專利名稱：用于固定功能性物質的底物及其制備方法
技術領域：
本發明通常涉及用于固定功能性物質的底物。本發明還涉及制備所述底物的方法。背景分析地或制備地用于研究目的、臨床目的、診斷目的和工業目的的生物和化學檢驗和方法通常需要將功能性物質定位或固定在固體支持物(或底物)上。這種定位通常改善了物質的穩定性和多功能性而不危害其效能和活性，并且能夠重復使用所述物質。例如，當在酶催化的工業加工中使用時，包括諸如酶的生物物質的功能性物質通常固定在惰性支持物上，例如二氧化硅或聚丙烯酰胺凝膠，從而改善其對抗改變PH或溫度條件的穩定性， 并且促進其從反應產物的后續分離。這使固定的酶能夠重新使用并且顯著促進產品純化，這導致更劃算的過程。可以通過物理固定或化學固定實現包括生物物質在內的功能性物質的固定。物理固定的一種形式為物理吸附(物理吸附(physisorption)),其中功能性物質或生物物質通過包封或靜電、疏水或范德華力與底物連接。盡管物理吸附提供了相對簡單的固定方法，其具有對全范圍的功能性物質和/或生物物質的廣泛適用性，但其通常不提供足夠地穩定固定并且易于浸出固定的功能性物質和/或生物物質。固定功能性物質和/或生物物質的更穩定的方法為化學固定，由于化學反應其使功能性物質和/生物物質共價連接至底物。化學固定通常導致功能性物質和/或生物物質的改進的活性、降低的非特異性吸附和較高的穩定性。然而，化學固定通常需要功能性和/或生物物質或底物的化學修飾以促進其有效的結合。為了改善其與功能性物質和/或生物物質的結合，固體支持材料的表面修飾或固體支持物的“預活化”典型地涉及在通常為弱反應性聚合材料的表面上加入反應性化學部分。能夠通過物理方法或化學方法實現表面修飾，所述物理方法例如親和性間隔物的非共價連接，所述化學方法例如戊二醛活化、溴化氰活化、溴乙酰化、重氮化、電離輻射誘導的氧化和化學接枝。然而，親和性間隔物的非共價連接與較差的再現性和/或與底物表面的不穩定連接有關。某些共價連接，最值得注意的是亞胺，較少值得注意的是酯，能在用于酶反應的反應條件下被水解，這導致固定的酶的部分損失以及酶向反應介質的滲入。其中，這樣的問題可以影響基于戊二醛活化和溴乙酰化的固定方法。盡管重氮化、溴化氫活化、電離輻射誘導的氧化和化學接枝產生了比非共價鍵更穩定的共價鍵，但這些方法涉及使用有害的、昂貴的、復雜的和/或苛刻的反應條件。這些方法中的某些還導致固體支持物上的高凈電荷，這導致在生物/化學過程的后續步驟中功能性物質和/或生物物質的不期望的非特異性靜電結合。在使用苛刻的反應條件時遇到的另一常見問題是表面性質的不利修飾，這可以限制功能性物質和/或生物物質的連接，特別是大聚合物質。這能夠導致功能性物質和/或生物物質在底物上的低負載。某些可商購的活性固體支持物遇到的其他問題為低穩定性、明顯的毒性和缺乏生物相容性，這導致短的保存期、難以操作和對醫療用途的有限適用性。這些方法的某些依賴于用環氧硅烷偶合劑對“預活化”支持物進行進一步修飾，以用于親水分子的固定。其他方法依賴于通過使雙環氧環氧乙烷連接物反應來將分子固定于底物，從而制備底物。這些方法中使用的脂肪族連接物導致可用于固定的反應性基團的量降低，生物相容性降低并且再現性降低。亟需提供制備克服或至少改善上述缺點的一個或多個的用于固定功能性物質和生物物質的底物的方法。亟需提供方便的、便宜的、穩健的和可靠的制備用于固定功能性物質和生物物質的底物的方法。還亟需提供穩定的、易于操作的、便宜的、無毒的、生物相容的并且生物可降解的用于固定功能性活性物質和生物活性物質的底物，并且其能夠用于以高裝填密度來固定廣
泛的物質，并具有改進的活性和反應性。概述根據本發明的第一方面，提供了用于固定功能性分子的具有布置在其上的化合物的底物，每一化合物具有的鏈包含化學結合至底物的R部分，所述R部分選自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亞磺酰基、磺酰基和硫代羰基(carbonothioyl)；以及通過含至少一個親核基團的連接物與R部分結合的含環氧化物的部分。在一個實施方案中，底物包含與所述鏈結合的額外的含環氧化物的基團。在另一實施方案中，額外的含環氧化合物的基團的數量選自數量1、2、3、4和5。在一個實施方案中，連接物包含所述額外的親核基團，使額外的含環氧化物的基團通過其與所述鏈結合。這是有利的，因為可用于與功能性分子反應的含環氧化物的基團的密度增加，并且因此可用于固定物質的固定位點的數量也增加。