令人驚奇的發現， 在白血病細胞中存在對道諾霉素(daimo)和阿霉素(doxo)具有抗性的細胞凋亡誘導。使 用絡合物A在成淋巴細胞中產生的細胞凋亡誘導效應約為26%，顯著高于傳統的細胞生長 抑制劑阿糖胞苷(ARA-C)、克拉屈濱(Cla)、依托泊苷(Etop)、氟達拉濱(Flu)和伊達比星 (Ida)。#il 6檢測由使用絡合物A產生的凋亡信號級聯的線粒體調停作用在使用不同濃度的絡合物A處理BJAB細胞之后，在進行零對照和溶劑對照的條件 下，細胞在37°C下在5% C02中培育達48小時。圖13顯示使用線粒體特異性染料JC-1染 色得到的測試評估結果、以及對顏色變化的流式細胞計量檢測。人們發現，在30%以上的細 胞中存在由絡合物A誘導的線粒體膜電勢的濃度依賴性變化。Ml絡合物A與阿糖胞苷細胞生長抑制劑的聯合給藥組合制劑顯示出在淋巴瘤細胞(BJAB)中使用傳統的阿糖胞苷細胞生長抑制劑具 有明顯的體外協同效應。在37°C下在5% C02中培育達48小時，且進行零對照和溶劑對 照。在使用碘化丙啶對細胞染色之后，通過流式細胞計量術確定DNA片段。圖14中顯示三 次測量的平均值。可看出，絡合物A與阿糖胞苷具有顯著的協同效應，其細胞凋亡誘導為 +129%。M 8使用絡合物A對小鼠體內腫瘤生長的體內抑制在六只SCID小鼠身上植入人類淋巴瘤細胞(BJAB)。在生成直徑為5mm的腫瘤之 后，使小鼠口服劑量為10mg/kg的懸浮于橄欖油中的絡合物A。對照組由10只只食用橄欖 油的動物組成。在服用絡合物A后觀察到對腫瘤生長的顯著抑制效果。結果如圖15中所不。*表示在Mann-Whitney U測試方面的顯著性(p彡0. 05)。M 9絡合物A對小鼠體內B16黑素瘤的效應通過向右大腿進行皮下注射將黑素瘤B16植入到20只C 57B1系小鼠體內。動物 被分成四組，每組有五只小鼠。小組I中絡合物A的劑量為7mg/kg，溶于DMS0中，以4%生 理鹽水懸浮液的形式通過腹內給藥。在腫瘤植入之后的第3、5、7和9天進行一次給藥。小組II與小組I的給藥方式相同，但使用的劑量為5mg/kg。小組III與小組I的給藥給藥方式相同，但使用的是5mg/kg的苯丙氨酸氮芥氫氯 化物，而不是絡合物A。小組IV未經處理。
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表1中顯示在各個小組中每個腫瘤的平均重量和體積、腫瘤生長抑制、平均有絲 分裂和凋亡指標、以及骨髓有絲分裂指標。表1中清楚顯示出絡合物A具有優良的抗癌效應、以及對骨髓生成具有顯著更低 的抑制效應。表權利要求
1.一種有機銅絡合物，它是通過使丙烯酸銅與有機化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸 性至中性PH條件下反應制得的，該有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸 (溶肉瘤素)、其氫氯化物、N- (2-furanidil) -5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶 (Ieacadin)0
2.根據權利要求1所述的有機銅絡合物，其特征在于所述丙烯酸銅選用醋酸銅(II) 或丙酸銅(II)。
3.根據權利要求1或2所述的有機銅絡合物，其特征在于所述氯仿/甲醇混合物的 比例為1 1至3 1。
4.根據權利要求1至3中的任何一個所述的有機銅絡合物，其特征在于它是一種熔 點% 1470C的銅-溶肉瘤素氫氯化物絡合物，包含15. 0% Cu、37. 3% C、4. 43% H、24. 4% Cl、 6. 74% N、以及氧，且由溶肉瘤素氫氯化物與醋酸銅(II)在pH約為2至3的條件下反應制 得，上述碳、氮和氯的元素分析結果的偏差平均小于3%，且上述氫和銅的元素分析結果的 偏差平均最高達4.5%。
5.根據權利要求1至3中的任何一個所述的有機銅絡合物，其特征在于它是一種熔 點為177°C的銅-溶肉瘤素絡合物，包含9. 2% Cu、45. 3% C、5. 4% H、20. 6% Cl、8. N、以 及0，且由溶肉瘤素與醋酸銅(II)在pH約為6至7的條件下反應制得，上述碳、氮和氯的元 素分析結果的偏差平均小于3%，且上述氫和銅的元素分析結果的偏差平均最高達4. 5%。
6.根據權利要求1至3中的任何一個所述的有機銅絡合物，其特征在于它是一種熔 點為 127°C的銅-替加氟絡合物，包含 26. 8% Cu、18. 16% C、3. 08% Η、25· 3% Cl,3. 39% N、 0和F，且由替加氟與醋酸銅(II)在pH值約為1的條件下反應制得，上述碳、氮和氯的元素 分析結果的偏差平均小于3%，且上述氫和銅的元素分析結果的偏差平均最高達4. 5%。
7.一種藥用組合物，包含至少一種權利要求1至6中的任何一個所述的有機銅絡合物、 以及藥學上可用的助劑和/或輔料。
8.一種組合制劑，包含至少一種權利要求1至6中的任何一個所述的有機銅絡合物、以 及至少一種就其本身而言已知的細胞生長抑制劑、以及藥學上可用的助劑和/或輔料。
9.根據權利要求1至6中的任何一個所述的用于治療腫瘤疾病和/或保護正常組織免 受電離輻射的有機銅絡合物。
10.根據權利要求9所述的用于放射療法的有機銅絡合物。
11.根據權利要求1至6中的任何一個所述的用于惡性細胞體內檢測的有機銅絡合物。
12.根據權利要求8所述的用于治療腫瘤疾病和/或保護正常組織免受電離輻射的藥 用組合物。
13.一種制備有機銅絡合物的方法，其特征在于使丙烯酸銅與有機化合物在氯仿/甲 醇混合物中在酸性至中性PH條件下反應，該有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯 丙氨酸(溶肉瘤素)、其氫氯化物、N-(2-fUranidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳 酰氮丙啶(Ieacadin)。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于使所述丙烯酸銅與所述有機化合物各 自溶于氯仿/甲醇混合物中，該有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶 肉瘤素)、其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶 (Ieacadin)；反應結合后酸化，并至少加熱到50°C，且必要時洗滌并干燥在冷卻之后生成的沉淀物。
15.根據權利要求13或14所述的方法，其特征在于所述氯仿/甲醇混合物的比例為 1 1 至 3 1。
全文摘要
本發明涉及有機銅復合物以及包含該有機銅復合物的藥用組合物。它們尤其可用于治療由過度增生細胞引起的疾病，且可保護正常組織免受電離輻射。它們是通過使丙烯酸銅與有機化合物在氯仿/甲醇混合物中在酸性至中性pH條件下反應制得的，該有機化合物選自4-[雙(2-氯乙)胺]-D，L-苯丙氨酸(溶肉瘤素)、其氫氯化物、N-(2-furanidil)-5-氟尿嘧啶(替加氟)、以及氨基碳酰氮丙啶(leacadin)。
文檔編號C07F1/00GK102007134SQ200980113936
公開日2011年4月6日 申請日期2009年2月20日 優先權日2008年2月22日
發明者瓦列里·塔甘斯基, 阿蘭姆·布羅克普 申請人:柏林夏瑞蒂醫科大學, 瓦列里·塔甘斯基