專利名稱：功能性脂類構造物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于使表達于細胞和多細胞結構表面的功能基團產生質變和量變的 方法，以及在該方法中的應用的功能性脂類構造物。本發明尤其涉及功能性脂類構造物以及它們在診斷和治療應用上的使用，包括血 清診斷法，其中功能性基團為碳水化合物、肽、化學反應基團、結合體或者熒光團。
背景技術：
使表達于脂質體、細胞和多細胞結構表面的功能基團產生質變和量變的能力具有 一系列的診斷和治療應用。功能性基團可以為碳水化合物、肽、化學反應基團(例如馬來酰 亞胺)、結合體(例如生物素)或者熒光團(例如熒光素)。國際申請號PCT/NZ2005/000052(公布號WO 2005/090368)的說明書描述了一種 碳水化合物_脂類構造物的制備，該碳水化合物_脂類構造物用于使表達于細胞和多細胞 結構表面的碳水化合物水平產生質變和量變的方法。描述了該構造物用于制備血液分組和 診斷用質量控制細胞的用途。國際申請號PCT/NZ2006/000245(公布號WO 2007/035116)的說明書描述了另外 一種制備碳水化合物-脂類構造物的方法，其中碳水化合物為透明質酸聚合物。描述了該 構造物修飾胚胎促進其與子宮內膜細胞連接的用途。國際申請號PCT/NZ2007/000256(公布號WO 2008/030115)的說明書描述了熒光 團-脂類構造物的制備。描述了該構造物在熒光標記細胞方法中的用途。使細胞表面表達的肽產生變化的已有技術包括基因調控、膜肽的化學修飾和使用 脂錨例如 GPI (Legler 等(2004)，McHugh 等(1995)，Medof 等(1996)，Metzner 等(2008)， Morandat 等(2OO2)，Premkumar 等(2OOl)，Ronzon 等(2004)，Skountzou 等(2OO7))的“細 胞表面染色”。在這些使內源表達的肽產生變化的方法以外，內源制備的肽可以利用生物素_親 和素結合作用結合到膜脂上。生物素結合到四聚體蛋白親和素，其解離常數(Kd)的數量級 為10_15mOl/L。這種強結合力得以開發于許多實驗室應用中。在這些實驗室應用中，生物素結合于分子例如碳水化合物或者結合于肽。除將肽 耦合到膜脂上外，生物素親和素結合的開發優選于一些隔離和分離的應用中。國際申請號PCT/NZ02/00214(公布號WO 03/039074)的說明書描述了將抗原例如 肽固定到細胞表面的“兩步法”。在該方法中，生物素化糖苷(BioG)與細胞懸浮液在一定的 溫度下接觸一定的時間，足以允許BioG分子通過它們的二酰基脂尾結合到細胞的細胞膜。然后通過使肽接觸修飾細胞，將外源性制備的親和素化肽固定到BioG修飾細胞 的表面。另一種方法為，通過生物素_親和素橋將外源性制備的生物素化肽固定到修飾細 胞的表面。“兩步法”中的任一一種內，固定到修飾細胞表面的親和素化肽的量可以通過調控
11為提供修飾細胞，BioG分子接觸細胞懸浮液時的濃度、時間和溫度來控制。然而，這種方式 的利用受限于BioG在生物可溶介質例如鹽水中的可獲得性和分散性。國際申請號PCT/NZ2005/000052(公布號WO 2005/090368)的說明書描述了 “一步 法”，將碳水化合物抗原固定到細胞表面。“一步法”利用了碳水化合物-脂類構造物，其可 在生物相容性介質內分散并因此用于制備修飾細胞而無損活性。然而，未描述在生物相容 性介質內具有相對分散性的肽_脂類構造物的制備方法和肽上的普通應用方法。肽結合到自組裝的脂類構造物例如脂質體之前，作為獨立組分與磷脂的耦合這方 面，進行的工作相對很少。然而，已有大量的標準技術對肽到脂質體表面的共價耦合進行了 描述。Martin等(1990)評論了使基團包括肽結合到脂質體表面的方法。Blume等(1993)描述了水溶性Glu-血漿酶原耦合到脂質體上的由Kimg和 Redemann (1986)描述過的方法。在溫育活化脂質體懸浮液和Glu-血漿酶原之前，用化學品 E⑶1(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)活化脂質體。