本公開的一個優勢是連接物增加了功能性分子和底物之間的系鏈的長度并且促進了功能性分子與底物的結合。在另一實施方案中，連接物包含雙親核物質。在一個實施方案中，雙親核連接物選自烷基-二胺和烯烴-二胺的至少一種。有利地，二胺連接物可以引入額外的用于環氧活化的位點。不受理論的限制，認為高至五個分子的含環氧化物的化合物(例如，表氯醇)能夠與一個分子的二胺連接物反應。這是有利的，因為例如這允許含環氧化物的化合物密度的增加并由此增加可用于固定功能性分子的固定位點的數量。在另一實施方案中，連接物包含多親核物質。在另一實施方案中，多親核物質可以為多胺，例如腐胺、亞精胺、精胺、尸胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺和四氫糠胺。連接物的胺基的引入還有利地充當固定的物質的內部pH緩沖劑。還有利地，胺基還能夠用作離子交換劑以向固定的物質提供穩定條件。還有利地，胺基是強親核性的，使得第一和第二含環氧化物的化合物的結合比諸如OH基團的其他親核基團更有效。連接物的胺基的強親核性是進一步有利的，因為這允許使用長連接物，同時保持與含環氧化物的化合物的反應性。這是進一步有利的，因為使用更長的連接物允許底物和固定的物質之間的位阻進一步降低。更有利地，與其他連接物相比，諸如己二胺的二胺是較便宜的，并且是可商購的商品材料。己二胺的低成本確保了能夠以較低成本大量生產公開的底物。還有利地，含環氧化物的化合物和己二胺連接物之間形成的烷基-胺鍵在生理學條件下是抗水解的，使得其能夠用于水性系統，例如透析裝置。還有利地，本公開的底物是生物惰性的。根據第二方面，提供了在底物上固定功能性分子的方法，其包括將功能性分子暴露于本公開的底物的步驟。根據第三方面，提供了制備用于在其上固定功能性分子的底物的方法，所述方法包括下列步驟(i)提供與底物表面結合的親電子化合物；(ii)使親電子化合物進行親核取代反應以在其上提供親核基團并由此增加底物表面的親核性；(iii)使親核基團與另一親電子化合物進行親核取代反應以在底物表面上提供親電子基團并由此增加底物的親電子性。所述方法的優勢是與底物的親電子基團連接的延長的間 隔物提供了增加的功能性化合物到親電子基團的可達性，并且同時允許親電子基團對功能性分子的密度和反應性的增加，由此將功能性分子固定在底物上。還有利地，方法的步驟(iii)還提供了功能性分子到親電子基團的增加的可達性以用于在底物上的后續固定。在一個實施方案中，將步驟(ii)和(iii)重復η次以在所述底物上形成η代親電子基團。這是有利的，因為這允許間隔物的延長并且增加親電子基團的密度并由此增加可用于將功能性分子固定于底物的固定位點的數量。還有利地，方法的步驟(iii)允許在連接物和第二親電子化合物之間的較快反應。這導致親電子化合物的降低的水解速率以及非水解的親電子基團到底物上的較高加入。這還是有利的，因為這還允許增加親電子基團在底物上的密度以用于固定功能性分子。方法的另一優勢是相對于底物替換了親電子基團，使得相對于僅具有一個直接結合至底物的親電子化合物的底物，功能性分子被固定在其上的能力增加。還有利地，這種相對的替換還允許功能性分子到親電子基團的增加的可達性，從而用于在底物上的后續固定。根據第四方面，提供了用于透析裝置的吸附劑盒，所述吸附劑盒包含本文所述的底物以用于固定尿素酶。根據第五方面，提供了透析方法，其包括下列步驟將含尿素的透析液暴露于本文所述的底物，并且從所述底物移除透析液。根據第六方面，提供了用于透析裝置的透析器，所述透析器包括本文所述的底物以用于固定尿素酶。因此，尿素酶可以被固定在透析膜上，例如包含在透析器內的醋酸纖維素膜過濾器。根據第六方面，提供了修飾透析膜以在其上固定功能性分子的方法，所述方法包括下列步驟 (i)將親電子化合物結合于膜表面；(ii)使親電子化合物進行親核取代反應以在其上提供親核基團并且由此增加膜表面的親核性；以及(iii)使親核基團與另一親電子化合物進行親核取代反應以在膜表面上提供親電子基團并且由此增加膜表面的親電子性以用于在其上固定功能性分子。在一個實施方案中，所述膜是醋酸纖維素膜。有利地，所述方法能夠用于修飾透析器的現成的透析膜，例如醋酸纖維素膜。當用于透析器時，這種修飾步驟使透析膜的表面具有在其上固定功能性分子、例如透析液酶的增加的能力。根據第八方面，提供了本文所述的底物在透析裝置中的用途。