得到了一種蛋白-PEG 包覆脂質體，其中Glu-血漿酶原共價結合到二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE) -PEG-COOH的末 端。Haselgrubler等(1995)描述了一種異雙官能團交聯劑，其用于促進免疫脂質體 的制備。該交聯劑由二胺衍生物聚(乙二醇)(PEG，平均分子量為800道爾頓(ISmer))合 成。該交聯劑具有功能基團2-(卩比啶基硫代)丙酰基(PDP)和N-羥基琥珀酸亞胺酯(NHS)。Ishida等(2001)描述了一種帶有聚乙二醇耦合轉鐵蛋白的脂質體的制備方法。 轉鐵蛋白通過DSPE-PEG-C00H的末端羧基殘基結合。該脂質體被認為可用于活性細胞質 內，化學治療試劑或者質粒DNA到靶細胞的靶向定位。Massaguer等(2001)描述了將一種肽序列(GGRGRS)和疏水衍生物結合到化學活 化的脂質體表面的方法。該結合通過N-戊二酰二棕櫚酰磷脂酰膽堿(NGPE)末端的羧基基 團進行。Massaguer等(2001)指出，就體內應用上的可能性而論，無菌和簡單是最重要的 要求，包括額外步驟，基于脂質體表面化學反應的制程，將更加難以在工業級水平放大。肽 序列的疏水衍生物被證實能提供結合到脂質體表面的最佳特性。Chimg等(2004)描述了抗原決定簇對DOPE-PEG結合到細胞膜的屏蔽效果，并詳述 了有關脂類-PEG (n) (s)調節生物細胞反應的可能性，并延續此概念到在PEG鏈末端引入功 能分子。Kato等(2004)描述了一種將超大分子蛋白質錨定到活的哺乳動物細胞膜上的方 法。將親水聚(乙二醇)(PEG80)耦合的二油烯基磷脂酰乙醇胺(DOPE)衍生物用作合成膜 錨。肽通過該合成膜錨的具有氨基反應活性的N-羥基琥珀酰亞胺衍生物結合到PEG基團 末端。PEG80基團促進了合成膜錨在水中的溶解性。如Kato等(2004)所述，如果錨不能 溶于水，需要一個不理想的而且復雜的制程例如脂質體制備和脂質體與細胞膜的融合，將 結合體錨定到細胞膜上。Kato等(2004)還敘述了另一個優點，合成膜錨具有高親水-親脂平衡值(可歸功 于具有多數量氧乙烯單元的PEG間隔臂)，推定沒有細胞溶解活性。無論如何，在使用具有多數量氧乙烯單元的PEG間隔臂的合成膜錨的時候產生了困難首先，結合肽或者其他內源細胞表面肽的表達可能被PEG間隔壁遮蓋。其次，具有 多數量氧乙烯單元的PEG間隔臂可能誘發蛋白質的非特異性吸附(包括部分個體中的抗 體)和/或完全級聯的非特異性活化。Winger等(1996)描述了溴代乙酰化DSPE與硫醇末端化的十肽的結 合物，所述十肽包括了在它的C-末端的一種最小人類凝血酶-受體肽激動劑 (HS-SerPheLeuLeuArgAsn)。Hashimoto等(1986)描述了碘代乙酰化DSPE和硫代化合物的結合物。存在一種需求，即一種制備肽_脂類構造物的常規手段，該構造物通過“一步法”， 在自組裝的脂類構造物例如脂質體上，作為獨立組分結合。該方法應當理想地提供肽_脂 類構造物，其能在生物相容性介質中容易地分散并且自發地結合到細胞和多細胞結構的膜 上。具有這些特性的肽_脂類構造物，除了制備功能化脂質體外，預期在一系列治療 和診斷應用上，尤其是血清診斷上都有效用。本發明的一個目的為提供一種能在生物相容性介質中分散且自發地結合到細胞 和多細胞結構的膜上的功能性_脂類構造物。本發明的一個目的為提供功能性-脂類構造物，其用于制備能在生物相容性介質 中分散且自發地結合到細胞和多細胞結構的膜上的肽_脂類構造物。本發明的一個目的為提供一種能在生物相容性介質中分散且自發地結合到細胞 和多細胞結構的膜上的肽_脂類構造物。這些目的應該與至少給公眾提供一種有用的選擇的目的區分理解。

發明內容
本發明的第一方面為提供一種結構為F-S-L的功能性脂類構造物，其中F為功能 性基團，L為二酰基或者二烴基脂類，S為共價鍵合F到L的隔離臂且包括亞結構
權利要求
一種結構為F S L的功能性脂類構造物，其中F為功能性基團，L為二酰基或者二烴基脂類，S為共價鍵合F到L的隔離臂且包括亞結構其中g為整數1、2或3，M為單價陽離子或者取代基，*為非H。FPA000011.tif