在一個實施方案中，提供了制備用于在其上固定功能性物質的底物的方法，所述方法包括下述步驟將第一親電子化合物化學結合至底物；以及將第二親電子化合物化學結合至已與底物結合的第一親電子化合物，其中當結合至所述第一親電子化合物時，所述第二親電子化合物被設定為固定其上的功能性物質。有利地，選擇第一和第二親電子化合物以互相替換，使得相對于僅具有一個結合至底物的親電子化合物的底物，功能性物質被固定在其上的能力增加。更有利地，選擇第一和第二親電子化合物以互相替換，使得第二親電子體附近的位阻效應降低或最小化，從而增加功能性物質與所用第二親電子化合物的結合。更有利地，第一和/或第二親電子化合物可以為有效將弱親核底物轉化為強親電子底物的二親電子體。這構成了底物的極性和反應性的變化。 更有利地，與由已知方法制備的底物相比，所述方法是制備與在其上固定的功能性物質具有較高反應性的底物的簡單且劃算的方式。更有利地，第二親電子化合物能夠穩定地結合至功能性物質，其包括諸如酶的生物物質。甚至更有利地，第二親電子化合物提供了用于功能性物質的連接位點，其位于離底物的適當距離以使位阻降低。在一個實施方案中，每克底物中親電子基團的密度為約O. lmmol/g至約lmmol/g。這反過來降低了固定功能性物質期間的障礙，并且允許功能性物質容易通過第二含環氧化物的化合物而固定在底物上。這還增加了結合物質(酶)的可達性和結構柔性，由此增加其活性。公開的方法還能夠制備能夠固定手性配體、親和性配體和/或離子交換顆粒的底物。在一個實施方案中，第一和第二親電子化合物為含環氧化物的化合物。在一個實施方案中，公開的方法包括使用連接物將第二含環氧化物的化合物結合至第一含環氧化物的化合物的步驟。這增加了活性環氧乙烷位點和底物之間的系鏈長度，并且促進了功能性物質與環氧乙烷位點的結合。這還增加了可達性，并由此增加了諸如酶的結合物質的活性。有利地，連接物可以包含額外的官能團以將期望的化學性質給予底物。例如，連接物可以包含具有緩沖性質的胺基，當將底物用于諸如透析裝置的應用時，其可以為有利的。連接物還可以包含能夠用作抗氧化劑或金屬清除劑的基團，其補充了底物在某些應用中的功能。更有利地，連接物還可以提供增加的位點以用于結合第二親電子化合物和/或后續含環氧化物的化合物。實際上，連接物可以增加結合至底物的含環氧化物的化合物的數量，其反過來增加固定功能性物質的可能性和強度。連接物還可以為中性和惰性的，其未消極地影響與其連接的功能性物質或生物物質的功能或生物性質。在一個實施方案中，連接物不包含環氧化物基團。功能連接物還可以包含親核基團。有利地，親核基團為反應性的并且能夠化學結合至親電子(含環氧化物)的化合物。在一個實施方案中，功能性連接物為雙親核連接物。兩個親核基團的存在使連接物結合至第一和第二含環氧化物的化合物二者，形成兩個含環氧化物的化合物之間的橋。在一個實施方案中，雙親核連接物的至少一個親核體選自NH、NR、ΝΗ0, NR0, O、S、Se、COO、CONH、C0NR、 CSS、COS、CONHO, CONRO, CONHNH、CONRNH、CONR1NR2, CNO、Ph 和 PR，其中 R、R1 和 R2 獨立地選自氫、任選取代的烷基、任選取代的烯基、任選取代的炔基、任選取代的芳基和任選取代的
雜芳基。雙親核連接物也可以具有通式(I)
權利要求
1.用于固定功能性分子的具有在其上布置的化合物的底物，每一化合物具有鏈，所述鏈包含 與所述底物化學結合的R部分，所述R部分選自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亞磺酰基、磺酰基和硫代羰基；以及 通過含至少一個親核基團的連接物與所述R部分結合的含環氧化物的部分。
2.如權利要求I所述的底物，其中所述R部分進一步選自胺、酰胺、脲、尿素和胍。
3.如權利要求I或2所述的底物，其包含與所述鏈結合的額外的含環氧化物的基團。
4.如權利要求3所述的底物，其中所述額外的含環氧化物的基團的數量選自1、2、3、4和5。
5.如權利要求3或4所述的底物，其中所述額外的含環氧化物的基團的至少一個通過所述連接物的親核基團與所述鏈結合。
6.如權利要求4或5所述的底物，其中所述連接物包含額外的親核基團，所述額外的含環氧化物的基團通過其與所述鏈結合。
7.如權利要求6所述的底物，其中所述額外的含環氧化物的基團通過與所述連接物的額外的親核基團結合而從所述鏈分枝。