2.如權利要求1所述的功能性脂類構造物，其中所述亞結構為
3.如權利要求2所述的功能性脂類構造物，其中g是整數2且h為整數1、2或4。
4.如權利要求3所述的功能性脂類構造物，其中M為H或CH3。
5.如權利要求1所述的功能性脂類構造物，其中L為二酰基甘油磷脂。
6.如權利要求1所述的功能性脂類構造物，其中L為磷脂酰乙醇胺。
7.如權利要求6所述的功能性脂類構造物，其中所述功能性脂類構造物的結構包括以 下局部結構
8.如權利要求7所述的功能性脂類構造物，其中所述的功能性基團F選自于由碳水化 合物、肽、化學反應性基團、結合物或者熒光團組成的群組。
9.如權利要求8所述的功能性脂類構造物，其結構為
10.如權利要求8所述的功能性脂類構造物，其結構為
11.如權利要求8所述的功能性脂類構造物，其結構為
12.如權利要求8所述的功能性脂類構造物，其結構為
13.如權利要求8所述的功能性脂類構造物，其結構為
14.如權利要求8 13任一項所述的功能性脂類構造物，其中所述的亞結構為
15.—種水溶性的結構為F-S-L的肽-脂類構造物，其中S為通過硫化物鍵鏈接到F的隔離臂，并且包括亞結構
16.如權利要求15所述的肽-脂類構造物，其中所述亞結構為
17.如權利要求16所述的肽-脂類構造物，其中g和h為整數2。
18.如權利要求16所述的肽-脂類構造物，其中M為H或者CH3。
19.如權利要求16所述的肽-脂類構造物，其中L為二酰基甘油磷脂。
20.如權利要求16所述的肽-脂類構造物，其中L為磷脂酰乙醇胺。
21.如權利要求16所述的肽-脂類構造物，其中所述肽-脂類構造物的結構包括以下 局部結構
22.如權利要求21所述的肽-脂類構造物，其中所述肽_脂類構造物結構為
23.如權利要求22所述的肽-脂類構造物，其中所述肽-脂類構造物結構為
24.如權利要求23所述的肽-脂類構造物，其中F為一種肽，其包括一種挑選的促進肽 的溶解度的近末端序列(PTS)。
25.如權利要求24所述的肽-脂類構造物，其中所述肽的PTS選自于下述群組 SerLysLysLysLysGlyAlaAlaAlaAla GlySerGlySerGly0
26.如權利要求22所述的肽_脂類構造物，其中所述的Cys殘基為肽的末端Cys殘基 (Cys)。
27.如權利要求26所述的肽-脂類構造物，其中所述肽的末端序列選自于下述群組GlyLysLysLysLysSerCysAlaAlaAlaAlaCys GlySerGlySerGlyCys CysSerLysLysLysLysGly CysAlaAlaAlaAla CysGlySerGlySerGlyο
28.如權利要求27所述的肽-脂類構造物，其中所述Cys殘基為肽羧基-末端的肽末 端Cys殘基。
29.如權利要求15所述的肽-脂類構造物，其中F為一種肽，其包括一種選自于由血型 糖蛋白A、血型糖蛋白B或者其變種(包括MNS血型系統)組成群組的抗原表位。
30.一種如權利要求26所述的肽-脂類構造物，其中F為一種選自肽清單的肽。
31.如權利要求30所述的肽-脂類構造物，其中F為一種選自下列群組的肽 CysThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluGlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrAlaAlaAlaAlaAlaCys GlnThrAsnAspLysHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys GlnThrAsnAspMetHisLysArgAspThrTyrGlySerGlySerGlyCys SerSerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspThrTyrCys ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluValCys ThrTyrProAlaHisThrAlaAsnGluCys ProAlaHisThrAlaAsnGluValCys SerGlnThrAsnAspLysHisLysArRAspCys。