8.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其中所述連接物的親核基團為胺。
9.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其中所述連接物選自飽和和不飽和的脂肪族和芳香族的胺、二胺和三胺。
10.如權利要求9所述的底物，其中所述胺的脂肪族基團為烷基。
11.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其中所述連接物包含環氧化物基團。
12.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其中所述連接物包含雙親核物質和多親核物質中的至少一種。
13.如權利要求12所述的底物，其中所述連接物選自烷基二胺和烯烴二胺中的至少一種。
14.如權利要求13所述的底物，其中所述連接物選自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺中的至少一種。
15.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其中通過表鹵代醇與所述連接物的親核基團的反應得到所述含環氧化物的化合物。
16.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其中所述底物包括聚合物。
17.如權利要求16所述的底物，其中所述聚合物為生物相容性聚合物。
18.如權利要求17所述的底物，其中所述生物相容性聚合物選自聚酯底物、聚酰胺底物、聚丙烯酸酯底物和基于多糖的底物。
19.如權利要求17所述的底物，其中所述基于多糖的底物選自棉絨、棉漿、棉織物、纖維素纖維、纖維素珠、纖維素粉末、微晶纖維素、纖維素膜、人造絲、玻璃紙、醋酸纖維素、醋酸纖維素膜、殼聚糖、殼質、葡聚糖衍生物和瓊脂糖衍生物。
20.如權利要求16所述的底物，其中所述聚合物為生物聚合物。
21.如前述權利要求中任一權利要求所述的底物，其還包括在所述底物上布置的涂層，所述涂層包括為穩定所述功能性分子而選擇的穩定添加劑的基本均勻的混合物。
22.如權利要求21所述的底物，其中所述穩定添加劑選自糖、有機酸、氨基酸、糖酸和硫醇。
23.在底物上固定功能性分子的方法，其包括將所述功能性分子暴露于權利要求I至22中任一權利要求所述的底物的步驟。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述功能性分子選自親和性配體、螯合劑、催化齊U、離子交換劑、染料、指示劑。
25.如權利要求23或24所述的方法，其中所述功能性分子為手性的。
26.如權利要求24所述的方法，其中所述功能性分子為生物分子。
27.如權利要求26所述的方法，其中所述生物分子為酶。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述酶選自尿素酶、尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、過氧化氫酶、酰基轉移酶、過氧化氫酶、酯酶、青霉素酰胺酶、 蛋白酶-K。
29.如權利要求23至28中任一權利要求所述的方法，其還包括將穩定添加劑的基本均勻的混合物涂覆于所述底物表面的步驟，其中選擇所述添加劑以穩定所述功能性分子。
30.如權利要求29所述的方法，其中向所述底物上涂覆所述添加劑的基本均勻的混合物的步驟包括蒸發所述添加劑的溶液的溶劑。
31.如權利要求29或30所述的方法，其中所述穩定添加劑選自糖、有機酸、氨基酸、糖酸和硫醇。
32.制備用于在其上固定功能性分子的底物的方法，所述方法包括下列步驟 (i)提供與所述底物表面結合的親電子化合物； ( )使所述親電子化合物進行親核取代反應以在其上提供親核基團，并由此增加所述底物表面的親核性； (iii)使親核基團與另一親電子化合物進行親核取代反應以在所述底物表面上提供親電子基團，并由此增加所述底物的親電子性。
33.如權利要求32所述的方法，其中將步驟(ii)和(iii)重復η次以在所述底物上形成η代親電子基團。
34.如權利要求32或33所述的方法，其中所述提供與所述底物表面結合的親電子化合物的步驟包括將第一親電子化合物化學地結合于所述底物。
35.如權利要求34所述的方法，其中所述步驟(ii)包括使親核體與所述第一親電子化合物反應的步驟。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述步驟(iii)包括將第二親電子化合物化學地結合于所述親核體。
37.如權利要求32至36中任一權利要所述的方法，其中所述親電子化合物為含環氧化物的化合物。
38.如權利要求37所述的方法，其中所述含環氧化物的化合物為表鹵代醇。
39.如權利要求32至38中任一權利要所述的方法，其中所述親核體為雙親核體。
40.如權利要求39所述的方法，其中所述親核體包括胺。
41.如權利要求40所述的方法，其中所述胺選自飽和和不飽和的脂肪族或芳香族的胺和多胺。
42.如權利要求41所述的方法，其中所述胺和多胺的脂肪族基團選自烷基。
43.如權利要求42所述的方法，其中所述多胺選自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺中的至少一種。
44.如權利要求32至43中任一權利要所述的方法，其中所述底物包括聚合物。
45.如權利要求44所述的方法，其中所述聚合物為生物相容性聚合物。
46.如權利要求45所述的方法，其中所述生物相容性聚合物選自聚酯底物、聚酰胺底物、聚丙烯酸酯底物和基于多糖的底物。
47.如權利要求46所述的方法，其中所述基于多糖的底物選自棉絨、棉漿、棉織物、纖維素纖維、纖維素珠、纖維素粉末、微晶纖維素、纖維素膜、人造絲、玻璃紙、醋酸纖維素、醋酸纖維素膜、殼聚糖、殼質、葡聚糖衍生物和瓊脂糖衍生物。
48.如權利要求47所述的方法，其中所述聚合物為生物聚合物。
49.如權利要求33至49中任一權利要所述的方法，其中所述功能性分子選自親和性配體、螯合劑、催化劑、離子交換劑、染料和指示劑。
50.如權利要求49所述的方法，其中所述功能性分子為手性的。
51.如權利要求49所述的方法，其中所述功能性分子為生物分子。
52.如權利要求51所述的方法，其中所述生物分子為酶。
53.如權利要求52所述的方法，其中所述酶選自尿素酶、尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、過氧化氫酶、酰基轉移酶、過氧化氫酶、酯酶、青霉素酰胺酶、蛋白酶-K。
54.如權利要求32至53中任一權利要所述的方法，其還包括將穩定添加劑的基本均勻的混合物涂覆于所述底物表面的步驟，其中選擇所述穩定添加劑以穩定所述功能性分子。
55.如權利要求54所述的方法，其中所述向所述底物上涂覆所述添加劑的基本均勻的混合物的步驟包括蒸發所述添加劑的溶液的溶劑。
56.如權利要求54或55所述的方法，其中所述穩定添加劑選自糖、有機酸、氨基酸、糖酸和硫醇。
57.用于透析裝置的吸附劑盒，所述吸附劑盒包括用于固定尿素酶的權利要求I至23中任一權利要求所述的底物。
58.用于透析裝置的透析儀，所述透析儀包括用于固定尿素酶的權利要求I至22中任一權利要求所述的底物。
59.透析方法，其包括下列步驟 將含尿素的透析液暴露于權利要求I至22中任一權利要求所述的底物，以及 從所述底物除去所述透析液。
60.權利要求I至22中任一權利要求所述的底物在透析裝置中的用途。
61.修飾用于在其上固定功能性分子的透析膜的方法，所述方法包括下列步驟 (iv)將親電子化合物結合于所述膜表面； (ν)使所述親電子化合物進行親核取代反應以在其上提供親核基團，并由此增加所述膜表面的親核性；以及 (vi)使所述親核基團與另一親電子化合物進行親核取代反應以在所述膜表面上提供親電子基團，并由此增加用于在其上固定功能性分子的所述膜表面的親電子性。
62.如權利要求61所述的方法，其中所述膜為醋酸纖維素膜。
全文摘要
用于固定功能性分子的具有在其上布置的化合物的底物，每一化合物具有鏈，所述鏈包含與底物化學結合的R部分，所述R部分選自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亞磺酰基、磺酰基和硫代羰基；以及通過包含至少一個親核基團的連接物與R部分結合的含環氧化物的部分。還公開了制備所述底物的方法和所述底物的用途。
文檔編號B01D61/24GK102858437SQ201180015592
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月18日 優先權日2010年2月19日
發明者克里斯蒂安·格特·布魯謝爾, 王艷梅 申請人:淡馬錫理工學院