32.如權利要求15所述的肽-脂類構造物，其中L為一種甘油磷脂，其選自于由1， 2-0-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2_0_ 二硬酯酰-sn-甘油-3-磷脂酰 乙醇胺(DSPE)組成的群組。
33.一種檢測目標血清中反應性抗體的方法，包括以下步驟 血清樣品與細胞懸浮液接觸得到一種混合物，其中，該細胞經過修飾結合了一種如 權利要求9、10或者15 32任一項所述的功能性脂類類構造物(F-S-L)； 上述混合物在一定的溫度下經一定的時間孵育，足以允許凝集；和 確定混合物中細胞的凝集程度； 其中F為碳水化合物或者肽，其包括反應性抗體表位。
34.如權利要求33所述的方法，其中，所述方法還包括以下中間步驟 在確定混合物中細胞的凝集程度之前，加入一種抗目標球蛋白抗體到混合物中。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述的抗目標球蛋白抗體為抗人球蛋白(AHG)抗體。
36.如權利要求33所述的方法，其中，F為肽且該方法還包括以下前置步驟 眷在血清樣品中加入一定量的肽；其中，所述肽的量足以中和非特異性凝集或者確定反應性抗體的特異性。
37.一種如權利要求33所述的方法，其中，所述反應性抗體對選自于由血型糖蛋白A、 血型糖蛋白B或者其變種(包括MNS血型系統)組成的群組的抗原具有反應性。
38.如權利要求33所述的方法，其中所述目標為人類。
39.如權利要求33所述的方法，其中所述細胞為紅血球。
40.制備如權利要求33 39任一項所述肽-脂類構造物的方法，包括以下步驟眷含有Cys殘基的肽與如權利要求11所述的功能性脂類構造物反應。
41.一種使表達于細胞和多細胞結構表面的功能基團產生質變和量變方法，包括以下 步驟 細胞或多細胞結構與如權利要求1 14任一項所述的功能性脂類構造物溶液經一 定的時間在一定的溫度下接觸，足以允許構造物結合細胞或多細胞結構。
42.一種固定一個或者多個細胞或多細胞結構的方法，包括以下步驟 細胞或多細胞結構與如權利要求12所述的構造物溶液經一定的時間在一定的溫度 下接觸，足以允許有效量的構造物結合細胞或多細胞結構，以提供修飾細胞或多細胞結構； 和 修飾細胞或多細胞結構與能可逆地固定到表面的親和素_包被底物接觸。
43.如權利要求42所述的方法，其中所述親和素-包被底物選自于由親和素_包被磁 珠構成的群組。
44.如權利要求42所述的方法，其中所述可逆地固定到表面是通過磁場的應用。
45.如權利要求44所述的方法，包括以下步驟 細胞或多細胞結構與結構如下的構造物的分散體接觸
46.一種促進細胞的第一和第二群體聚集的方法，包括以下步驟 細胞的第一群體與如權利要求12所述的的構造物溶液在一定的溫度下經一定的時 間接觸，足以允許有效量的構造物結合到細胞上，以提供第一群體的修飾細胞； 細胞的第二群體與如權利要求12所述的的構造物溶液在一定的溫度下經一定的時 間接觸，足以允許有效量的構造物結合到細胞上，以提供第一群體的修飾細胞； 任一一種群體的修飾細胞與過量的親和素接觸；和 眷第一群體和第二群體的修飾細胞接觸。
47.如權利要求46所述的方法，還包括以下步驟 細胞的第一群體與結構如下的構造物的溶液接觸
全文摘要
本發明涉及一種方法，用于使表達于細胞和多細胞結構表面的功能基團產生質變和量變，本發明還涉及在該方法中應用的功能性脂類構造物。本發明尤其涉及功能性脂類構造物以及它們在診斷和治療應用上的使用，包括血清診斷法，其中功能性基團為碳水化合物、肽、化學反應性基團、結合體或者熒光團。
文檔編號C07K7/06GK101970460SQ200880119473
公開日2011年2月9日 申請日期2008年10月13日 優先權日2007年10月12日
發明者亞歷山大·鮑里索維奇·圖濟科夫, 伊戈爾·羅季諾夫, 克里斯蒂娜-西蒙娜·溫伯格, 尼喬萊·博溫, 斯蒂芬·邁克爾·亨利 申請人:科德生物工程有限公司